Inmovilización de personas en Caenorhabditis elegans con un Chip de microfluidos polidimetilsiloxano ultra-delgada de retención de agua
Summary
Se ha establecido una serie de métodos de inmovilización para permitir la irradiación dirigida de vivo Caenorhabditis elegans individuos utilizando un microfluídicos polidimetilsiloxano ultrafino recientemente desarrollados de la viruta con retención de agua. Esta novela inmovilización de la en-viruta también es adecuado para observaciones de imágenes. El tratamiento detallado y ejemplos de aplicación de la viruta se explican.
Abstract
Radiación es ampliamente utilizada para aplicaciones biológicas y para la cría de la viga de ion, y entre estos métodos, irradiación de microhaz representa un medio poderoso para identificar sitios sensible a la radiación en los organismos vivos. Este papel describe una serie de métodos de inmovilización de la en-viruta para la irradiación de microhaz específicas de individuos vivos de Caenorhabditis elegans. En particular, el tratamiento de las virutas de microfluidos de polidimetilsiloxano (PDMS) que desarrollamos anteriormente para inmovilizar a C. elegans individuos sin necesidad de anestesia se explica en detalle. Este chip, conocido como la hoja de un gusano, es flexible para permitir que los canales de microfluidos para ampliarse, y la elasticidad permite a los animales envolver suavemente. También, debido a la capacidad de la adsorción de los PDMS, los animales pueden sellarse en los canales cubriendo la superficie de la hoja de gusano con una película fina de la cubierta, en que animales no se empujan en los canales para el recinto. Girando la tapa de la película sobre, podemos recoger fácilmente los animales. Además, el gusano muestra retención de agua y permite a los individuos de C. elegans a ser sometidos a observación microscópica por largos periodos bajo condiciones vivo. Además, la hoja es sólo 300 μm de espesor, permitiendo que iones pesados tales como los iones de carbono pase a través de la hoja que encierra a los animales, permitiendo que las partículas de iones ser detectado y la dosis de radiación aplicada a medirse con precisión. Porque la selección de las películas de cubierta utilizado para que los animales es muy importante para la inmovilización a largo plazo exitosa, se realizó la selección de las películas de la cubierta conveniente y demostró una recomendada entre algunas películas. Como un ejemplo de aplicación de la viruta, presentamos imágenes observación de actividades musculares de los animales que incluye el canal microfluídico de la hoja de gusano, así como la irradiación de microhaz. Estos ejemplos indican que las hojas Gusano han expandido las posibilidades para experimentos biológicos.
Introduction
Radiación, incluyendo rayos x, rayos gamma y haz de iones pesados, es ampliamente utilizada para aplicaciones biológicas como en el diagnóstico de cáncer y tratamiento y para la cría de la viga de ion. Numerosos estudios y desarrollos técnicos actualmente se centra en los efectos de la radiación1,2,3. Irradiación de microhaz es un medio poderoso de identificación de sitios sensible a la radiación en la vida de los organismos4. La Takasaki avanzado radiación Instituto de nacional institutos de investigación de Quantum y radiológicas de la ciencia y tecnología (QST-Takasaki) ha desarrollado una tecnología para irradiar células individuales bajo observación microscópica con iones pesados microhaces5y ha establecido métodos para permitir la irradiación de microhaz específicas de varios animales modelo, tales como el nematodo Caenorhabditis elegans4,6gusanos de seda7y Oryzias latipes (medaka japonesa)8. Irradiación de microhaz específicas del nematodo C. elegans permite la caída efectiva de regiones específicas, tales como el anillo del nervio en la región de la cabeza, ayudando así a identificar las funciones de estos sistemas en procesos tales como locomoción.
Se ha desarrollado un método para la inmovilización de la en-viruta de C. elegans individuos sin necesidad de anestesia para permitir la irradiación de microhaz4. Además, para mejorar la microfluídica virutas usadas en el anterior estudio4, recientemente hemos desarrollado chips de microfluídicos mojable, ion-permeable, polydimethylsiloxane (PDMS), contempladas como hojas de gusano (véase Tabla de materiales), para inmovilización de individuos de C. elegans 9. Estos forman parte de hojas de suaves ultra delgadas (espesor = 300 μm; ancho = 15 mm; longitud = 15 mm) con múltiples canales de microfluidos recto (20 o 25) (profundidad = 70 μm; ancho = 60 μm o 50 μm; longitud = 8 mm) en la superficie (figura 1A, D). Los canales de la microfluídica están abiertos y permite que varios animales ser incluido en ellos al mismo tiempo (figura 1E). Las hojas son flexibles para permitir que los canales de microfluidos para ampliar (~ 10%, figura 1F), y la elasticidad permite a los animales envolver suavemente. También, debido a la capacidad de la adsorción de los PDMS, los animales pueden sellarse en los canales cubriendo la superficie de la hoja de gusano con una película fina de la cubierta, en que animales no se empujan en los canales para el recinto. Girando la tapa de la película sobre, podemos recoger fácilmente los animales.
Los canales no hacen daño los gusanos cuando están siendo cerrados o cuando se recogen. Además, las hojas están hechas de PDMS, que es esencialmente hidrofóbicas, pero la retención de agua se logra impartiendo hidrofilia del material. La retención de agua y el espesor son características favorables de las hojas de gusano. La capacidad de retención de agua evita la deshidratación de los animales después de la inmovilización prolongada y permite observaciones a largo plazo para llevarse a cabo.
Además, como se describe anteriormente9, las hojas son sólo 300 μm de espesor, permitiendo que iones pesados tales como los iones de carbono (con un rango de aproximadamente 1 mm de agua) para pasar a través de la hoja que encierra a los animales. Esto permite que las partículas de iones para ser detectado y la dosis de radiación aplicada a medirse con precisión. Por otra parte, las hojas de gusano pueden ser reutilizadas y así son económicas. Con el método de inyección convencional, los animales incluidos son a veces muertos y no puede ser sacados del canal; sus huevos también pueden obstruir los canales. Esto hace que el chip inutilizables. Chips son, por lo tanto, básicamente disponible y el costo-beneficio relación es pobre.
En el presente trabajo, describimos detalladamente una serie de métodos para la inmovilización de la en-viruta de vivo C. elegans individuos utilizando hojas de gusano. A través de análisis de la locomoción de los animales 3 h después de la inmovilización de la en-viruta, evaluamos la película cubierta conveniente. Además, mostramos los ejemplos de inmovilización de la en-viruta para observaciones de imágenes y de la irradiación de microhaz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inmovilización de la en-viruta de C. elegans bajo condiciones vivo usando un chip de microfluidos mojable de PDMS permite la irradiación de microhaz objetivo eficiente de múltiples animales. La facilidad de manejo y características para prevenir la resequedad que este sistema adecuado para aplicaciones en microhaz irradiación, sino también en diversos estudios de comportamiento. Estas hojas gusano ya han sido comercializadas y pueden obtenerse fácilmente. Chips microfluídicos convencional, como astillas …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el Dr. Atsushi Higashitani Consejo bueno con respecto al tratamiento de C. elegans , los Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota y Yasuhiko Kobayashi para discusiones valiosas. Los autores agradecen el centro genético de Caenorhabditis proveer cepas de C. elegans y e. coli. Agradecemos a la tripulación del ciclotrón de TIARA en QST Takasaki por su amable ayuda con los experimentos de irradiación. Agradecemos al Dr. Susan Furness para editar un borrador de este manuscrito. Este estudio fue apoyado en parte por KAKENHI (beca números JP15K11921 y JP18K18839) de JSP a M.S.
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Referências
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