Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica
Summary
Una serie di metodi di immobilizzazione è stata stabilita per consentire l’irradiazione mirata di live Caenorhabditis elegans individui che utilizzano un microfluidici recentemente sviluppati polidimetilsilossano ultra-sottile chip con ritenzione idrica. Questa romanzo immobilizzazione su chip è anche sufficiente per osservazioni di imaging. Il trattamento dettagliata ed esempi di applicazione del chip sono spiegati.
Abstract
Radiazione è ampiamente usato per applicazioni biologiche e per l’allevamento del fascio di ioni, e tra questi metodi, microbeam irradiazione rappresenta un potente mezzo di identificazione radiosensibili siti negli organismi viventi. Questo articolo descrive una serie di metodi di immobilizzazione su chip sviluppato per l’irradiazione di microbeam mirata degli individui dal vivo di Caenorhabditis elegans. In particolare, il trattamento dei chip microfluidici polidimetilsilossano (PDMS) che abbiamo precedentemente sviluppato per immobilizzare gli individui di c. elegans senza la necessità per l’anestesia è spiegato in dettaglio. Questo chip, indicato come un foglio di vite senza fine, è resiliente per consentire i canali microfluidici essere ampliato e l’elasticità permette animali lasciarsi avvolgere delicatamente. Inoltre, a causa della capacità di auto-adsorbimento del PDMS, gli animali possono essere sigillati nei canali coprendo la superficie del foglio verme con una pellicola sottile copertina, in cui gli animali non vengono spinti nei canali per recinzione. Girando il coperchio della pellicola sopra, possiamo facilmente raccogliere gli animali. Inoltre, il foglio di vite senza fine Mostra la ritenzione idrica e permette agli individui di c. elegans di essere sottoposti ad osservazione microscopica per lunghi periodi in condizioni live. Inoltre, il foglio è solo 300 µm di spessore, consentendo gli ioni pesanti ad esempio ioni carbonio di passare attraverso il foglio che racchiude gli animali, consentendo in tal modo le particelle di ioni essere rilevato e la dose di radiazioni applicata deve essere misurata con precisione. Perché la selezione dei film di copertura utilizzato per racchiudere gli animali è molto importante per il successo a lungo termine immobilizzazione, abbiamo condotto la selezione dei film copertura adeguata e ha mostrato un consigliato uno tra alcuni film. Come un esempio di applicazione del chip, abbiamo introdotto imaging osservazione delle attività muscolare degli animali che racchiude il canale di microfluidica del foglio di vite senza fine, come pure l’irradiazione microbeam. Questi esempi indicano che i fogli di vite senza fine hanno notevolmente ampliato le possibilità per gli esperimenti biologici.
Introduction
Radiazioni, tra cui i raggi x, raggi gamma e fascio di ioni pesanti, sono ampiamente usato per applicazioni biologiche come nella diagnosi del cancro e nel trattamento e per l’allevamento del fascio di ioni. Numerosi studi e sviluppi tecnici si stanno attualmente concentrando sugli effetti della radiazione1,2,3. Microbeam irradiazione è un potente mezzo di identificazione radiosensibili siti nel vivere organismi4. Il Takasaki Advanced radiazione ricerca Istituto di istituti nazionali per Quantum e radiologici Science and Technology (QST-Takasaki) ha sviluppato una tecnologia per irradiare le cellule individuali sotto osservazione microscopica utilizzando ioni pesanti microfasci5e ha stabilito i metodi per consentire l’irradiazione di microbeam mirato di diversi modelli animali, quali il nematode Caenorhabditis elegans4,6, bachi da seta7e Oryzias latipes (Japanese medaka)8. Microbeam mirati irradiazione della del nematode c. elegans permette l’efficace atterramento di specifiche regioni, come l’anello del nervo nella regione cefalica, contribuendo così a identificare i ruoli di questi sistemi in processi quali la locomozione.
