Summary
تم تطوير بروتوكول احتجاز الليزر microdissection (LCM) للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام. وتركز الدراسة الحالية على أقسام عظم الفخذ الماوس. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتوكول LCM المبلغ عنه هنا لدراسة التعبير الجيني في الخلايا من أي أنسجة صلبة.
Abstract
[رنا] عائد ة ونزاهة حاسمة ل [رنا] تحليل. ومع ذلك، غالباً ما يكون من الصعب من الناحية الفنية للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي في جميع أنحاء كامل ليزر التقاط microdissection (LCM) الإجراء. بما أنّ [لكم] دراسات يعمل مع [لوو كمّوتس] المادة, اهتمامات حول محدودة [رنا] غلة أيضا مهمّة. ولذلك، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام. تم تقييم تأثير بروتوكول تلطيخ، وسمك التبريد، وكمية الأنسجة المجهرية، ومجموعة استخراج الحمض النووي الريبي، ونظام LCM المستخدمة في العائد RNA والسلامة التي تم الحصول عليها من خلايا العظام microdissected. تم إجراء ثمانية ميكرومتر سميكة أقسام العظام المجمدة باستخدام فيلم لاصق وملطخة باستخدام بروتوكول سريع لوصمة عار LCM التجارية. كانت العينة تقع بين غشاء تيريفثالات البولي إثيلين (PET) والفيلم اللاصق. وقد استخدم نظام LCM يستخدم الجاذبية لجمع العينات وطريقة استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود للحصول على RNAs عالية الجودة ذات العائد الكافي. وتركز الدراسة الحالية على أقسام عظم الفخذ الماوس. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتوكول LCM المبلغ عنه هنا لدراسة التعبير الجيني في الموقع في الخلايا من أي أنسجة صلبة في كل من الظروف الفسيولوجية وعمليات المرض.
Introduction
تتكون الأنسجة من أنواع الخلايا غير المتجانسة والموزعة مكانياً. قد تستجيب أنواع الخلايا المختلفة في نسيج معين بشكل مختلف لنفس الإشارة. ولذلك، فمن الضروري أن تكون قادرة على عزل مجموعات محددة من الخلايا لتقييم دور أنواع الخلايا المختلفة في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. يوفر استئصال الليزر الجزئي (LCM) طريقة سريعة ودقيقة نسبيًا لعزل وإزالة خلايا محددة من الأنسجة المعقدة1. تستخدم أنظمة LCM قوة شعاع الليزر لفصل الخلايا ذات الأهمية عن أقسام الأنسجة النسيجية دون الحاجة إلى المعالجة الأنزيمية أو النمو في الثقافة. وهذا يعني أن الخلايا في موطن الأنسجة الطبيعية، وأنه يتم الاحتفاظ بنية الأنسجة بما في ذلك العلاقة المكانية بين الخلايا المختلفة. يتم الحفاظ على مورفولوجيا كل من الخلايا التي تم التقاطها والأنسجة المتبقية بشكل جيد، ويمكن أخذ عينات من العديد من مكونات الأنسجة بالتتابع من نفس الشريحة. ويمكن بعد ذلك استخدام الخلايا المعزولة للتحليل اللاحق لمحتوى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتين أو المستقلب2و3.
من أجل تحليل التعبير الجيني في مختلف مجموعات الخلايا، أو بعد علاجات مختلفة، فمن الضروري الحصول على mRNAs من نوعية وكمية كافية للتحليل اللاحق4،5. على النقيض من الحمض النووي، RNAs هي أكثر حساسية للتثبيت ويوصى باستخدام الأنسجة المجمدة عندما يكون الهدف هو دراسة الحمض النووي الريبي. وبما أن هذه الحالات تتدهور بسرعة بسبب الريبونوكليس (RNase) في كل مكان، فإن هناك حاجة إلى شروط صارمة خالية من RNase أثناء مناولة العينات وإعدادها وتجنب تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التقنيات السريعة دون أي خطوات مرحلة مائية طويلة هي حاسمة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي6. ويمكن أيضا أن تتأثر العائد RNA والنزاهة من قبل عملية LCM ونظام LCM المستخدمة7،8. حاليا، أربعة أنظمة LCM مع مبادئ التشغيل المختلفة متاحة2. طريقة استخراج الحمض النووي الريبي يمكن أيضا أن تكون مهمة، منذ تم اختبار مجموعات العزل RNA مختلفة مع اختلافات كبيرة في كمية الحمض النووي الريبي ونوعية7،8.
