Bir Ultra-thin Polydimethylsiloxane mikrosıvısal çip su tutma ile kullanarak canlı Caenorhabditis elegans bireylerin immobilizasyon
Summary
İmmobilizasyon yöntemleri bir dizi canlı Caenorhabditis elegans hedeflenen ışınlama izin vermek için kurulmuş olup son zamanlarda gelişmiş Ultra-ince polydimethylsiloxane mikrosıvısal kullanarak bireyler çip ile su tutma. Bu roman üstünde-küçük parça immobilizasyon gözlemler görüntüleme için yeterlidir. Detaylı tedavi ve çipin uygulama örnekleri açıklanmıştır.
Abstract
Radyasyon iyon-ışın ıslah ve biyolojik uygulamalar için yaygın olarak kullanılır ve bu yöntemler arasında microbeam ışınlama canlı organizmalar radiosensitive siteleri tanımlama için güçlü bir yol gösterir. Bu kağıt üstünde-küçük parça immobilizasyon yöntemleri Caenorhabditis eleganscanlı bireylerin hedeflenen microbeam ışınlama için geliştirilen bir dizi açıklar. Özellikle, daha önce anestezi ayrıntılı olarak açıklamak için gerek kalmadan C. elegans bireyler hareketsiz için geliştirdiğimiz polydimethylsiloxane (PDMS) mikrosıvısal çip tedavisinde. Bu çip bir solucan sayfası anılacaktır, genişletilecek mikrosıvısal kanalları izin esnektir ve hayvan yavaşça saran için esneklik sağlar. Ayrıca, PDMS öz adsorpsiyon kapasitesi sayesinde hayvanlar kanallarında hangi hayvanlar koymak gibi muhafaza için itilir değil bir ince kapak film ile solucan levha yüzeyini örten tarafından mühürlenmiş. Kapak film üzerinde dönüm tarafından kolayca hayvanlar toplayabilirsiniz. Ayrıca, solucan sac su tutma gösterir ve C. elegans kişilerin canlı koşullar altında uzun süre mikroskobik gözlem tabi olanak sağlar. Buna ek olarak, sayfayı sadece 300 µm kalınlığında, böylece iyon parçacıkları tespit edilmesini sağlayan hayvanlar, ekte sayfa boyunca geçmek için karbon iyonlar gibi ağır iyonları ve doğru bir şekilde ölçülecek uygulanan radyasyon dozu izin olduğunu. Seçim hayvanları kapsayan için kullanılan kapak filmlerin başarılı uzun süreli immobilizasyon için çok önemli olduğu için biz uygun kapak filmlerin seçimi yapılan ve önerilen bir bazı filmler arasında gösterdi. Çip uygulama örneği, hayvanların solucan sayfası, hem de microbeam ışınlama mikrosıvısal kanal çevreleyen kas faaliyetleri görüntüleme gözlem tanıttı. Bu örnekler solucan sayfaları biyolojik deneyler için olanaklar büyük ölçüde genişlettik gösterir.
Introduction
Radyasyon, x-ışınları, gama ışınları ve ağır iyon demeti, dahil olmak üzere yaygın kanser tanı ve tedavi gibi biyolojik uygulamalar için ve iyon-ışın ıslahı için kullanılır. Şu anda çok sayıda çalışmalar ve teknik gelişmeler radyasyon1,2,3etkileri üzerinde duruluyor. Microbeam ışınlama yaşayan radiosensitive siteleri tanımlama güçlü bir demektir organizmalar4. Takasaki gelişmiş radyasyon Araştırma Enstitüsü, ulusal kurumları kuantum ve radyolojik bilimi ve teknolojisi (QST-Takasaki) ışınlatayım ağır iyon kullanarak mikroskobik gözlem altında tek tek hücreler için bir teknoloji geliştirme microbeams5ve hedeflenen microbeam ışınlama Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans4,6, silkworms7ve Oryzias gibi birkaç modeli hayvanların etkinleştirmek için yöntemleri kurmuştur latipes (Japon medaka)8. Nematot C. elegans hedeflenen microbeam ışınlama böylece hareket gibi süreçlerde bu sistemlerin rolleri tanımlamak için yardımcı sinir ringde baş bölge gibi belirli bölgelerde etkili nakavt sağlar.
