Summary
Un protocole de microdissection de capture laser (LCM) a été développé pour obtenir une quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression génique dans les cellules osseuses. L'étude actuelle se concentre sur les sections de fémur de souris. Cependant, le protocole LCM rapporté ici peut être utilisé pour étudier l'expression des gènes dans les cellules de tout tissu dur.
Abstract
Le rendement et l'intégrité de l'ARN sont décisifs pour l'analyse de l'ARN. Cependant, il est souvent techniquement difficile de maintenir l'intégrité de l'ARN tout au long de la procédure de microdissection de capture laser (LCM) entière. Étant donné que les études lCM fonctionnent avec de faibles quantités de matériel, les préoccupations au sujet des rendements limités de l'ARN sont également importantes. Par conséquent, un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression de gène dans les cellules d'os. L'effet du protocole de coloration, de l'épaisseur des cryosections, de la quantité microdissé de tissu, du kit d'extraction d'ARN, et du système de LCM employé sur le rendement et l'intégrité d'ARN obtenus des cellules d'os microdissés a été évalué. Des sections d'os congelées de huit m d'épaisseur ont été fabriquées à l'aide d'un film adhésif et tachées à l'aide d'un protocole rapide pour une tache lCL commerciale. L'échantillon a été pris en sandwich entre une membrane de polyéthylène téphtalate (PET) et le film adhésif. Un système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d'échantillons et une méthode d'extraction de l'ARN à base de colonnes ont été utilisés pour obtenir des ARN de haute qualité de rendement suffisant. L'étude actuelle se concentre sur les sections de fémur de souris. Cependant, le protocole lCM rapporté ici peut être employé pour étudier l'expression in situ de gène dans les cellules de n'importe quel tissu dur dans les conditions physiologiques et les processus de la maladie.
Introduction
Les tissus sont constitués de types de cellules hétérogènes et distribuées spatialement. Différents types de cellules dans un tissu donné peuvent réagir différemment au même signal. Par conséquent, il est essentiel d'être en mesure d'isoler des populations cellulaires spécifiques pour l'évaluation du rôle des différents types de cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. La microdissection de capture au laser (LCM) offre une méthode relativement rapide et précise pour isoler et enlever les cellules spécifiées des tissus complexes1. Les systèmes LCM utilisent la puissance d'un faisceau laser pour séparer les cellules d'intérêt des sections de tissus histologiques sans avoir besoin de traitement enzymatique ou de croissance de la culture. Cela signifie que les cellules sont dans leur habitat tissulaire naturel, et que l'architecture tissulaire, y compris la relation spatiale entre les différentes cellules est conservée. La morphologie des cellules capturées et du tissu résiduel est bien préservée, et plusieurs composants tissulaires peuvent être échantillonnés séquentiellement à partir de la même diapositive. Les cellules isolées peuvent ensuite être utilisées pour l'analyse ultérieure de leur ARN, ADN, protéines ou métabolites2,3.
Afin d'analyser l'expression des gènes dans différentes populations cellulaires, ou après différents traitements, il est nécessaire d'obtenir des ARNm de qualité et de quantité suffisantes pour l'analyse ultérieure4,5. Contrairement à l'ADN, les ARN sont plus sensibles à la fixation et l'utilisation de tissus congelés est recommandée lorsque l'objectif est d'étudier l'ARN. Étant donné que les ARNm sont rapidement dégradées par des ribonucalis omniprésents (RNase), des conditions strictes sans RNase pendant la manipulation et la préparation des échantillons et d'éviter le stockage des échantillons à température ambiante sont nécessaires. En outre, les techniques rapides sans aucune étape aqueuse prolongée de phase sont cruciales pour empêcher la dégradation d'ARN6. Le rendement et l'intégrité de l'ARN peuvent également être affectés par le processus LCM et le système LCM utilisé7,8. Actuellement, quatre systèmes LCM avec des principes d'exploitation différents sont disponibles2. La méthode d'extraction de l'ARN peut également être importante, puisque différents kits d'isolement d'ARN ont été testés avec des différences significatives dans la quantité et la qualité d'ARN7,8.