أي طريقة لإعداد الأنسجة تتطلب إيجاد توازن بين الحصول على تباين مورفولوجي جيد والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي لمزيد من التحليلات. لإعداد أقسام المجمدة من العظام، تم تطوير فيلم لاصق وتحسينها باستمرار9. يتم قطع أقسام العظام وملطخة مباشرة على فيلم لاصق. هذا الفيلم لاصق ينطبق على العديد من أنواع تلطيخ، ويمكن استخدامها لعزل الخلايا ذات الفائدة من استئصال التبريد العظام باستخدام LCM9،10،11،12،13، 14. جميع الخطوات بما في ذلك الإزالة الجراحية، والتضمين، وتجميد، وقطع وتلطيخ يمكن أن تكتمل في أقل من ساعة واحدة. الأهم من ذلك، يمكن تحديد الخلايا مثل osteoblasts، خلايا بطانة العظام، وosteoclasts بوضوح9،10،11، 12،13،14. هذه الطريقة لديها ميزة كونها سريعة وبسيطة. وهناك طريقة بديلة لتوليد العظام التبريد هو استخدام نظام نقل الشريط15. ومع ذلك، فإن هذه التقنية الأخيرة هي أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب أجهزة إضافية، حيث أن الأقسام يجب أن تنقل من شريط لاصق على الشرائح غشاء المغلفة مسبقا عن طريق الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) عبر الربط. على الرغم من أن نظام نقل الشريط قد اقترن بنجاح مع LCM16،17،18،19،تجدر الإشارة إلى أن طلاء عبر مرتبطة يمكن أن تخلق نمط الخلفية التي يمكن أن تتداخل مع خلية من نوع تعريف20.
عادة، يتم استخراج كميات صغيرة فقط من الحمض النووي الريبي من الخلايا المجهرية، وغالبا ما يتم تقييم نوعية وكمية الحمض النووي الريبي بواسطة الكهربائي الشعيرات الدقيقة21. يتم استخدام برنامج كمبيوتر لتعيين فهرس الجودة لمقتطفات RNA يسمى رقم تكامل RNA (RIN). تشير قيمة RIN البالغة 1.0 إلى الحمض النووي الريبي المتدهور تمامًا، بينما تشير قيمة 10.0 إلى أن الحمض النووي الريبي سليم تمامًا22. عادة, اعتبرت فهرسات على 5 كاف ل [رنا] دراسات. وقد تم الإبلاغ عن أنماط التعبير الجيني في عينات تبلغ قيمتها RIN 5.0-10.0 لترتبط بشكل جيد مع بعضها البعض23. على الرغم من أن حساسية هذه الطريقة عالية، حيث يمكن الكشف عن أقل من 50 pg/μL من إجمالي الحمض النووي الريبي، فإنه يمكن أن يكون من الصعب جدا الحصول على تقييم الجودة إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي في العينة منخفض جدا. لذلك، من أجل تقييم جودة الحمض النووي الريبي، وغالبا ما يستخدم قسم الأنسجة المتبقية بعد LCM لاستخراج RNA، عن طريق أنبوب العازلة على الشريحة24.
