Immobilisation des individus vivants Caenorhabditis elegans en utilisant une puce de microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-mince avec rétention d’eau
Summary
Une série de méthodes d’immobilisation a été créée pour permettre l’irradiation ciblée des vivants Caenorhabditis elegans individus utilisant un microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-thin récemment développés puce avec rétention d’eau. Cette nouvelle immobilisation sur puce est aussi convenable pour l’imagerie des observations. Le traitement détaillé et exemples d’application de la puce sont expliqués.
Abstract
Rayonnement est employé couramment pour des applications biologiques et pour l’élevage de faisceau d’ions, et parmi ces méthodes, l’irradiation microfaisceaux représente un puissant moyen d’identifier les sites sensible dans les organismes vivants. Cet article décrit une série de méthodes d’immobilisation sur puce développées pour l’irradiation de microfaisceaux ciblé des individus vivants de Caenorhabditis elegans. Notamment, le traitement des puces microfluidiques polydiméthylsiloxane (PDMS) que nous avons développés précédemment pour immobiliser c. elegans individus sans avoir besoin d’anesthésie est expliquée en détail. Cette puce, dénommée une feuille de ver, est résiliente pour permettre les canaux microfluidiques à décompresser, et l’élasticité permet aux animaux d’être enveloppés doucement. En outre, en raison de la capacité d’adsorption indépendant du PDMS, animaux peut être scellé dans les canaux en couvrant la surface de la feuille de ver avec un film mince couverture, dans lequel les animaux n’est pas poussé dans les canaux pour enceinte. En tournant le couvercle du film plus, nous pouvons facilement recueillir les animaux. En outre, la feuille de ver montre la rétention d’eau et permet aux individus de c. elegans de faire l’objet d’une observation microscopique pendant de longues périodes dans des conditions live. En outre, la feuille est seulement 300 µm d’épaisseur, ce qui permet des ions lourds tels que les ions de carbone pour passer à travers la feuille renfermant les animaux, permettant ainsi à détecter les particules d’ion et la dose de rayonnement appliquée à mesurer avec précision. Parce que les films de couverture utilisé pour enfermant les animaux est très importante pour l’immobilisation à long terme avec succès, nous avons procédé la sélection des films adaptés de la couverture et a montré un recommandée chez certains films. Comme un exemple d’application de la puce, nous avons introduit l’observation d’imagerie des activités musculaires des animaux entourant le canal microfluidique de la feuille de ver, ainsi que l’irradiation de microfaisceaux. Ces exemples indiquent que les feuilles de ver ont considérablement élargi les possibilités d’expériences biologiques.
Introduction
Rayonnement, y compris les rayons x, rayons gamma et faisceau d’ions lourds, est employé couramment pour des applications biologiques telles que dans le diagnostic du cancer et le traitement et à la reproduction de faisceau d’ions. Nombreuses études et développements techniques se concentrent actuellement sur les effets des radiations1,2,3. Irradiation par Microfaisceaux est un moyen efficace d’identifier les sites sensible dans la vie des organismes4. Takasaki Advanced rayonnement recherche Institut des instituts nationaux pour Quantum et radiologiques Science et technologie (TVQ-Takasaki) a mis au point une technologie pour irradier les cellules individuelles sous observation microscopique à l’aide d’ions lourds micromadriers5et a établi des méthodes pour permettre l’irradiation microfaisceaux ciblé de plusieurs animaux de modèle, tels que le nématode Caenorhabditis elegans4,6, vers à soie7et Oryzias latipes (Japanese medaka)8. Irradiation de microfaisceaux ciblée du nématode c. elegans permet la précipitation efficace des régions spécifiques, tels que l’anneau nerveux dans la région céphalique, contribuant ainsi à identifier les rôles de ces systèmes dans des processus comme la locomotion.