Toute méthode de préparation des tissus nécessite de trouver un équilibre entre l'obtention d'un bon contraste morphologique et le maintien de l'intégrité de l'ARN pour d'autres analyses. Pour la préparation des sections congelées de l'os, un film adhésif a été développé et continuellement amélioré9. Les sections osseuses sont coupées et tachées directement sur le film adhésif. Ce film adhésif est applicable à de nombreux types de coloration, et peut être utilisé pour isoler les cellules d'intérêt de cryosections osseuses en utilisant LCM9,10,11,12,13, 14. Toutes les étapes, y compris l'ablation chirurgicale, l'intégration, la congélation, la coupe et la coloration peuvent être complétées en moins d'une heure. Fait important, les cellules telles que les ostéoblastes, les cellules de doublure osseuse, et les ostéoclastes peuvent être clairement identifiés9,10,11,12,13,14. Cette méthode a l'avantage d'être rapide et simple. Une autre méthode pour générer des cryosections osseuses est d'utiliser le système de transfert de bande15. Cependant, cette dernière technique prend plus de temps et nécessite une instrumentation supplémentaire, puisque les sections doivent être transférées du ruban adhésif sur des glissières de membrane précouchées par liaison croisée ultraviolette (UV). Bien que le système de transfert de bande a été couplé avec succès avec LCM16,17,18,19, il convient de noter que le revêtement relié transversal peut créer un modèle de fond qui peut interférer avec l'identification de type cellulaire20.
Typiquement, seulement de petites quantités d'ARN sont extraites des cellules microdissés, et la qualité et la quantité d'ARN sont souvent évaluées par électrophorèse micro-capillaire21. Un programme informatique est utilisé pour attribuer un indice de qualité aux extraits d'ARN appelés numéro d'intégrité de l'ARN (RIN). Une valeur RIN de 1,0 indique l'ARN complètement dégradé, tandis qu'une valeur de 10,0 suggère que l'ARN est entièrement intact22. Habituellement, les indices de plus de 5 sont considérés comme suffisants pour les études d'ARN. Des modèles d'expression génique dans des échantillons d'une valeur RIN de 5,0 à 10,0 ont été rapportés en corrélation entreeux 23. Bien que la sensibilité de cette méthode soit élevée, puisque l'on peut détecter à moins de 50 pg/L d'ARN total, il peut être très difficile d'obtenir une évaluation de la qualité si la concentration d'ARN dans l'échantillon est très faible. Par conséquent, afin d'évaluer la qualité de l'ARN, la section tissulaire restante après le LCM est souvent utilisée pour extraire l'ARN, en tampon pipetting sur la diapositive24.
Bien que le LCM ait été largement utilisé sur différents tissus congelés, les valeurs RIN des ARN extraites sont rarement rapportées. En outre, il n'existe pas d'études comparatives pour clarifier la méthode la plus appropriée pour étudier l'ARN dans les os de souris. Dans la présente étude, des sections congelées de fémurs de souris adultes ont été utilisées pour optimiser la préparation de l'échantillon, le protocole LCM et l'extraction de l'ARN afin d'obtenir des ARN de haute qualité. Le protocole actuel a été optimisé en particulier pour le système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d'échantillons.
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Protocol
Le tissu osseux des souris a été employé dans le strict respect des directives en vigueur pour des soins d'animal et tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum la souffrance animale.
1. Animaux et Congeler l'intégration
- Maison des animaux dans des conditions de température ambiante constante (RT; 24 oC) et d'un cycle sombre de 12 h/12 h avec accès gratuit à la nourriture et à l'eau.
REMARQUE: Des tissus osseux dans cette étude ont été obtenus à partir de souris sauvages mâles de type C57BL/6 de 3 mois. - À l'autopsie, exsanguinate souris de la veine abdominale cava sous anesthésie générale (kétamine/xylazine, 100/6 mg/kg intrapéritonéal).
