Estabeleceu-se uma série de métodos de imobilização para permitir a irradiação de alvo de viver elegans de Caenorhabditis indivíduos usando um polidimetilsiloxano ultra-fino recentemente desenvolvidos microfluidic chip com retenção de água. Este romance imobilização no chip também é adequada para imagens observações. O tratamento detalhado e exemplos de aplicação do chip são explicados.
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Artigo de método
Imobilização de indivíduos ao vivo Caenorhabditis elegans , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água
Neste artigo
Resumo
Resumo
Radiação é amplamente utilizada para aplicações biológicas e para reprodução de feixes de iões, e entre esses métodos, irradiação microbeam representa um poderoso meio de identificar sites radiosensitive em organismos vivos. Este artigo descreve uma série de métodos de imobilização no chip desenvolvido para a irradiação do alvo microbeam dos indivíduos ao vivo de Caenorhabditis elegans. Notavelmente, o tratamento dos chips microfluídicos polydimethylsiloxane (PDMS) que desenvolvemos anteriormente para imobilizar a indivíduos de c. elegans , sem necessidade de anestesia é explicada em detalhes. Este chip, referido como uma folha de verme, é resistente para permitir que os canais microfluídicos ser expandido, e a elasticidade permite que os animais ser envolto suavemente. Também, devido a capacidade de adsorção independente do PDMS, animais podem ser selados nos canais, cobrindo a superfície da folha com um filme de capa fina, em que os animais não são empurrados para os canais para o compartimento de verme. Girando a tampa filme sobre, você pode facilmente acumular os animais. Além disso, a folha do verme mostra a retenção de água e permite que os indivíduos de c. elegans ser submetido a observação microscópica por longos períodos em condições ao vivo. Além disso, a folha é apenas 300 µm de espessura, permitindo íons pesados tais como íons de carbono para passar através da folha de delimitador dos animais, permitindo assim que as partículas de iões ser detectado e a dose de radiação aplicada para ser medido com precisão. Porque a seleção dos filmes capa usada para colocar os animais é muito importante para a imobilização a longo prazo bem sucedida, nós realizou a seleção dos filmes tampa apropriada e mostrou um recomendado entre alguns filmes. Como um exemplo de aplicação do chip, introduzimos a observação de imagens das atividades musculares de animais encerram o canal microfluidic da folha de minhoca, bem como a irradiação microbeam. Estes exemplos indicam que os lençóis de verme tem ampliadas as possibilidades de experimentos biológicos.
Introdução
Radiação, incluindo raios x, raios gama e o feixe de iões pesados, é amplamente utilizada para aplicações biológicas, tais como no tratamento e diagnóstico de câncer e para a reprodução de feixes de iões. Numerosos estudos e desenvolvimentos técnicos atualmente estão focando os efeitos da radiação1,2,3. Microbeam irradiação é um poderoso meio de identificar sites radiosensitive em vida organismos4. Takasaki avançado radiação pesquisa Instituto de institutos nacionais de Quantum e radiológica de ciência e tecnologia (QST-Takasaki) tem vindo a desenvolve....
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Protocolo
1. cepas e manutenção
- Selecione uma tensão adequada de c. elegans e Escherichia coli (comida) dependendo da finalidade do experimento.
Nota: No presente trabalho, selvagem-tipo N210c. elegans (Figura 2)é usado geralmente e HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 é empregado apenas para imagens do ensaio. Escherichia coli OP50 foi utilizado como alimento para o c. elegans. Alguns mutantes com forma anormal do corpo, tais como o mutante unc-119(e2498) III com uma forma espiral ....
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Resultados
Ativo c. elegans indivíduos poderiam ser imobilizados com êxito usando um PDMS ultra-fino, pó molhável, microplaqueta microfluidic (folha do verme). Nós investigamos a adequação de filmes de capa diferente para selar a folha do verme, conforme descrito na seção 3 de protocolo. Para avaliar os efeitos da selagem dos filmes tampa, determinamos a motilidade dos animais 3 h após a imobilização em-microplaqueta usando a tampa de vidro (espessura: 130-170 µm), películas PET (espessura:.......
