Immobilisatie van levende Caenorhabditis elegans personen een Ultra-thin Polydimethylsiloxaan Microfluidic Chip met waterretentie
Summary
Een reeks van immobilisatie methoden is vastgesteld dat de gerichte bestraling van levende Caenorhabditis elegans individuen met behulp van een onlangs ontwikkelde ultradunne Polydimethylsiloxaan microfluidic chip met waterretentie. Deze roman op de chip immobilisatie is ook geschikt voor imaging opmerkingen. De gedetailleerde behandeling en toepassingsvoorbeelden van de chip worden toegelicht.
Abstract
Straling wordt veel gebruikt voor biologische toepassingen en voor de ion-beam fokkerij, en onder deze methoden, microbeam bestraling vertegenwoordigt een krachtig instrument om radiosensitive sites in levende organismen te identificeren. Dit witboek beschrijft een aantal op-Spaander immobilisatie methoden ontwikkeld voor de gerichte microbeam doorstraling van levende individuen van Caenorhabditis elegans. Met name de behandeling van de Polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluidic chips die we eerder ontwikkeld om te immobiliseren C. elegans individuen zonder de noodzaak voor verdoving wordt uitgelegd in detail. Deze chip, een worm blad, hierna is veerkrachtig om de kanalen van de microfluidic worden uitgebreid en de elasticiteit laat dieren voorzichtig worden gehuld. Ook, als gevolg van de capaciteit van de zelfstandige adsorptie van het PDMS, dieren kunnen worden afgesloten in de kanalen door die betrekking hebben op het oppervlak van de worm blad met een dunne dekking-film, waarin dieren niet in de kanalen voor behuizing duwde zijn. Door draaien de cover film over, kunnen we gemakkelijk de dieren verzamelen. Bovendien, het blad van de worm toont waterretentie en kan C. elegans personen onderworpen aan microscopische observatie gedurende lange perioden live omstandigheden. Bovendien, is het blad slechts 300 µm dik, waardoor zware ionen zoals koolstof ionen aan het passeren van het blad bijvoeging van de dieren, waardoor de ion deeltjes worden gedetecteerd en de toegepaste stralingsdosis te nauwkeurig worden gemeten. Omdat de selectie van de dekking films gebruikt voor bijvoeging van de dieren is erg belangrijk voor een succesvolle langdurige immobilisatie, we uitgevoerd van de selectie van de geschikte dekking films en toonde een aanbevolen één onder sommige films. Als een voorbeeld van de toepassing van de chip introduceerden we imaging observatie van gespierde activiteiten van dieren bijvoeging van het kanaal van de microfluidic van het blad van de worm, evenals dedoorstraling van microbeam. Deze voorbeelden geven aan dat de worm bladen hebben breidde de mogelijkheden voor biologische experimenten.
Introduction
Straling, met inbegrip van x-stralen, gamma stralen en zware-ion beam, wordt veel gebruikt voor biologische toepassingen zoals in diagnose en behandeling, en voor de ion-beam fokkerij. Talloze studies en technische ontwikkelingen zijn momenteel gericht op de gevolgen van straling1,2,3. Bestraling van de Microbeam is een krachtig instrument van identificatie van de radiosensitive sites in levende organismen4. De Takasaki geavanceerde straling Instituut voor nationale onderzoeksinstituten voor Quantum en radiologische wetenschap en technologie (QST-Takasaki) heeft het ontwikkelen van een technologie om te bestralen van afzonderlijke cellen onder microscopische observatie met behulp van zware-ion microbeams5, en heeft gevestigde methoden om te schakelen van gerichte microbeam bestraling van verschillende model dieren, zoals de nematode Caenorhabditis elegans4,6, zijderupsen7pt Oryzias latipes (Japanese medaka)8. Gerichte microbeam bestraling van de nematode C. elegans kunt de effectieve knockdown voor specifieke regio’s, zoals de ring van de zenuw in de hoofd regio, waardoor om de rollen van deze systemen in processen zoals motoriek te identificeren.
