Nuclei Isolation fra friske frosne hjernetumorer til Single-Nucleus RNA-seq og ATAC-seq
Summary
Intra-tumoral heterogenitet er et iboende træk ved tumorer, herunder gliomer. Vi udviklede en enkel og effektiv protokol, der bruger en kombination af buffere og gradient centrifugering til at isolere enkelt kerner fra friske frosne gliomvæv til enkelt kerne RNA og ATAC sekventering undersøgelser.
Abstract
Voksne diffuse gliomer udviser inter- og intra-tumor heterogenitet. Indtil for nylig har størstedelen af storstilet molekylær profileringsindsats fokuseret på bulktilgange, der førte til molekylær klassificering af hjernetumorer. I løbet af de sidste fem år, enkelt celle sekventering tilgange har fremhævet flere vigtige funktioner i gliomer. De fleste af disse undersøgelser har udnyttet friske hjernetumorprøver til at isolere enkeltceller ved hjælp af flowcytometri eller antistofbaserede separationsmetoder. Fremadrettet vil brugen af friskfrosne vævsprøver fra biobanker give større fleksibilitet til enkeltcelleapplikationer. Desuden, som encellet felt fremskridt, den næste udfordring vil være at generere multi-omics data fra enten en enkelt celle eller den samme prøve forberedelse til bedre optrævle tumor kompleksitet. Derfor vil enkle og fleksible protokoller, der tillader datagenerering til forskellige metoder såsom single-nucleus RNA sekventering (snRNA-seq) og enkelt kerne Assay for Transposase-Accessible Chromatin med høj-throughput sekventering (snATAC-seq) være vigtigt for feltet.
De seneste fremskridt inden for enkeltcelleområdet kombineret med tilgængelige mikrofluidiske instrumenter såsom 10x genomforskningsplatformen har lettet enkeltcelleapplikationer i forskningslaboratorier. For at studere hjernesvulst heterogenitet, vi udviklet en forbedret protokol for isolering af enkelt kerner fra friske frosne gliomer. Denne protokol fletter eksisterende enkeltcelleprotokoller og kombinerer et homogeniseringstrin efterfulgt af filtrering og buffermedieret gradientcentrifugering. De resulterende prøver er rene enkeltkerneaffjedring, der kan bruges til at generere enkeltkernegenekspression og kromatinadgangsdata fra samme kernepræparat.
Introduction
Diffuse lavere kvalitet gliomer (LGG), den mest almindelige primære hjernesvulst hos voksne, er infiltrerede neoplasmer, der ofte opstår på hjernehalvdelen. LGGs udviser både inter- og intra-tumor heterogenitet, som ikke kun drives af tumorpopulationen, men også af de ikke-maligne celler, der er indviklet involveret i tumorudvikling og progression1,2,3,4,5.
I løbet af det sidste årti har der været en lavine af genomiske data indsamlet inden for gliomer. Disse data stammer hovedsageligt fra bulk tumor sekventering undersøgelser og har bidraget enormt til den molekylære karakterisering, og den nuværende klassificering af hjernetumorer5,6,7,8,9,10,11. Men selv om disse undersøgelser afslørede det brede molekylære landskab forbundet med gliomer, er der stadig en skuffende mangel på fremskridt med hensyn til terapeutisk intervention. En af hindringerne for behandling resistens i hjernen tumorer er intra-tumor heterogenitet. For at løse dette problem har forskellige undersøgelser fokuseret på den genomiske, transskriptomiske, proteomiske og epigenetiske heterogenitet, der er til stede i en tumor på et enkelt celleniveau12,13,14,15,16,17.
Selv om der har været bemærkelsesværdige teknologiske fremskridt i enkeltcelleområdet i løbet af de sidste par år, er en af de vigtigste begrænsende faktorer tilgængeligheden af friske prøver, der er nødvendige for at isolere cellerne og udføre disse eksperimenter. For at overvinde denne begrænsning har der været flere vellykkede forsøg på at udføre analyser, såsom snRNA-seq og snATAC-seq fra frosne væv, ved hjælp af kerner i stedet for cellerne18,19. De fleste af disse metoder er afhængige af enten fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) eller filtreringsstrategier. Både enkelt celle og enkelt kerner tilgange har deres styrker og ulemper. Enkelt celle tilgange opretholde mitokondrie udskrifter, som selv kan være informativ, kan også reducere transcriptome dækning på grund af deres høje overflod. Enkelt kernei isolation tilgange fjerne en høj procentdel af mitokondrie fraktion, hvilket giver en mere dybdegående dækning af de nukleare udskrifter20.
Der er forskellige kommercielt tilgængelige platforme, der er blevet brugt i de seneste år til at analysere enkeltcellegenomdata, herunder RNA-seq og ATAC-seq. En af de mest fremtrædende platforme er 10x Genomics Chromium platform for enkeltcellet genekspression og enkeltcellet ATAC-profilering. Da platformen arbejder ved hjælp af mikrofluidiske kamre, kan snavs eller aggregater tilstoppe systemet, der fører til tab af data, reagenser og værdifulde kliniske prøver. Derfor afhænger succesen af enkeltcelleundersøgelser i høj grad af den nøjagtige isolering af enkeltceller / kerner.
Den protokol, som vi vil demonstrere heri, er en lidt modificeret kombination af DroNc-seq- og Omni-ATAC-seq-protokollerne og bruger en lignende tilgang til nylige undersøgelser, der bruger snRNA-seq til at forstå neurologiske lidelser og neuronale celletyper i den menneskelige hjerne18,19,21,22,23,24. Protokollen bruger en kombination af enzymatisk/mekanisk dissociation af frosne prøver efterfulgt af filtrering og gradient centrifugering og giver mulighed for hurtig og præcis isolering af enkelt kerner fra friske frosne gliomvæv. Vi har med succes brugt denne protokol til at generere snRNA-seq og snATAC-seq data fra samme kerner forberedelse fra hjernetumor prøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inden for intra-tumoral heterogenitet er på et spændende stadium, med nye analyser og platforme, der udvikles til at udfordre og udvide den eksisterende viden. Intra-tumoral heterogenitet er en afgørende faktor, der bidrager til sygdomsprogression og resistens over for de nuværende behandlingsmetoder i gliomer28. Nylige undersøgelser af hjernetumorer har fokuseret på dette vigtige aspekt ved hjælp af enkeltcellede transskriptoriske og epigenomiske analyser for bedre at karakterisere den cel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Single Cell Open Lab (scOpenLab) på German Cancer Center (DKFZ) for nyttige diskussioner. Denne forskning blev støttet af den tyske Cancer Aid, Max-Eder Program tilskud nummer 70111964 (S.T.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Referências
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
- Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
- Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
- Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
- Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
- Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Pesquisa do Câncer. 69 (24), 9157-9159 (2009).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer’s disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19 (2020).
- Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
- Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
- Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
- Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
- Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
- Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201 (2019).