على الرغم من أن LCM قد استخدمت على نطاق واسع على أنسجة مجمدة مختلفة، نادرا ما يتم الإبلاغ عن قيم RIN من RNAs المستخرجة. وعلاوة على ذلك، لا توجد دراسات مقارنة لتوضيح الطريقة الأنسب لدراسة الحمض النووي الريبي في عظام الماوس. في هذه الدراسة، تم استخدام أقسام مجمدة من عظم الفخذ الماوس الكبار لتحسين إعداد العينة، بروتوكول LCM واستخراج الحمض النووي الريبي من أجل الحصول على جودة عالية RNAs. وقد تم تحسين هذا البروتوكول بشكل خاص بالنسبة لنظام LCM الذي يستخدم الجاذبية لجمع العينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد استخدمت أنسجة العظام من الفئران في التقيد الصارم مع المبادئ التوجيهية السائدة لرعاية الحيوانات، وبذلت جميع الجهود للحد من معاناة الحيوانات.
1. الحيوانات وتجميد التضمين
- منزل الحيوانات في ظروف من درجة حرارة الغرفة ثابتة (RT؛ 24 درجة مئوية) ودورة مظلمة 12 ساعة/ 12 ساعة مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
ملاحظة: تم الحصول على أنسجة العظام في هذه الدراسة من 3 أشهر من الذكور من النوع البري C57BL/6 الفئران. - في النيوروبسوبيك، الفئران exsanguinate من الوريد في البطن كافا تحت التخدير العام (الكيتامين / xylazine، 100/6 ملغ / كغ داخل اقبية).
ملاحظة: من أجل تجنب تدهور الحمض النووي الريبي، استخدم الأدوات والمواد الخالية من RNase، وارتداء القفازات والعمل بسرعة تجنب تخزين العينات في RT طوال التجربة بأكملها. - إزالة عظم الفخذ كله بسرعة، وتنظيفها من الأنسجة الرخوة المحيطة باستخدام مشرط والمناشف الورقية. صب درجة الحرارة المثلى (OCT) مركب في القالب التضمين، ووضع عظم الفخذ في الجزء السفلي من العفن التضمين. التقط تجميد العينات في النيتروجين السائل. OCT شفافة في RT والأبيض عندما المجمدة.
- مرة واحدة المجمدة تماما، والتفاف العينات في احباط ونقلها على الجليد الجاف إلى -80 درجة مئوية. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
2- إعداد القسم
- تعيين درجة الحرارة في cryostat إلى -19 درجة مئوية وصاحب كتلة إلى -17 درجة مئوية. مسح الداخلية cryostat باستخدام الإيثانول 70٪. ضع النصل المتاح للأنسجة الصلبة، والشرائح الزجاجية وأداة تركيب في cryostat لتبرد. أبقهم داخل الـ(كريوستات) طوال فترة الاستئصال
- نقل كتلة الأنسجة المجمدة على الجليد الجاف إلى cryostat والسماح لها بالتوازن لمدة 10 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: تجنب الذوبان المتكرر وركوب الدراجات المتكررة من كتلة واحدة من -80 درجة مئوية إلى -19 درجة مئوية للتشريح بالتبريد. - اضغط على الجزء السفلي من القالب تضمين لدفع كتلة OCT للخروج من القالب. تطبيق ما يكفي من OCT المتوسطة إلى صاحب كتلة التمسك كتلة لذلك. انتظر حتى يتم تجميد وسيطة OCT بالكامل.
- ضع حامل الكتلة في حامل الكائن وتشديده في مكانه. ضبط موقف شفرة وتقليم كتلة باستخدام 15 درجة مئوية قطع الزيادات لإزالة OCT تغطي العينة. إذا تم قطع العينة في وقت سابق وتعرض السطح للهواء، تخلص من أول مقاطع أنسجة 2-3 من الكتلة.
- ضبط الكريوستات لتوليد 8 أقسام ميكرومتر وقطع 2-3 المقاطع المبردة التي سيتم التخلص منها (القلة الأولى عادة ما تكون أكثر سمكا من 8 ميكرومتر). وضع الفيلم لاصقة على كتلة واستخدام أداة المناسب لالتمسك الفيلم إلى كتلة. جعل خفض ببطء وبسرعة ثابتة عقد القسم من قبل الفيلم.
- ضع الفيلم (العينة التي تواجه) على الفور على شريحة زجاجية مبردة مسبقا (على شريط التبريد داخل cryostat) لتجنب ذوبان العينة. استخدام الشريط لإصلاح الفيلم إلى الشريحة الزجاجية لتسهيل تلطيخ. المضي قدما على الفور مع بروتوكول تلطيخ.