Een methode voor op de chip immobilisatie van C. elegans individuen zonder de noodzaak voor anesthesie is ontwikkeld om te voorzien in microbeam bestraling4. Bovendien, ter verbetering van microfluidic chips gebruikt in de vorige studie4, hebben we onlangs ontwikkeld spuitpoeders, ion-penetrable, Polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluidic chips, hierna aangeduid als worm platen (Zie Tabel of Materials), voor immobilizing C. elegans individuen9. Deze omvatten van ultra dunne zachte platen (dikte = 300 µm; breedte = 15 mm; lengte = 15 mm) met meerdere kanalen voor (20 of 25) rechte microfluidic (diepte = 70 µm; breedte = 60 µm of 50 µm; lengte = 8 mm) aan het oppervlak (Figuur 1A-D). De microfluidic kanalen staan open en toestaan dat meerdere dieren tegelijk erin worden gevoegd (Figuur 1E). De bladen zijn veerkrachtig aan het toestaan van de microfluidic kanalen worden uitgebreid (met ~ 10%, Figuur 1F) en de elasticiteit kan dieren voorzichtig worden gehuld. Ook, als gevolg van de capaciteit van de zelfstandige adsorptie van het PDMS, dieren kunnen worden afgesloten in de kanalen door die betrekking hebben op het oppervlak van de worm blad met een dunne dekking-film, waarin dieren niet in de kanalen voor behuizing duwde zijn. Door draaien de cover film over, kunnen we gemakkelijk de dieren verzamelen.
De kanalen doen de wormen niet kwetsen wanneer ze zijn worden omsloten door of wanneer ze verzameld worden. Bovendien, de bladen zijn gemaakt van PDMS, die in wezen hydrofobe, maar vasthouden van water kan worden bereikt door het meegeven van hydrophilicity aan het materiaal. De waterretentie en de dikte zijn gunstige kenmerken van de bladen van de worm. De waterretentie capaciteit voorkomt uitdroging van de dieren na langdurige immobilisatie en kan op lange termijn observaties uit te voeren.
Bovendien, zoals eerder is beschreven9, zijn de bladen slechts 300 µm dik, waardoor zware ionen zoals koolstof ionen (met een bereik van ongeveer 1 mm in water) passeren het blad bijvoeging van de dieren. Hierdoor is de ion deeltjes worden gedetecteerd en de toegepaste stralingsdosis te nauwkeurig worden gemeten. Bovendien is de worm bladen kunnen worden hergebruikt en zijn dus zuinig. Met de methode van de conventionele injectie, de dieren omsloten zijn soms dood en ze kunnen niet worden genomen uit het kanaal; hun eieren kunnen ook verstopt de kanalen. Dit maakt de chip onbruikbaar. Chips zijn, dus in principe wegwerp en de kosten-baten verhouding is slecht.
In het huidige document, we beschrijven in detail een aantal methoden voor het op de chip immobilisatie van levende C. elegans individuen met behulp van worm sheets. We geëvalueerd via motoriek testen van dieren 3 h na immobilisatie op de chip, de film geschikt dekking. Daarnaast, toonden we de voorbeelden van op-Spaander immobilisatie voor zowel imaging opmerkingen en microbeam bestraling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Op de chip immobilisatie van C. elegans live omstandigheden met behulp van een bevochtigbaar PDMS microfluidic chip kunt efficiënt gerichte microbeam dedoorstraling van meerdere dieren. Het gemak van behandeling en functies om te voorkomen dat het drogen maken dit systeem geschikt voor toepassingen in microbeam bestraling, maar ook in verschillende gedrags testen. Deze worm bladen hebben al zijn gecommercialiseerd en kunnen gemakkelijk worden verkregen. Conventionele microfluidic chips, zoals olfactorische chip…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Atsushi Higashitani voor vriendelijk advies met betrekking tot de behandeling van C. elegans en Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota en Yasuhiko Kobayashi voor waardevolle discussies. De auteurs bedanken de Caenorhabditis genetische Center voor het verstrekken van stammen van C. elegans pt E. coli. Wij danken de bemanning van het cyclotron van TIARA op QST-Takasaki voor hun vriendelijke hulp met de bestraling experimenten. Wij danken Dr. Susan Furness voor het bewerken van een ontwerp van dit manuscript. Deze studie werd deels gesteund door KAKENHI (Grant nummers JP15K11921 en JP18K18839) van JSPS aan M.S.
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Referências
- Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
- Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
- Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
- Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
- Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
- Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
- Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
- Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
- Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, 1757-1764 (2001).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genética. 206 (4), 1985-1994 (2017).
- Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
- Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
- Lumirror Catalog. TORAY Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018)
- Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
- Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).