REMARQUE: Afin d'éviter la dégradation de l'ARN, utilisez des instruments et des matériaux sans NNase, portez des gants et travaillez rapidement en évitant le stockage des échantillons à RT tout au long de l'expérience. - Enlever les fémurs entiers rapidement, les nettoyer des tissus mous environnants à l'aide de scalpel et de papier essuie-tout. Verser la température de coupe optimale (OCT) composé dans le moule d'encastrement, et mettre le fémur dans le fond du moule d'intégration. Congelez les échantillons dans de l'azote liquide. OCT est transparent à RT et blanc lorsqu'il est congelé.
- Une fois entièrement congelés, envelopper les échantillons dans du papier d'aluminium et les transférer sur de la glace sèche à -80 oC. Conserver les échantillons à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient traités.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Préparation de la section
- Fixer la température dans le cryostat à -19 oC et du bloc à -17 oC. Essuyez l'intérieur du cryostat à l'aide de 70 % d'éthanol. Placez la lame jetable pour les tissus durs, les lames de verre et un outil d'ajustement dans le cryostat pour refroidir. Gardez-les à l'intérieur du cryostat pendant toute la durée de la section.
- Transférer le bloc de tissu congelé sur la glace sèche au cryostat et lui permettre d'équilibrer pendant au moins 10 min.
REMARQUE: Évitez le dégel répétitif et le cycle fréquent d'un bloc de -80 oC à -19 oC pour la cryosection. - Appuyez sur le fond du moule d'intégration pour pousser le bloc OCT hors du moule. Appliquer suffisamment de milieu OCT au support de bloc pour y adhérer le bloc. Attendez que le milieu OCT soit complètement congelé.
- Placez le support de bloc dans le support d'objet et serrez-le en place. Ajustez la position de la lame et coupez le bloc à l'aide d'incréments de coupe de 15 m pour enlever l'OCT couvrant l'échantillon. Si l'échantillon a été coupé plus tôt et que la surface est exposée à l'air, jetez les premières sections de tissu de 2 à 3 du bloc.
- Ajustez le cryostat pour générer des sections de 8 m et coupez des cryosections de 2 à 3 qui seront jetées (les premières seront généralement plus épaisses que 8 m). Placez le film adhésif sur le bloc et utilisez un outil approprié pour adhérer au film au bloc. Faire la coupe lentement et à une vitesse constante en tenant la section par le film.
- Placez le film (échantillon face vers le haut) immédiatement sur une lame de verre prérefroidie (sur la cryobar dans le cryostat) pour éviter la décongélation de l'échantillon. Utilisez du ruban adhésif pour fixer le film à la glissière de verre pour une coloration plus facile. Procédez immédiatement avec le protocole de coloration.
3. Protocole de coloration rapide
- Préparer 40 ml des solutions suivantes dans des tubes de 50 ml et les mettre sur la glace : 95 % d'éthanol, de l'eau sans RNase, 100 % de l'éthanol, 100 % de l'éthanol et 100 % de la xylène. Effectuer toutes les étapes sur la glace (sauf la coloration). Pour chaque journée expérimentale, préparez tous les réactifs aqueux frais avec de l'eau sans RNase.
MISE EN GARDE: Travaillez dans le capot pour éviter l'intoxication par le xylène. - Incuber des sections pour 30 s dans 95 % d'éthanol, puis tremper les sections 30 s dans de l'eau sans RNase pour enlever l'OCT avec soin et complètement, ce qui peut interférer avec les applications lCLet et en aval.
- Distribuer 50 l de tache commerciale de section congelée LCM (Table of Materials) sur la section, incuber pendant 10 s à RT et le vider en plaçant le bord de la glissière sur du papier de soie absorbant. Enlever l'excès de taches en rinçant 30 s dans 100% d'éthanol.
- Immerger les sections osseuses dans un deuxième tube avec 100% d'éthanol pour 30 s et les transférer à 100% xylène pour 30 s.
- Mettre le film adhésif (échantillon orienté vers le haut) sur la glissière en verre sec comme support. Veillez à ce que le film ne soit pas touché et placé aussi plat que possible. Ne laissez pas l'échantillon sécher complètement.
