물 유지와 울트라입니다 미세 칩을 사용 하 여 라이브 꼬마 선 충 의 동원 정지
Summary
일련의 동원 정지 메서드를 라이브 꼬마 선 충 의 대상된 조사 수 있도록 설립 되었습니다 최근 개발한 초박형입니다 미세를 사용 하 여 개인 물 유지와 칩. 이 새로운 칩에 동원 정지 관측 이미징에 대 한 적절 한 이기도 합니다. 자세한 치료 및 칩의 응용 프로그램 예제는 설명 했다.
Abstract
방사선은 생물 학적 응용 프로그램 및 이온 빔 번 식, 널리 사용 되 고 이러한 방법 중 microbeam 방사선 생명체에 radiosensitive 사이트를 식별 하는 강력한 수단을 나타냅니다. 이 문서는 일련을의 온 칩 immobilization 메서드 꼬마 선 충의 라이브 개인 대상된 microbeam 방사선에 대 한 개발에 대해 설명 합니다. 특히, 우리가 이전 마 취는 자세히 설명 되어에 대 한 필요 없이 선 충 C. 개인을 무력화 하기 위해 개발입니다 (PDMS) 미세 칩의 치료. 웜 시트 라고 하는이 칩은 탄력 미세 채널 확장 될 수 있도록 하며 탄성 동물 부드럽게 덮여 또한,는 PDMS의 자기 흡착 용량 때문 동물 수 봉인 채널에 없는 동물 하지 올려집니다 채널에 위한 인클로저 얇은 커버 필름으로 벌레 시트의 표면을 커버 하는 여. 회전 표지에 영화, 하 여 우리 쉽게 동물을 수집할 수 있습니다. 또한, 웜 시트 물 보존을 보여줍니다 및 선 충 C. 개인이 라이브 조건에서 오랜 기간 동안 현미경 관찰 대상이 될 수 있습니다. 또한, 시트가입니다만 300 µ m 두께, 탄소 이온 이온 입자 감지 되므로 동물을 포함 하는 시트를 통과 같은 무거운 이온과 적용된 방사선 복용량을 정확 하 게 측정할 수 있도록. 다양 한 동물을 둘러싸는 사용 커버 영화 성공적인 장기 동원 정지에 대 한 매우 중요 하기 때문에, 우리 적당 한 커버 영화의 선택을 실시 하 고 일부 영화 중 하나를 권장된 했다. 응용 프로그램의 예로 칩, 웜 시트 microbeam 방사선의 미세 채널을 포함 하는 동물의 근육 활동의 영상 관측을 소개 했습니다. 이 예제에서는 웜 시트 생물학 실험에 대 한 가능성을 크게 확대 했습니다 나타냅니다.
Introduction
방사선, 엑스레이, 감마선, 무거운 이온 빔 등 암 진단 및 치료에서 같은 생물 학적 응용 및 이온 빔 사육에 널리 사용 됩니다. 수많은 연구와 기술 개발은 현재 방사선1,2,3의 효과에 집중 됩니다. Microbeam 방사선은 생활에 radiosensitive 사이트를 식별 하는 강력한 수단 유기 체4. 다카사키 고급 방사선 연구소의 국립 연구소 양자 방사선 과학 및 기술 (QST-다카사키)에 대 한 무거운 이온을 사용 하 여 현미경 관찰에서 개별 셀을 비추는 기술 개발 microbeams5, 선 충 류 꼬마 선 충4,6, 누7, Oryzias 등 여러 모델 동물의 방사선 조사 대상된 microbeam를 사용 하는 방법을 설립 했다 latipes (일본 메 다카)8. 선 충 C. 선 충 의 타겟된 microbeam 방사선 수 신경 반지에 머리 지역에 따라서 운동 같은 프로세스에 이러한 시스템의 역할을 돕는 등 특정 지역의 효과적인 최저가 있습니다.