3. بروتوكول تلطيخ سريع
- إعداد 40 مل من الحلول التالية في أنابيب 50 مل ووضعها على الجليد: 95٪ الإيثانول، RNase خالية من المياه، 100٪ الإيثانول، 100٪ الإيثانول و 100٪ إكسيلين. تنفيذ جميع الخطوات على الجليد (باستثناء تلطيخ). لكل يوم تجريبي، قم بإعداد جميع الكواشف المائية الطازجة مع المياه الخالية من RNase.
تحذير: العمل في غطاء محرك السيارة لتجنب التسمم من قبل الزيلين. - أقسام الحضانة لمدة 30 s في 95٪ الإيثانول، ثم تراجع أقسام 30 s في المياه الخالية من RNase لإزالة OCT بعناية وتماما والتي قد تتداخل مع LCM وتطبيقات المصب.
- الاستغناء عن 50 درجة مئوية من البقع التجارية LCM القسم المجمدة(جدول المواد)على القسم، وحضانة لمدة 10 ثانية في RT واستنزاف من خلال وضع حافة الشريحة على ورقة الأنسجة ماصة. إزالة وصمة عار الزائدة عن طريق الرينز 30 s في الإيثانول 100٪.
- تزج أقسام العظام في أنبوب الثاني مع الإيثانول 100٪ لمدة 30 ثانية ونقلها إلى 100٪ إكسيلين لمدة 30 ثانية.
- وضع فيلم لاصق (عينة تواجه ما يصل) على الشريحة الزجاجية الجافة كدعم. الحرص على أن الفيلم لا تتأثر ووضعها مسطحة قدر الإمكان. لا تسمح للعينة أن تجف تماما.
- وضع شريحة إطار غشاء PET على ذلك. قريبا اضغط على إصبع القفاز على الغشاء لإرفاقه إلى الفيلم. ثم تقع العينة بين الغشاء والفيلم لاصقة. لا ينبغي طي الفيلم لاصقأو التجاعيد، وينبغي أن يكون هناك أي فقاعات الهواء بين الفيلم والغشاء. المضي قدما على الفور مع LCM.
4. الليزر التقاط قسم الميكروديس
- تنظيف المرحلة وحامل الغطاء من RNase باستخدام سطح decontaminant(جدول المواد). قم بتحميل الشريحة والقبعات في حامل الشريحة وحامل الغطاء، على التوالي.
- ضبط التركيز والحصول على نظرة عامة على الشريحة مع هدف 1.25x. تغيير إلى الهدف 40x وضبط التركيز. اختر منطقة الاهتمام باستخدام نظرة عامة على الشريحة. ضبط معلمات الليزر على النحو التالي: فتحة، 7؛ الليزر السلطة، 60؛ السرعة، 5؛ نبض التردد، 201؛ عينة ميزان, 20. تحسين هذه المعلمات لكل هدف.
- إذا فشل الليزر في قطع العينة، قم بزيادة طاقة الليزر. بدلا من ذلك، يمكن تطبيق الليزر أكثر من مرة. وبالإضافة إلى ذلك، فحص الهدف لبقع من تخفيضات غير مكتملة وإعادة رسم الخط في هذه البقع باستخدام الخيار نقل وقطع. حفظ إعدادات الليزر لتشريح الشرائح اللاحقة.
- حدد osteoblasts، osteocytes وخلايا بطانة العظام في العظام الفخذية البعيدة الملغاة أو القشرية على أساس معايير مورفولوجية. رسم خط لمسار الليزر بعيدا عن الخلايا المستهدفة لتقليل الضرر من أشعة الشمس فوق البنفسجية. قم بإجراء جميع عمليات الاستئصال الدقيقة في غضون أقل من ساعة واحدة بعد التلطيخ.
- جمع كل نوع الخلية في غطاء منفصل من أنبوب 0.5 مل.