Une méthode pour l’immobilisation sur puce de c. elegans individus sans la nécessité d’une anesthésie a été développée pour permettre à microfaisceaux irradiation4. En outre, pour améliorer les puces microfluidiques utilisés dans la précédente étude4, nous avons développé récemment mouillable, ion-pénétrable, polydiméthylsiloxane (PDMS) puces microfluidiques, appelées feuilles de ver (voir Table des matières), pour immobilisation de c. elegans personnes9. Il s’agit de feuilles souples ultra minces (épaisseur = 300 µm ; largeur = 15 mm ; longueur = 15 mm) avec plusieurs des canaux microfluidiques droites (20 ou 25) (profondeur = 70 µm ; largeur = 60 µm ou 50 µm ; longueur = 8 mm) à la surface (Figure 1A-D). Les canaux microfluidiques sont ouvertes et que plusieurs animaux puissent être enfermés en eux simultanément (Figure 1E). Les feuilles sont résilients pour permettre les canaux microfluidiques être augmenté (de ~ 10 %, Figure 1F), et l’élasticité permet aux animaux d’être enveloppés doucement. En outre, en raison de la capacité d’adsorption indépendant du PDMS, animaux peut être scellé dans les canaux en couvrant la surface de la feuille de ver avec un film mince couverture, dans lequel les animaux n’est pas poussé dans les canaux pour enceinte. En tournant le couvercle du film plus, nous pouvons facilement recueillir les animaux.
Les canaux ne pas blesser les vers quand ils sont être enfermés ou lorsqu’ils sont recueillis. En outre, les feuilles sont fabriqués à partir de PDMS, qui est essentiellement hydrophobe, mais la rétention d’eau peut être réalisée en conférant une hydrophilicité à la matière. La rétention d’eau et l’épaisseur sont des caractéristiques favorables des feuilles de ver. La capacité de rétention d’eau, empêche la déshydratation des animaux après immobilisation prolongée et permet des observations à long terme à réaliser.
En outre, comme décrit plus haut9, les feuilles sont seulement 300 µm d’épaisseur, permettant de traverser la feuille contenant les animaux des ions lourds tels que les ions de carbone (avec une fourchette d’environ 1 mm dans l’eau). Ceci permet les particules d’ions pour être détectée et la dose de rayonnement appliquée à mesurer avec précision. En outre, les feuilles de ver peuvent être réutilisés et sont donc économiques. Avec la méthode d’injection classiques, les animaux inclus sont parfois morts et ils ne peuvent être pris hors de la manche ; leurs œufs peuvent aussi obstruer les canaux. Cela rend la puce inutilisable. Puces sont donc fondamentalement jetables et la rentabilité ratio est pauvre.
Dans le présent document, nous décrivons en détail une série de méthodes pour l’immobilisation sur puce de direct c. elegans particuliers en utilisant des feuilles de ver. Par le biais de tests de locomotion des animaux 3 h après l’immobilisation sur puce, nous avons évalué le film de protection adapté. En outre, nous avons montré les exemples d’immobilisation sur puce pour les observations d’imagerie et irradiation microfaisceaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immobilisation sur puce de c. elegans dans des conditions live à l’aide d’une puce de microfluidique PDMS mouillable permet l’irradiation microfaisceaux ciblée efficace de plusieurs animaux. La facilité de manutention et de fonctionnalités pour éviter le dessèchement font de ce système pour des applications non seulement dans l’irradiation des microfaisceaux, mais aussi dans plusieurs essais comportements. Ces feuilles de ver ont déjà été commercialisés et peuvent être facilement obtenus. Pu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Dr Atsushi Higashitani pour aimables conseils concernant le traitement de c. elegans et DRS Yuya Hattori, Yuichiro Yokota et Yasuhiko Kobayashi pour discussions précieuses. Les auteurs tiennent à remercier le centre phytogénétique Caenorhabditis pour la fourniture de souches de c. elegans et e. coli. Nous remercions l’équipe du cyclotron de TIARA à Takasaki-TVQ pour leur aimable collaboration avec les expériences d’irradiation. Nous remercions le Dr Susan Furness pour l’édition d’un projet de ce manuscrit. Cette étude a été financée en partie par KAKENHI (Grant numéros JP15K11921 et JP18K18839) de la JSPS à M.S.
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Referências
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