- Placez une glissière à membrane PET. Appuyez rapidement sur un doigt ganté sur la membrane pour l'attacher au film. L'échantillon est ensuite pris en sandwich entre la membrane et le film adhésif. Le film adhésif ne doit pas être plié ou ridé et il ne devrait pas y avoir de bulles d'air entre le film et la membrane. Procédez immédiatement avec le LCM.
4. Microdissection de capture de laser
- Nettoyer la scène et le porte-capuchon de RNase à l'aide de décontaminant de surface (Tableau des matériaux). Chargez la glissière et les bouchons dans le porte-glissière et le porte-capuchon, respectivement.
- Ajuster la mise au point et acquérir aperçu diapositive avec 1.25x objectif. Changer à l'objectif 40x et ajuster la mise au point. Choisissez la zone d'intérêt à l'aide de la vue d'ensemble de la diapositive. Ajuster les paramètres laser comme suit : ouverture, 7; puissance laser, 60; vitesse, 5; fréquence des impulsions, 201; bilan des spécimens, 20. Optimisez ces paramètres pour chaque objectif.
- Si le laser ne parvient pas à couper l'échantillon, augmentez la puissance du laser. Alternativement, le laser peut être appliqué plus d'une fois. En outre, inspectez la cible pour les taches de coupes incomplètes et re-dessiné la ligne dans ces endroits en utilisant l'option Déplacer et couper. Enregistrez les réglages laser pour la dissection des diapositives suivantes.
- Sélectionnez les ostéoblastes, les ostéocytes et les cellules de la muqueuse osseuse dans des os antémaux ou corticales fétaux distaux en fonction de critères morphologiques. Tracez une ligne pour la trajectoire laser plus loin des cellules cibles pour minimiser les dommages causés par le laser UV. Effectuer toutes les microdissections en moins de 1 h après la coloration.
- Recueillir chaque type de cellule dans un bouchon séparé d'un tube de 0,5 ml.
REMARQUE: La capture sèche au lieu de la récupération liquide peut éviter la dégradation de l'ARN. En outre, de très petits volumes de tampon contenus dans le bouchon du tube de microcentrifuge peuvent s'évaporer ou se cristalliser (selon sa composition) pendant le LCM. - Confirmer le succès de capture par l'observation du bouchon du tube de collecte après le LCM le cas échéant. Procédez immédiatement avec l'extraction de l'ARN.
5. Extraction d'ARN
- Distribuer 50 l de la mémoire tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol dans le bouchon du tube de collecte et lyser l'échantillon en faisant monter et descendre le bouchon pendant 1 min. Faites glisser le lysate et ajoutez 300 oL du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol dans le tube. Si plusieurs bouchons vont être mis en commun, veillez à ce que le volume total de tampon soit recommandé pour le kit d'extraction de l'ARN(Tableau des matériaux).
ATTENTION : Le mercaptoéthanol doit être ajouté pour protéger l'ARN de la dégradation, mais il est considéré comme toxique. Portez des vêtements et des gants de protection et travaillez dans le capot. - De plus, pour chaque diapositive, préparez un tube de microcentrifuge de 1,5 ml étiqueté avec 350 l de la mémoire tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol. Utilisez les sections restantes après le LCM pour extraire l'ARN. Séparez soigneusement le film de la membrane et lysez l'échantillon en pipetting lentement le tampon de lyse sur la section à plusieurs reprises.
REMARQUE: La quantité totale de tampon de lyse doit être de 350 l. Ne pas l'utiliser tout à la fois pour la digestion car il s'écoulera de la diapositive. -
Déposer les échantillons de lysate sur de la glace sèche et les conserver à -80 oC.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. - Décongeler les lysates à RT. Transférer les lysates des cellules récoltées par LCM des tubes de collecte dans les tubes microcentrifugede de 1,5 ml. Si plus d'un bouchon a été utilisé pour récolter l'échantillon, encommunlez plusieurs lysates.