Anestezi için gerek kalmadan C. elegans bireylerin üstünde-küçük parça immobilizasyon için bir yöntem microbeam ışınlama4için izin vermek için geliştirilmiştir. Ayrıca, önceki çalışma4‘ te kullanılan mikrosıvısal çip artırmak için biz son zamanlarda ıslanabilir, iyon-geçirgen, polydimethylsiloxane (PDMS) mikrosıvısal cips, solucan sayfaları ( Tablo malzemelerigörmek) için adlandırılan geliştirdik C. elegans bireyler9immobilizing. Bunlar ultra-ince yumuşak yaprak oluşturan (kalınlığı 300 µm; = genişlik = 15 mm; uzunluğu = 15 mm) birden fazla (20-25) düz mikrosıvısal kanal ile (derinlik 70 µm; = genişlik = 60 µm veya 50 µm; uzunluğu 8 mm =) (Resim 1A-D) yüzeyde. Mikrosıvısal kanalları açık ve onları aynı anda alınması birden fazla hayvan izin (şekil 1E). Çarşafları (~ % 10, şekil 1F) açılacak mikrosıvısal kanalları izin esnektir ve hayvan yavaşça saran için esneklik sağlar. Ayrıca, PDMS öz adsorpsiyon kapasitesi sayesinde hayvanlar kanallarında hangi hayvanlar koymak gibi muhafaza için itilir değil bir ince kapak film ile solucan levha yüzeyini örten tarafından mühürlenmiş. Kapak film üzerinde dönüm tarafından kolayca hayvanlar toplayabilirsiniz.
Ne zaman onlar içine alınır veya toplanan olduklarında kanalları solucanlar zarar vermeyin. Ayrıca, çarşafları aslında hidrofobik olan PDMS yapılır ama su tutma hydrophilicity malzeme için imparting tarafından elde edilebilir. Su tutma ve kalınlığı solucan sayfaları olumlu özellikleridir. Su tutma kapasitesi hayvanlar susuzluktan sonra uzun süreli immobilizasyon önler ve uzun süreli gözlemler uygulanacak sağlar.
Ayrıca, daha önce9açıklandığı gibi çarşafları sadece 300 µm kalınlığında, karbon iyonları (ile su yaklaşık 1 mm aralığı) gibi ağır iyonları hayvanları kapsayan sayfa boyunca geçmek için izin vardır. Bu iyon parçacıkları tespit edilebilir ve doğru bir şekilde ölçülecek uygulanan radyasyon dozu sağlar. Ayrıca, solucan sayfaları yeniden kullanılabilir ve dolayısıyla ekonomik. Geleneksel enjeksiyon yöntemi ile alınmış hayvanlar bazen ölü ve kanal dışında alınamaz; yumurta kanalları yapışmasına neden olabilir. Bu çip kullanılamaz yapar. Fiş vardır, bu nedenle, temel olarak tek kullanımlık ve maliyet-fayda oranı düşük.
Bugünkü yazıda, biz canlı C. elegans üstünde-küçük parça immobilizasyon yöntemleri bir dizi ayrıntılı olarak tarif solucan sayfası kullanmayı bireyler. Hareket deneyleri 3 h üstünde-küçük parça immobilizasyon sonra hayvanların uygun kapak film değerlendirildi. Buna ek olarak, biz üstünde-küçük parça immobilizasyon görüntüleme gözlemler ve microbeam ışınlama için örnekler gösterdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans üstünde-küçük parça immobilizasyon ıslanabilir PDMS mikrosıvısal çip kullanarak canlı koşullar altında birden fazla hayvan verimli hedeflenen microbeam ışınlama sağlar. Kullanım ve kurutma önlemek için özellikleri kolaylığı microbeam ışınlama değil sadece, aynı zamanda çeşitli davranış deneyleri içinde bu sistem uygulamaları için uygun hale. Bu solucan çarşafları zaten ticari ve kolayca elde edilebilir. Koku cips gibi geleneksel mikrosıvısal çip hayvan ve yumu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr. Atsushi Higashitani C. elegans ve Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota ve Yasuhiko Kobayashi tedavisi için değerli tartışmaları ile ilgili olarak tür tavsiye için teşekkür ederiz. Yazarlar Caenorhabditis genetik Merkezi C. elegans ve E. colisuşları sağlamak için teşekkür ederiz. Biz taç cyclotron mürettebatı QST-Takasaki ışınlama deneyleri ile onların tür yardım için teşekkür ederim. Dr Susan Furness bu yazının taslağını düzenleme için teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada kısmen KAKENHI (Grant numaraları JP15K11921 ve JP18K18839) tarafından JSP’ler M.S. için destek verdi
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Referências
- Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
- Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
- Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
- Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
- Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
- Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
- Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
- Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
- Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, 1757-1764 (2001).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genética. 206 (4), 1985-1994 (2017).
- Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
- Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
- Lumirror Catalog. TORAY Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018)
- Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
- Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).