ملاحظة: قد يؤدي الالتقاط الجاف بدلاً من استعادة السوائل إلى تجنب تدهور الحمض النووي الريبي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتبخر كميات صغيرة جدا من العازلة الواردة في غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير أو تتبلور (اعتمادا على تكوينها) خلال LCM. - تأكد من نجاح التقاط بواسطة مراقبة غطاء أنبوب التجميع بعد LCM حيثما ينطبق ذلك. المضي قدما على الفور مع استخراج الحمض النووي الريبي.
5. استخراج الحمض النووي الريبي
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر من العازلة lysis التي تحتوي على β-mercaptoethanol في غطاء أنبوب جمع وlyse العينة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا في الغطاء لمدة 1 دقيقة. إذا كانت عدة قبعات ستكون مجمعة، والحرص على أن الحجم الإجمالي للمخزن المؤقت هو كما هو موصى به لمجموعة استخراج RNA(جدول المواد).
تحذير: يجب إضافة β-mercaptoethanol لحماية الحمض النووي الريبي من التدهور، ولكن يعتبر ساما. ارتداء الملابس الواقية والقفازات والعمل في غطاء محرك السيارة. - وبالإضافة إلى ذلك، لكل شريحة إعداد واحد المسمى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الصغير مع 350 درجة مئوية من العازلة lysis التي تحتوي على β-mercaptoethanol. استخدم المقاطع المتبقية بعد LCM لاستخراج الحمض النووي الريبي. فصل بعناية الفيلم من الغشاء وlyse العينة عن طريق الأنابيب ببطء العازلة lysis على القسم عدة مرات.
ملاحظة: يجب أن يكون المبلغ الإجمالي للمخزن الاحتياطي للمل 350 درجة مئوية. لا تستخدم كل ذلك في وقت واحد للهضم كما أنها سوف تتدفق من الشريحة. -
وضع عينات lysate على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. - إذابة الليسات في RT. نقل lysates من الخلايا التي يتم حصادها LCM من أنابيب جمع في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. إذا تم استخدام أكثر من غطاء واحد لحصاد العينة، تجمع العديد من lysates.
- استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. علاج الأعمدة مع DNase الأول لإزالة الحمض النووي الجيني. الحمض النووي الريبي Elute مع 14 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase، مما أدى إلى 12 ميكرول eluate. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
6. قياس العائد RNA والنزاهة
- ذوبان الحمض النووي الريبي على الجليد الرطب. قياس العائد وسلامة RNA معزولة باستخدام الكهربائي الشعيرات الشعرية الدقيقة. تحميل إجمالي RNA (1 ميكرولتر لكل عينة) في رقاقة(جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام من عظم الفخذ الماوس. في البروتوكول الأمثل، تم قطع 8 ميكرومتر سميكة أقسام العظام المجمدة على فيلم لاصق وملطخة باستخدام بروتوكول سريع لوصمة عار القسم المجمدة LCM التجارية. وكانت العينة تقع بين غشاء PET والفيلم لاصقة. تم تشريح خلايا عظم الماوس باستخدام نظام LCM الذي يستخدم الجاذبية لجمع العينات. تم استخدام طريقة استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود للحصول على RNA عالية الجودة من العائد الكافي. تم قياس العائد والسلامة من الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام الكهربائي الشعيرات الشعرية الدقيقة(الشكل 1).
ويمكن رؤية الفرق في نوعية الحمض النووي الريبي والكمية التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكولات تحليل مختلفة في هلام ممثل والكهربائي. عندما تم تحليل العينة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا في الغطاء لمدة 1 دقيقة، كان من الممكن عزل ما يقرب من 8.5 نانوغرام من الحمض النووي الريبي من 1 مم2 أنسجة العظام microdissected (8 م-سميكة القسم). بلغت قيمة الراند اين 8.60 (الشكل 2).