Un metodo per l’immobilizzazione su chip di c. elegans individui senza la necessità di anestesia è stato sviluppato per consentire microbeam irradiazione4. Inoltre, per migliorare il chip microfluidici utilizzato nel precedente studio4, abbiamo recentemente sviluppato chip microfluidici bagnabile, ione-penetrabile, polidimetilsilossano (PDMS), indicato come fogli di vite senza fine (Vedi Tabella materiali), per immobilizzazione di c. elegans individui9. Questi comprendono lenzuola morbide ultra-sottile (spessore = 300 µm; larghezza = 15 mm; lunghezza = 15 mm) con più canali microfluidici dritto (20 o 25) (profondità = 70 µm; larghezza = 60 µm o 50 µm; lunghezza = 8 mm) sulla superficie (Figura 1A-D). I canali microfluidici sono aperti e permettere agli animali di più di essere racchiuso tra loro simultaneamente (Figura 1E). I fogli sono resistenti per permettere i canali microfluidici essere ampliato (da ~ 10%, Figura 1,F), e l’elasticità permette animali lasciarsi avvolgere delicatamente. Inoltre, a causa della capacità di auto-adsorbimento del PDMS, gli animali possono essere sigillati nei canali coprendo la superficie del foglio verme con una pellicola sottile copertina, in cui gli animali non vengono spinti nei canali per recinzione. Girando il coperchio della pellicola sopra, possiamo facilmente raccogliere gli animali.
I canali non fanno male i vermi quando sono essere racchiusi o quando sono stati raccolti. Inoltre, i fogli sono realizzati da PDMS, che è essenzialmente idrofobico, ma ritenzione idrica può essere raggiunto da impartire idrofilia del materiale. La ritenzione idrica e lo spessore sono caratteristiche favorevoli dei fogli vite senza fine. La capacità di ritenzione idrica previene la disidratazione degli animali dopo immobilizzazione prolungata e consente osservazioni a lungo termine da effettuarsi.
Inoltre, come descritto in precedenza9, i fogli sono solo 300 µm di spessore, consentendo gli ioni pesanti come gli ioni di carbonio (con un intervallo di circa 1 mm di acqua) di passare attraverso il foglio che racchiude gli animali. In questo modo le particelle di ioni per essere rilevato e la dose di radiazioni applicata deve essere misurata con precisione. Inoltre, i fogli della vite senza fine possono essere riutilizzati e sono così economici. Con il metodo di iniezione convenzionali, gli animali racchiusi a volte sono morti e non possono essere prese fuori del canale; le uova possono anche ostruire i canali. Questo rende inutilizzabile il chip. Chip sono, pertanto, fondamentalmente USA e getta e il rapporto costi-benefici rapporto è scarsa.
Nella carta attuale, descriviamo dettagliatamente una serie di metodi per l’immobilizzazione su chip di streaming in c. elegans individui che utilizzano fogli di vite senza fine. Mediante saggi di locomozione degli animali 3 h dopo immobilizzazione su chip, abbiamo valutato il film di copertura adeguata. Inoltre, abbiamo mostrato gli esempi di immobilizzazione su chip per imaging osservazioni sia microbeam irradiazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immobilizzazione su chip di c. elegans in condizioni dal vivo utilizzando un bagnabile PDMS microfluidic chip consente l’irradiazione efficiente microbeam mirata di più animali. La facilità di movimentazione e caratteristiche per evitare l’essiccazione rendono questo sistema adatto per applicazioni non solo in microbeam irradiazione, ma anche in diversi saggi comportamentali. Questi fogli di vite senza fine sono già stati commercializzati e possono essere facilmente ottenuti. Chip microfluidici convenzionali,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Atsushi Higashitani per gentile Consiglio per quanto riguarda il trattamento di c. elegans e d. ssa Yuya Hattori, Yuichiro Yokota e Yasuhiko Kobayashi per discussioni importanti. Gli autori ringraziano il centro genetico di Caenorhabditis per la fornitura di ceppi di c. elegans ed Escherichia coli. Ringraziamo l’equipaggio del ciclotrone del diadema a QST-Takasaki per la loro assistenza gentile con gli esperimenti di irradiazione. Ringraziamo il Dr. Susan Furness per la modifica di un progetto di questo manoscritto. Questo studio è stato sostenuto in parte da KAKENHI (Grant numeri JP15K11921 e JP18K18839) da JSP a M.S.
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Referências
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