무감각을 위한 필요 없이 선 충 C. 개인의 온 칩 동원 정지 하는 방법 microbeam 조사4수 있도록 개발 되었습니다. 또한, 이전 연구4에서 사용 하는 미세 칩을 개선 하기 위해, 우리는 최근 개발 wettable, 이온-꿰 뚫을 수,입니다 (PDMS) 미세 칩, 웜 시트 ( 재료의 표참조), 라고 immobilizing C. 선 충 개인9. 이러한 울트라 얇은 부드러운 시트의 구성 (두께 = 300 µ m; 폭 = 15 밀리미터; 길이 = 15 m m) 여러 (20 또는 25) 똑바로 미세 채널 (깊이 70 µ m; = 너비 = 60 µ m 또는 50 µ m; 길이 = 8 mm) 표면 (그림 1A-D)에. 미세 채널은 열려 있고 동시에 그들에 묶어야 합니다 여러 동물 허용 (그림 1E). 시트는 탄력 미세 채널 (~ 10%, 그림 1F)에 의해 확장 될 수 있도록 하며 탄성 동물 부드럽게 덮여 또한,는 PDMS의 자기 흡착 용량 때문 동물 수 봉인 채널에 없는 동물 하지 올려집니다 채널에 위한 인클로저 얇은 커버 필름으로 벌레 시트의 표면을 커버 하는 여. 회전 표지에 영화, 하 여 우리 쉽게 동물을 수집할 수 있습니다.
채널 포함 되는 경우 또는 그들은 수집 하는 때 벌레를 다치게 하지 않습니다. 또한, 시트는 본질적으로 소수는 PDMS에서 만들었지만 물 보존 자료에 화란 부여에 의해 달성 될 수 있다. 물 보존 및 두께 웜 시트의 유리한 특징입니다. 물 보존 용량 머리말 붙인된 동원 정지 후 동물의 탈수를 방지 하 고 장기 관측 실시 될 수 있습니다.
또한, 앞에서 설명한9, 시트는만 300 µ m 두께, 동물을 포함 하는 시트를 통과 탄소 이온 (물 약 1 m m의 범위)와 같은 무거운 이온을 허용. 이온 입자 감지 되 고 적용 된 방사선 복용량을 정확 하 게 측정할 수 있습니다. 또한, 웜 시트 다시 사용할 수 있으며 따라서 경제적. 기존의 주입 방법 동봉 동물은 때때로 죽은 채널;에서 촬영 하실 수 없습니다. 그들의 계란 또한 채널을 방해할 수 있습니다. 이것은 칩을 사용할 수 없게 합니다. 칩은, 따라서, 기본적으로 일회용 비용 혜택 비율입니다.
현재 신문에서 우리 자세하게에서 설명 일련의 온 칩 라이브 C. 선 충 의 동원 정지에 대 한 메서드를 웜 시트를 사용 하 여 개인. 동물 내장 동원 정지 후 3 h의 운동 분석을 통해 우리는 적당 한 커버 필름 평가. 또한, 우리는 온-칩 동원 정지 영상 관찰과 microbeam 방사선에 대 한의 예를 보였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wettable PDMS 미세 칩을 사용 하 여 라이브 조건 C. 선 충 의 온 칩 immobilization 여러 동물의 효율적인 타겟된 microbeam 조사를 수 있습니다. 처리 및 건조 방지 기능을 추가의 용이성 microbeam 방사선, 뿐만 아니라 여러 행동 분석에서이 시스템을 응용 프로그램에 적합 하 게. 이러한 웜 시트 이미 상용화 하 고 쉽게 얻어질 수 있다. 후 각 칩 등 기존의 미세 칩에 연결 된 동물, 동물, 수집 하 고 어려운…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 박사 아츠 시 Higashitani 귀중 한 토론에 대 한 C. 선 충 과 박사 유야 핫토리, 유이치로 요코타, 야스히코 고바야시의 치료에 관한 친절 상담 감사. 저자는 꼬마 유전 센터 C. 선 충 및 대장균의 긴장을 제공 하기 위한 감사 합니다. 우리는 방사선 실험 그들의 종류에 대해 QST 다카사키에서 티아라의 싸이 클 로트 론의 승무원을 감사합니다. 우리는이 원고 초안을 편집 하기 위해 박사 수잔 퍼니스를 감사 합니다. 이 연구는 일부 KAKENHI (보조금 번호 JP15K11921 및 JP18K18839)에 의해에서 지원 JSP 석사
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Referências
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