بدلا من ذلك، تم تنفيذ LCM باستخدام نظام LCM الذي يستخدم نبض الليزر de-focused، الذي المنجنيق المواد في غطاء لاصق ة معلقة. ويمكن تقدير نوعية وكمية الحمض النووي الريبي في هلام ممثل والكهربائي. بالنسبة للعظام المجمدة الطازجة، كان من الممكن عزل حوالي 1.6 نانوغرام من الحمض النووي الريبي من 1 مم2 أنسجة العظام المجهرية (8 م-سميكة القسم). وكانت قيمة RIN 1(الشكل 3).
الشكل 1: مخطط انسيابي لبروتوكول إزالة الميكروديس بالليزر للعظام الطازجة المجمدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: جل تمثيلي (أعلى) ومخططات كهربائية (أسفل) من عينات الحمض النووي الريبي. تم تنفيذ LCM باستخدام نظام LCM الذي يستخدم الجاذبية لجمع العينات. وقد استُخرجت عينات من الحمض النووي الريبي من الأنسجة التي تم حصادها من قبل LCM (العينات 1 و3 و5 و7 و9) وأقسام التحكم المقابلة لها (العينات 2 و4 و6 و8 و10 على التوالي). تم استرداد عينة RNA واحدة من قسم التحكم الذي كان ملطخًا ولكن لم يتم استخدامه لـ LCM (العينة 11). تم تشريح مساحة إجمالية قدرها 1 مم2، واستخدمت بروتوكولات تحلل مختلفة. العينة 1: تم إضافة 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحليل الذي يحتوي على بيتا-ميركابتوإيثانول إلى الأنبوب. تم إغلاق الغطاء بعناية، وأنبوب مقلوب. تم تحليل الخلايا التي تم حصادها من قبل LCM عن طريق دوامة 1 دقيقة، وحضانة في RT لمدة 10 دقيقة ودوامة 1 دقيقة. وقد تم تحليل الخلايا التي تم حصادها من قبل LCM بواسطة أنابيب جمع الحضانة رأسا على عقب لمدة 30 دقيقة في RT. عينة 5: 50 درجة مئوية من العازلة lysis التي تحتوي على β-mercaptoethanol تم إضافةها إلى غطاء أنبوب جمع والعينة كان lysed عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا في الغطاء لمدة 1 دقيقة. تم طرد الليسات بالطرد المركزي وأضيف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للليسيس الذي يحتوي على بيتا -ميركابتوثانول إلى الأنبوب. عينة 7: 350 درجة مئوية من العازلة lysis التي تحتوي على β-mercaptoethanol أضيفت إلى الأنبوب. تم إغلاق الغطاء بعناية، وأنبوب مقلوب. تم غسل الخلايا التي تم حصادها من قبل LCM من قبل الدوامة وعكس عدة مرات. عينة 9: 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحليل الذي يحتوي على β-mercaptoethanol أضيفت إلى غطاء أنبوب جمع، وتكلفة العينة عن طريق الحضانة لمدة 5 دقائق في RT في الغطاء. تم طرد الليسات بالطرد المركزي، وأضيف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للlysis الذي يحتوي على بيتا-ميركابتوثانول إلى الأنبوب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: جل تمثيلي (أعلى) ومخططات كهربائية (أسفل) من عينات الحمض النووي الريبي. تم تنفيذ LCM باستخدام نظام LCM الذي يستخدم نبض الليزر de-focused، الذي المنجنيق المواد في غطاء لاصقة المتمركزة فوق القسم. وقد استُخرجت عينات من الحمض النووي الريبي من الأنسجة التي تم حصادها من قبل LCM (عيّنة 5 و6) وقسم التحكم المقابل (العينة 7). تم استرداد عينة RNA واحدة من قسم التحكم الذي كان ملطخًا ولكن لم يتم استخدامه لـ LCM (العينة 8). وتم تشريح المساحة الإجمالية البالغة 0.5 مم2 أو 1 مم2 (العينات 5 و6 على التوالي). 350 μL من العازلة lysis التي تحتوي على β-mercaptoethanol أضيفت إلى أنبوب جمع، تم إغلاق الغطاء بعناية وأنبوب مقلوب. وقد تم وضع الخلايا التي تم حصادها من قبل LCM من خلال احتضان أنابيب جمع رأسا على عقب لمدة 30 دقيقة في RT. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن تتأثر كل من نوعية وكمية الحمض النووي الريبي سلبا في جميع مراحل إعداد العينة مثل التلاعب في الأنسجة، عملية LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي. ولذلك، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني اللاحقة.