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Discussão
Imobilização no chip de c. elegans sob condições ao vivo usando um pó molhável PDMS microfluidic chip permite a irradiação de eficiente microbeam alvo de vários animais. A facilidade de manipulação e recursos para evitar a secagem fazer este sistema apropriado para aplicações não só na irradiação microbeam, mas também em vários ensaios comportamentais. Estas folhas de verme já tem sido comercializadas e podem ser facilmente obtidas. Fichas de microfluidic convencionais, tais como fichas olfativas, são associadas.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecer Dr. Atsushi Higashitani Conselho em relação ao tratamento de c. elegans e DRS Yuya Hattori, Yuichiro Yokota e Yasuhiko Kobayashi para discussões valiosas. Os autores agradecer o centro de genética Caenorhabditis pelo fornecimento de cepas de c. elegans e e. coli. Agradecemos a tripulação do ciclotron de TIARA no QST-Takasaki por sua gentil assistência com os experimentos de irradiação. Agradecemos o Dr. Susan Furness para edição de um projecto deste manuscrito. Este estudo foi suportado em parte pela KAKENHI (Grant números JP15K11921 e JP18K18839) de JSPS para M.S.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| C. elegans estirpe de tipo selvagem | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EUA | Estirpe de | tipo selvagem N2 C. elegans geralmente utilizada neste estudo |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutante estirpe | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EUA | CB4845 | C. elegans cepa empregada apenas como exemplo de mutantes com forma corporal anormal |
| Cepa transgênica C. elegans HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EUA | HBR4 | O genótipo desta cepa transgênica C. elegans é HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54– 3' utr, unc-119(+)]V. Essa cepa foi empregada apenas para observação por imagem. |
| Cepa E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EUA Cepa | OP50 | E. coli usada como alimento para C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japão | BCM17-0001 | Chip microfluídico com 25 50/60-µ retos; m canais de largura usados em todos os experimentos e observações neste artigo |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japão | BCM18-0001 | Microfluídica chip com 20 retos 60 µ canais de largura m. Isso é possível para adultos 3-5 dias após a eclosão a 20 graus Celsius. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japão | BCM18-0002 | Microfluídica chip com 20 retos 50 µ canais de largura m. Isso é possível para jovens adultos ~3 dias após a eclosão a 20 graus C. |
| MICRO VIDRO DE COBERTURA | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Tampa de vidro (espessura: 130-170 µ m) usado em ensaios de locomoção no Protocolo 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japão | BCM18-0001 / BCM18-0002 | Itens agrupados de folhas de minhoca. PS filim (espessura: ~ 130 µ m) usado em ensaios de locomoção no Protocolo 3. |
| Filme de Poliéster Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tóquio, Japão | Lumirror T60 (t 125 µ m) | PET filim (espessura: 125 µ m) usado em ensaios de locomoção no Protocolo 3 |
| IWAKI 60 mm/prato não tratado | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japão). | 1010-060 | Prato não tratado usado na incubação de C. elegans no Protocolo |
| 1 IWAKI 35 mm/prato não tratado | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japão). | 1010-035 | Prato não tratado usado em ensaios de locomoção no Protocolo 3 |
| Milli-Q | Merck, França | Água ultrapura | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tóquio, Japão | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 folhas/caixa |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, EUA) | 59-AWP | Platina picker specilized para coleta C. elegans |
| Sistema de Microscópio Estereoscópico de Pesquisa | OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão | SZX16 | Micriscópio usado em todos os experimentos e observações neste artigo |
| Suporte de foco motorizado para SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão | SZX2-ILLB | Isso foi usado para observação de campo brilhante no Protocolo 3-8. |
| Lente objetiva (× 1) | OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão | SDFPLAPO1 e vezes; PF | NA: 0,15; W.D.: 60 mm. Isso empresta foi usado para observação de campo claro no Protocolo 3-8. |
| Lente objetiva (× 2) | OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0,3; W.D.: 20 mm. Este empresta foi usado para observações de imagem. |
| Fonte de luz de mercúrio | OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão | U-LH100HG | O amplo espectro de emissão permite que uma variedade de experimentos de imagem de fluorescência seja conduzida usando todos os fluoróforos comuns. |
| Unidade de filtro fluorescente SZX16 (alto desempenho para YFP) | OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão | SZX2-FYFPHQ | Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. Isso foi usado para observação de imagem da cepa HBR4. |
| Câmera digital de alta velocidade EXILIM | CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tóquio, Japão | EX-F1 Figura 1B, 1E, 1F, Figura 2A-C e Vídeo 1 foram obtidos usando esta câmera digital. | |
| Office 2013 | Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, EUA | EXCEL Software usado para análises estatísticas |
Referências
- Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
- Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y.
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Reimpressões e permissões
