Imobilização de indivíduos ao vivo Caenorhabditis elegans , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água
Summary
Estabeleceu-se uma série de métodos de imobilização para permitir a irradiação de alvo de viver elegans de Caenorhabditis indivíduos usando um polidimetilsiloxano ultra-fino recentemente desenvolvidos microfluidic chip com retenção de água. Este romance imobilização no chip também é adequada para imagens observações. O tratamento detalhado e exemplos de aplicação do chip são explicados.
Abstract
Radiação é amplamente utilizada para aplicações biológicas e para reprodução de feixes de iões, e entre esses métodos, irradiação microbeam representa um poderoso meio de identificar sites radiosensitive em organismos vivos. Este artigo descreve uma série de métodos de imobilização no chip desenvolvido para a irradiação do alvo microbeam dos indivíduos ao vivo de Caenorhabditis elegans. Notavelmente, o tratamento dos chips microfluídicos polydimethylsiloxane (PDMS) que desenvolvemos anteriormente para imobilizar a indivíduos de c. elegans , sem necessidade de anestesia é explicada em detalhes. Este chip, referido como uma folha de verme, é resistente para permitir que os canais microfluídicos ser expandido, e a elasticidade permite que os animais ser envolto suavemente. Também, devido a capacidade de adsorção independente do PDMS, animais podem ser selados nos canais, cobrindo a superfície da folha com um filme de capa fina, em que os animais não são empurrados para os canais para o compartimento de verme. Girando a tampa filme sobre, você pode facilmente acumular os animais. Além disso, a folha do verme mostra a retenção de água e permite que os indivíduos de c. elegans ser submetido a observação microscópica por longos períodos em condições ao vivo. Além disso, a folha é apenas 300 µm de espessura, permitindo íons pesados tais como íons de carbono para passar através da folha de delimitador dos animais, permitindo assim que as partículas de iões ser detectado e a dose de radiação aplicada para ser medido com precisão. Porque a seleção dos filmes capa usada para colocar os animais é muito importante para a imobilização a longo prazo bem sucedida, nós realizou a seleção dos filmes tampa apropriada e mostrou um recomendado entre alguns filmes. Como um exemplo de aplicação do chip, introduzimos a observação de imagens das atividades musculares de animais encerram o canal microfluidic da folha de minhoca, bem como a irradiação microbeam. Estes exemplos indicam que os lençóis de verme tem ampliadas as possibilidades de experimentos biológicos.
Introduction
Radiação, incluindo raios x, raios gama e o feixe de iões pesados, é amplamente utilizada para aplicações biológicas, tais como no tratamento e diagnóstico de câncer e para a reprodução de feixes de iões. Numerosos estudos e desenvolvimentos técnicos atualmente estão focando os efeitos da radiação1,2,3. Microbeam irradiação é um poderoso meio de identificar sites radiosensitive em vida organismos4. Takasaki avançado radiação pesquisa Instituto de institutos nacionais de Quantum e radiológica de ciência e tecnologia (QST-Takasaki) tem vindo a desenvolver uma tecnologia para a irradiação de células individuais, sob observação microscópica usando pesado-íon microbeams5e estabeleceu-se métodos para habilitar o alvo microbeam irradiação de vários animais de modelo, como o nematódeo Caenorhabditis elegans,4,6, bichos da seda7e Oryzias latipes (medaka japonês)8. Microbeam alvo irradiação do nemátodo c. elegans permite o nocaute eficaz de regiões específicas, tais como o anel de nervo na região da cabeça, ajudando assim a identificar as funções destes sistemas em processos como a locomoção.
Um método para a em-microplaqueta imobilização de indivíduos de c. elegans , sem necessidade de anestesia foi desenvolvido para permitir a irradiação de microbeam4. Além disso, para melhorar microfluidic fichas utilizadas no estudo anterior4, recentemente desenvolvemos fichas de microfluidic molháveis, íon-penetrável, polidimetilsiloxano (PDMS), conhecidas como worm folhas (ver Tabela de materiais), para imobilização de indivíduos de c. elegans 9. Estes são compostos por folhas macias ultra-fino (espessura = 300 µm; Largura = 15 mm; comprimento = 15 mm) com múltiplos canais de microfluidic reta (20 ou 25) (profundidade = 70 µm; Largura = 60 µm ou 50 µm; comprimento = 8 mm) na superfície (Figura 1A-D). Os canais microfluídicos são abertos e permitem que vários animais ser incluído entre eles simultaneamente (Figura 1E). As folhas são flexíveis para permitir que os canais microfluídicos ser expandido (por ~ 10%, Figura 1,F), e a elasticidade permite que os animais ser envolto suavemente. Também, devido a capacidade de adsorção independente do PDMS, animais podem ser selados nos canais, cobrindo a superfície da folha com um filme de capa fina, em que os animais não são empurrados para os canais para o compartimento de verme. Girando a tampa filme sobre, você pode facilmente acumular os animais.
Os canais não machuque os vermes quando eles estão sendo fechados ou quando eles são coletados. Além disso, as folhas são feitas de PDMS, que é essencialmente hidrofóbicas, mas retenção de água pode ser conseguida transmitir Hidrofilia ao material. A retenção de água e a espessura são características favoráveis das folhas do worm. A capacidade de retenção de água impede a desidratação dos animais após a imobilização prolongada e permite que a longo prazo observações a efectuar.
Além disso, conforme descrito anteriormente,9, as folhas são apenas 300 µm de espessura, permitindo íons pesados tais como íons de carbono (com um intervalo de cerca de 1 mm de água) para passar através da folha, juntando os animais. Isso permite que as partículas de iões para ser detectado e a dose de radiação aplicada para ser medido com precisão. Além disso, as folhas do worm podem ser reutilizadas e, portanto, são econômicas. Com o método de injeção convencional, os animais fechados às vezes estão mortos e que não pode ser tomado fora do canal; seus ovos também podem entupir os canais. Isso torna o chip inutilizável. Chips são, portanto, basicamente descartável e o custo-benefício relação é pobre.
O presente trabalho, descrevemos detalhadamente uma série de métodos para a imobilização em-microplaqueta ao vivo c. elegans indivíduos usando folhas de verme. Através de ensaios de locomoção dos animais 3 h após a imobilização em-microplaqueta, avaliamos o filme de cobertura adequado. Além disso, mostramos exemplos de imobilização em-microplaqueta para observações de imagens e microbeam irradiação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Imobilização no chip de c. elegans sob condições ao vivo usando um pó molhável PDMS microfluidic chip permite a irradiação de eficiente microbeam alvo de vários animais. A facilidade de manipulação e recursos para evitar a secagem fazer este sistema apropriado para aplicações não só na irradiação microbeam, mas também em vários ensaios comportamentais. Estas folhas de verme já tem sido comercializadas e podem ser facilmente obtidas. Fichas de microfluidic convencionais, tais como fichas olfat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Dr. Atsushi Higashitani Conselho em relação ao tratamento de c. elegans e DRS Yuya Hattori, Yuichiro Yokota e Yasuhiko Kobayashi para discussões valiosas. Os autores agradecer o centro de genética Caenorhabditis pelo fornecimento de cepas de c. elegans e e. coli. Agradecemos a tripulação do ciclotron de TIARA no QST-Takasaki por sua gentil assistência com os experimentos de irradiação. Agradecemos o Dr. Susan Furness para edição de um projecto deste manuscrito. Este estudo foi suportado em parte pela KAKENHI (Grant números JP15K11921 e JP18K18839) de JSPS para M.S.
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Referências
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