- Extraire l'ARN selon les instructions du fabricant. Traiter les colonnes avec DNase I pour enlever l'ADN génomique. Armoirie d'Elute avec 14 l d'eau sans RNase, résultant en une eluate de 12 L. Conserver l'ARN à -80 oC.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
6. Mesure du rendement et de l'intégrité de l'ARN
- Décongeler l'ARN sur la glace humide. Mesurer le rendement et l'intégrité de l'ARN isolé à l'aide d'électrophorèse micro-capillaire. Chargez l'ARN total (1 L par échantillon) dans une puce (Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
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Representative Results
Un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression de gène dans les cellules d'os des fémurs de souris. Dans le protocole optimisé, des sections d'os congelées de 8 m d'épaisseur ont été coupées sur un film adhésif et tachées à l'aide d'un protocole rapide pour une tache commerciale de section gelée lUM. L'échantillon a été pris en sandwich entre la membrane PET et le film adhésif. Les cellules osseuses de souris ont été microdissés à l'aide d'un système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d'échantillons. Une méthode d'extraction d'ARN basée sur la colonne a été utilisée pour obtenir un ARN de haute qualité de rendement suffisant. Le rendement et l'intégrité de l'ARN isolé ont été mesurés à l'aide d'électrophorèse microcapillaire(figure 1).
La différence dans la qualité et la quantité d'ARN obtenues en utilisant différents protocoles de lyse peut être vue dans le gel représentatif et les électrophéromies. Lorsque l'échantillon a été lysé par pipetting de haut en bas dans le bouchon pendant 1 min, il a été possible d'isoler environ 8,5 ng d'ARN à partir de 1 mm2 tissu osseux microdissé (8 m d'épaisseur section). La valeur du RIN était de 8,60 (figure 2).
Alternativement, LCM a été exécuté utilisant un système de LCM qui emploie l'impulsion laser défocalisée, qui catapulte le matériel dans le capuchon adhésif en surplomb. La qualité et la quantité d'ARN peuvent être estimées dans le gel représentatif et les électrophéromies. Pour les os frais congelés, il était possible d'isoler environ 1,6 ng d'ARN à partir d'un m2 de tissu osseux microdissé (8 m d'épaisseur). La valeur RIN était de 1 (figure 3).
Figure 1 : Diagramme de flux du protocole de microdissection de capture laser pour les os fraîchement congelés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Gel représentatif (en haut) et électrophéromies (en bas) d'échantillons d'ARN. LCM a été exécuté utilisant un système de LCM qui utilise la gravité pour la collecte d'échantillon. Des échantillons d'ARN ont été prélevés dans des tissus récoltés par LCM (échantillons 1, 3, 5, 7 et 9) et dans les sections témoins correspondantes (échantillons 2, 4, 6, 8 et 10, respectivement). Un échantillon d'ARN a été prélevé dans la section témoin qui était tachée mais qui n'a pas été utilisée pour le LCM (échantillon 11). Une superficie totale de 1 mm2 a été microdissé, et différents protocoles de lyse ont été utilisés. Échantillon 1 : 350 l du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol de l'estactogène ont été ajoutés dans le tube. Le bouchon a été fermé soigneusement, et le tube inversé. Les cellules récoltées par LCM ont été lysées par le vortex de 1 min, l'incubation à RT pendant 10 min et le vortex de 1 min. Échantillon 3: 350 l du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol a été ajouté dans le tube de collecte, le bouchon a été soigneusement fermé, et le tube inversé. Les cellules récoltées par l'ACL ont été lysées par des tubes de collecte d'incubation à l'envers pendant 30 min à RT. Échantillon 5 : 50 ll du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol a été ajouté dans le bouchon du tube de collecte et l'échantillon a été lysé par pipetting de haut en bas dans le bouchon pendant 1 min. Le lysate a été centrifugé et 300 l du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol a été ajouté dans le tube. Échantillon 7 : 350 L du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol a été ajouté dans le tube. Le bouchon a été fermé soigneusement, et le tube inversé. Les cellules récoltées par LCM ont été lysées par le vortex et l'inversion à plusieurs reprises. L'échantillon de 9 : 50 l du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol a été ajouté dans le bouchon du tube de collecte, et l'échantillon a été lysé par incubation pendant 5 min à RT dans le bouchon. Le lysate a été centrifugé, et 300 l du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol a été ajouté au tube. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Gel représentatif (en haut) et électrophéromies (en bas) d'échantillons d'ARN. LCM a été exécuté utilisant un système de LCM qui emploie l'impulsion laser défocalisée, qui catapulte le matériel dans le capuchon adhésif placé au-dessus de la section. Des échantillons d'ARN ont été prélevés sur des tissus récoltés par LCM (échantillons 5 et 6) et dans la section témoin correspondante (échantillon 7). Un échantillon d'ARN a été prélevé dans la section témoin qui était tachée mais qui n'a pas été utilisée pour le LCM (échantillon 8). Une superficie totale de 0,5 mm2 ou 1 mm2 a été microdissé (échantillons 5 et 6, respectivement). 350 l de la mémoire tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol a été ajoutée dans le tube de collecte, le bouchon a été soigneusement fermé et le tube inversé. Les cellules récoltées par LCM ont été lysées en couvant des tubes de collecte à l'envers pendant 30 min à RT. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La qualité et la quantité d'ARN peuvent être affectées négativement à toutes les étapes de la préparation d'échantillon telle que la manipulation de tissu, le processus de LCM, et l'extraction d'ARN. Par conséquent, un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse suivante d'expression de gène.
Pour l'AmC, la plupart des laboratoires utilisent des sections de 7 à 8 m d'épaisseur2. Des sections plus épaisses permettraient de récolter plus de matériel. Cependant, s'ils sont trop épais, cela pourrait réduire la résolution microscopique et le laser peut ne pas être en mesure de couper à travers. Il est probable que l'épaisseur optimale des tissus dépend du système LCM (et du type laser et diapositive) utilisé, ainsi que du tissu en question8,25. Dans la présente étude, des cryosections de différentes épaisseurs (4, 8 ou 12 m) ont été testées; Les sections de 8 m d'épaisseur se sont avérées idéales pour le LCM, tandis que les sections d'os de 12 m étaient plus difficiles à couper avec le laser et les sections de 4 m ont donné des quantités inférieures d'ARN.
L'activité endogène de RNase varie entre les différents tissus. Par conséquent, les protocoles de coloration développés pour les tissus avec l'activité très basse de RNase pourraient être impropres à d'autres types de tissu. Nucléaire rapide rouge26 et cresyl violet24 ont été suggérés pour être le meilleur en termes de préservation de l'intégrité de l'ARN. En outre, les méthodes à base d'alcool étaient supérieures aux taches aqueuses pour maintenir l'intégrité d'ARN. Cependant, ils ont souffert de l'intensité irréproductible de coloration27. Le temps est un paramètre important à considérer. D'une part, le temps nécessaire pour rechercher et identifier les cellules d'intérêt dans la section, et pour effectuer l'IlMC est souvent relativement long. D'autre part, le temps disponible pour LCM est limité, puisque, dans certains cas, 20% de dégradation de l'ARN a été atteint après 30 min28. Par conséquent, différentes méthodes ont été appliquées afin de stabiliser l'ARN, comme l'exposition de sections au flux d'argon pendant la microdissection28, ou l'utilisation de colorants violets à base d'alcool tamponnés et le maintien du niveau d'humidité dans le laboratoire faible 27. En outre, un maximum de 15 min pour l'étape de microdissection a été suggéré2. Dans cette étude, les sections d'os congelées ont été souillées utilisant un protocole rapide pour une tache commerciale de LCM, et même après 1 h à RT, les valeurs de RIN ont diminué de 8.3 à 9.1. Par conséquent, toutes les microdissections ont été exécutées dans moins de 1 h après coloration. En outre, différents protocoles de coloration ont été testés (avec des incubations plus courtes dans des réactifs aqueous ou sans l'étape xylène). Aucune amélioration significative des valeurs RIN n'a été réalisée.