بالنسبة لـ LCM، تستخدم معظم المختبرات الأقسام 7-8 ميكرومتر سميكة2. ومن شأن أقسام أكثر سمكا تسمح حصاد المزيد من المواد. ومع ذلك، إذا كانت سميكة جدا، وهذا يمكن أن يقلل من القرار المجهري والليزر قد لا تكون قادرة على قطع من خلال. فمن المرجح أن سمك الأنسجة الأمثل يعتمد على نظام LCM (ونوع الليزر والشريحة) المستخدمة، وكذلك على الأنسجة في السؤال8،25. وفي هذه الدراسة، تم اختبار المقاطع بالتبريد من مختلف السماكة (4 أو 8 أو 12 ميكرومتر)؛ تم العثور على 8 أقسام سميكة ميكرومتر لتكون مثالية لLCM، في حين أن 12 أقسام العظام م كانت أكثر صعوبة لقطع مع الليزر و 4 أقسام ميكرومتر أعطى كميات أقل من الحمض النووي الريبي.
يختلف نشاط RNase الذاتية بين أنسجة مختلفة. ولذلك، فإن بروتوكولات تلطيخ وضعت للأنسجة مع نشاط RNase منخفضة جدا ً يمكن أن تكون غير مناسبة لأنواع الأنسجة الأخرى. واقترح النووية الحمراء السريعة26 وcresyl البنفسجي24 لتكون الأفضل من حيث الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. وبالإضافة إلى ذلك، كانت الطرق القائمة على الكحول متفوقة على البقع المائية للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، فقد عانوا من شدة تلطيخ لا يمكن استنساخها27. الوقت هو معلمة هامة للنظر. فمن ناحية، يكون الوقت اللازم للبحث عن الخلايا ذات الاهتمام في القسم وتحديدها، ولأداء الـ LCM طويلاً نسبياً في كثير من الأحيان. من ناحية أخرى، الوقت المتاح لLCM محدود، لأنه، في بعض الحالات، تم التوصل إلى 20٪ من تدهور الحمض النووي الريبي بعد 30 دقيقة28. لذلك، تم تطبيق أساليب مختلفة من أجل تثبيت الحمض النووي الريبي، مثل التعرض للأقسام لتدفق الأرجون خلال القسم المجهري28،أو استخدام البقعة الكحولية القائمة على البنفسج البنفسج تلطيخ والحفاظ على مستوى الرطوبة في المختبر منخفضة 27.وبالإضافة إلى ذلك، اقترح الحد الأقصى لمدة 15 دقيقة لخطوة microdissection2. في هذه الدراسة، كانت ملطخة أقسام العظام المجمدة باستخدام بروتوكول سريع لوصمة عار LCM التجارية، وحتى بعد 1 ساعة في RT، انخفضت قيم RIN من 8.3 إلى 9.1. لذلك، تم تنفيذ جميع microdissections في غضون أقل من 1 ساعة بعد تلطيخ. وبالإضافة إلى ذلك، تم اختبار بروتوكولات مختلفة للتلطيخ (مع أقصر الحضانة في الكواشف المائية أو بدون خطوة الزيلين). ولم يتحقق أي تحسن كبير في قيم RIN.
في دراسات LCM، تمت مقارنة نوعين مختلفين من أساليب استخراج الحمض النووي الريبي: طريقة فصل المرحلة مقابل طريقة تستند إلى العمود. تم العثور على أن طريقة استخراج الحمض النووي الريبي على أساس الأعمدة أدت إلى تحسين نوعية الحمض النووي الريبي وارتفاع العائد مقارنة مع طريقة فصل المرحلة8. في دراسة أخرى، مجموعة التجارية التي تستخدم الحد الأدنى من وقت الهضم ودرجة الحرارة (5 دقائق في RT) أدى إلى جودة الحمض النووي الريبي متفوقة بالمقارنة مع مجموعة العزل RNA التي تحتاج إلى وقت أطول الهضم في درجة حرارة أعلى (30 دقيقة في 42 درجة مئوية)7. في هذه الدراسة، كان من الممكن استخراج الحمض النووي الريبي عالية الجودة (RIN > 8) من تركيز كاف من عينات LCM باستخدام عظام الماوس المجمدة الطازجة وطريقة استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود. الليسياً الشامل (1 دقيقة في الغطاء) ضروري لعائد الحمض النووي الريبي الجيد. تأثير طريقة استخراج الحمض النووي الريبي على العائد RNA والنزاهة التي تم الحصول عليها بعد LCM تم التحقيق باستخدام عدة مجموعات عزل RNA مختلفة وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. ومع ذلك، تم الحصول على نوعية أفضل RNAs وزيادة الكمية مع مجموعة المستخدمة في البروتوكول الأمثل. وفي الدراسة التجريبية، قُطعت مناطق الأنسجة المجهرية التي تبلغ مساحتها 1 مم2، وكان من الممكن عزل حوالي 8.5 نانوغرام من الـ RNAs باستخدام أقسام العظام السميكة بـ 8 م(800 pg/μL). عادة، تم التقاط الخلايا العظمية، والخلايا العظمية، وخلايا بطانة العظام في 2-3 أقسام لكل عينة.
والمقارنات المباشرة بين مختلف أدوات إدارة المحتوى في المؤسسة نادرة. في دراسة واحدة، تم اختبار اثنين من الأدوات LCM المشتركة، والتي تختلف في نوع الليزر المستخدمة (الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء [الأشعة تحت الحمراء]، على التوالي) وطريقة التقاط الأنسجة (غطاء العزلة لاصقة مقابل قبعات المغلفة مع فيلم بالحرارة شفافة، على التوالي). تم العثور على أنه لأقسام الدماغ الماوس الطازجة المجمدة رقيقة، أدى نظام الأشعة تحت الحمراء في جودة الحمض النووي الريبي أعلىمتواضعة 7. وفي هذه الدراسة، تمت مقارنة نظامين من نظم إدارة المحتوى في المؤسسة يسمحان بجمع العينات الخالية من الاتصال. في نظام واحد، وعينة microdissected يسقط عن طريق الجاذبية في الغطاء وضعت أقل بقليل من29. نظام آخر يستخدم نبض الليزر de-focused، الذي المنجنيق المواد في غطاء معلقة30. بالنسبة للعظام المجمدة الطازجة، تم الحصول على كميات أعلى من الحمض النووي الريبي وقيم RIN عندما تم استخدام الجاذبية لالتقاط الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تكنولوجيا المنجنيق غير متوافقة مع "شطيرة" تتألف من فيلم لاصق، وقسم التبريد، وغشاء PET، وذلك بسبب الوزن الإضافي لغشاء PET.
LCM يتطلب الوصول المادي إلى سطح الأنسجة. لذلك، تصاعد وتغطية الزجاج للعينة غير قابل للتطبيق، مع نتيجة ضعف التصور من مورفولوجيا. للتغلب على هذا القيد، تم تطوير وسيلة غطاء السوائل31. بدلاً من ذلك، يمكن إضافة 10-15 درجة مئوية من الإيثانول مباشرة على قسم الأنسجة، مما يتيح تحليلاً مورفولوجياً أفضل قبل التبخر2. في هذه الدراسة، تم قطع أقسام العظام المجمدة على فيلم لاصق، وقبل أن يسمح للعينة لتجف تماما، كان يقع بين غشاء PET والفيلم. أعطى هذا الأسلوب "شطيرة" تباين مورفولوجي جيد وتم تحديد خلايا العظام محددة بوضوح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفان أوتي زيتز ونيكول جينر على مساعدتهما التقنية الممتازة، فضلاً عن موظفي فيتكور ومراقبة الحيوانات على دعمهما.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