Dans les études de LCM, deux types différents de méthodes d'extraction d'ARN ont été comparés : une méthode de séparation de phase contre une méthode basée sur la colonne. Il a été constaté que la méthode d'extraction de l'ARN basée sur des colonnes a conduit à une meilleure qualité de l'ARN et un rendement plus élevé par rapport à la méthode de séparation de phase8. Dans une autre étude, un kit commercial qui utilise un temps et une température de digestion minimes (5 min à RT) a donné lieu à une qualité supérieure de l'ARN par rapport à une trousse d'isolement de l'ARN qui nécessite un temps de digestion plus long à température plus élevée (30 min à 42 oC)7. Dans la présente étude, il a été possible d'extraire de l'ARN de haute qualité (RIN et 8) de concentration suffisante à partir d'échantillons de LCM à l'aide d'os de souris fraîchement congelés et d'une méthode d'extraction d'ARN à base de colonnes. Lyse approfondie (1 min pipetting dans le bouchon) est essentielle pour un bon rendement de l'ARN. L'effet de la méthode d'extraction de l'ARN sur le rendement et l'intégrité de l'ARN obtenu après que LCM a été étudié à l'aide de plusieurs kits d'isolement d'ARN différents selon les instructions des fabricants. Cependant, des ARN de meilleure qualité et une quantité accrue ont été obtenus avec le kit utilisé dans le protocole optimisé. Dans l'étude pilote, des régions tissulaires microdissés de 1 mm2 ont été coupées, et il a été possible d'isoler environ 8,5 ng d'ARN à l'aide de sections osseuses de 8 m d'épaisseur (environ 800 pg/L). Typiquement, les ostéoblastes, les ostéocytes, et les cellules de doublure d'os ont été capturés dans 2-3 sections par échantillon.
Les comparaisons directes entre les différents instruments LCM sont rares. Dans une étude, deux instruments LCM communs ont été testés, qui diffèrent dans le type de laser utilisé (UV et infrarouge [IR], respectivement) et la méthode de capture des tissus (capuchon d'isolement adhésif vs bouchons recouverts de film thermoplastique transparent, respectivement). Il a été constaté que pour les sections de cerveau de souris fraîchement sectionnées, le système IR a eu comme conséquence la qualité légèrement plus élevée d'ARN7. Dans la présente étude, deux systèmes De LCM qui permettent la collecte d'échantillons sans contact ont été comparés. Dans un système, l'échantillon microdissé tombe par gravité dans le bouchon placé juste en dessous de29. Un autre système utilise une impulsion laser défocalisée, qui catapulte le matériau dans le bouchon en surplomb30. Pour les os congelés frais, des quantités plus élevées d'ARN et des valeurs RIN ont été obtenues lorsque la gravité a été utilisée pour la capture des tissus. En outre, la technologie de catapultage n'est pas compatible avec le "sandwich" composé de film adhésif, cryo-section, et membrane PET, en raison du poids supplémentaire de la membrane PET.
LCM nécessite un accès physique à la surface du tissu. Par conséquent, le montage et le revêtement en verre du spécimen sont inapplicables, avec la conséquence de la visualisation altérée de la morphologie. Pour surmonter cette limitation, un milieu de couverture fluide a été développé31. Alternativement, 10 à 15 l d'éthanol peuvent être ajoutés directement sur la section des tissus, ce qui permet une meilleure analyse morphologique avant l'évaporation2. Dans la présente étude, des sections d'os congelées ont été coupées sur un film adhésif et, avant que l'échantillon ne soit complètement sec, il a été pris en sandwich entre la membrane PET et le film. Cette méthode de « sandwich » a donné le bon contraste morphologique et les cellules d'os spécifiques ont été clairement identifiées.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Ute Zeitz et Nikole Ginner pour leur excellente aide technique ainsi que le Vetcore et le personnel de soins aux animaux pour leur soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
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- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
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