단일 핵 RNA-seq 및 ATAC-seq를 위한 신선한 냉동 뇌 종양에서 핵 절연
Summary
종양 내 이질성은 진모를 포함한 종양의 내재된 특징입니다. 우리는 단일 핵 RNA 및 ATAC 염기서열 분석 연구를 위한 신선한 동결 신경교종 조직에서 단 하나 핵을 격리하기 위하여 완충과 그라데이션 원심분리의 조합을 이용하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 개발했습니다.
Abstract
성인용 확산 글리오마는 종양 내 이질성을 나타낸다. 최근까지, 대규모 분자 프로파일링 노력의 대부분은 뇌종양의 분자 분류로 이어진 대량 접근에 초점을 맞추고있다. 지난 5 년 동안, 단세포 염기서열 분석 접근은 gliomas의 몇몇 중요한 특징을 강조했습니다. 이러한 연구의 대부분은 유동 세포측정또는 항체 기반 분리 방법을 사용하여 단일 세포를 격리하기 위해 신선한 뇌종양 표본을 활용하였다. 앞으로 바이오뱅크의 신선하게 냉동 된 조직 샘플을 사용하면 단일 세포 응용 분야에 더 큰 유연성을 제공 할 것입니다. 더욱이, 단세포 필드가 발전함에 따라, 다음 과제는 종양 복잡성을 더 잘 해명하기 위해 단일 세포 또는 동일한 샘플 제제로부터 다중 omics 데이터를 생성하는 것입니다. 따라서, 고처리량 시퀀싱(snATAC-seq)을 가진 트랜스포사제-접근 크롬틴을 위한 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq) 및 단일 핵 분석과 같은 다양한 방법에 대한 데이터 생성을 허용하는 간단하고 유연한 프로토콜이 이 분야에 중요할 것이다.
10x 유전체학 플랫폼과 같은 접근 가능한 미세 유체 계측기와 결합된 단세포 분야의 최근 발전은 실험실에서 단일 세포 응용을 용이하게 했다. 뇌종양 이질성을 연구하기 위해, 우리는 신선한 냉동 진모에서 단 하나 핵의 격리를 위한 향상된 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 기존 단일 셀 프로토콜을 병합하고 여과 및 버퍼 매개 그라데이션 원심분리가 뒤따르는 균질화 단계를 결합합니다. 결과 샘플은 동일한 핵 제제로부터 단일 핵 유전자 발현 및 크로마티닌 접근성 데이터를 생성하는 데 사용할 수 있는 순수한 단일 핵 현탁액이다.
Introduction
성인에서 가장 흔한 1 차 뇌종양인 확산 저학년 진모(LGG)는 종종 대뇌 반구에서 발생하는 침을 일으키는 신생물입니다. LGGs는 종양 집단뿐만 아니라 종양 발달 및 진행1,2,3,4,5에복잡하게 관여하는 비악성 세포에 의해 구동되는 종양 내 이질성 및 종양 내 이질성을 모두 나타낸다.
지난 10 년 동안, gliomas의 필드에 수집 된 게놈 데이터의 눈사태가 있었다. 이들 데이터는 주로 벌크 종양 시퀀싱 연구에서 비롯되며 분자 특성화, 그리고 뇌종양의 현재분류5,6,7,8,9,10,11에 대단히기여하였다. 그러나, 비록 이러한 연구는 gliomas와 관련 된 광범위 한 분자 풍경을 공개, 치료 개입에 관한 진행의 실망 스러운 부족 여전히 있다. 뇌종양의 치료 내성에 대한 장애물 중 하나는 종양 내 이질성입니다. 이 문제를 해결하기 위해, 다양한 연구는 단일 세포 수준12,13,14,15,16,17에서종양 내에 존재하는 게놈, 전사, 프로테오믹및후생유전학 이질성에 초점을 맞추고 있다.
지난 몇 년 동안 단일 세포 분야에서 놀라운 기술 발전이 있었지만, 주요 제한 요인 중 하나는 세포를 분리하고 이러한 실험을 수행하는 데 필요한 신선한 표본의 가용성입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 세포18,19가아닌 핵을 사용하여 냉동 조직에서 snRNA-seq 및 snATAC-seq와 같은 분석을 수행하는 데 몇 가지 성공적인 시도가 있었다. 이러한 방법의 대부분은 형광 활성화 세포 정렬 (FACS) 또는 여과 전략에 의존. 단일 세포와 단일 핵 접근법 모두 강점과 단점이 있습니다. 단세포 접근은 미토콘드리아 성적증명서를 유지하며, 이는 유익할지라도 높은 풍부성으로 인한 전사적 적용범위를 감소시킬 수 있다. 단일 핵 절연 접근법은 미토콘드리아 분획의 높은 비율을 제거하여 핵전사체(20)의보다 심층적인 커버리지를 허용한다.
RNA-seq 및 ATAC-seq를 포함하여 단세포 유전체학 데이터를 분석하기 위하여 최근에 이용된 각종 상업적으로 이용가능한 플랫폼이 있습니다. 가장 눈에 띄는 플랫폼 중 하나는 단일 세포 유전자 발현 및 단일 세포 ATAC 프로파일링을 위한 10x 유전체학 크롬 플랫폼입니다. 플랫폼이 미세 유체 챔버의 도움으로 작동함에 따라 모든 파편이나 골재는 데이터, 시약 및 귀중한 임상 샘플의 손실로 이어지는 시스템을 막을 수 있습니다. 따라서 단일 세포 연구의 성공은 주로 단일 세포/핵의 정확한 격리에 달려 있습니다.
본 명세서에서 입증할 프로토콜은 DroNc-seq 및 Omni-ATAC-seq 프로토콜의 약간 변형된 조합이며, 인간 뇌18,19,21,22,23,24에서신경 장애 및 신경 세포 유형을 이해하기 위해 snRNA-seq를 활용하는 최근 연구에 유사한접근법을활용한다. 이 프로토콜은 동결된 시료의 효소/기계적 해리의 조합을 사용하여 여과 및 그라데이션 원심분리를 거쳐 신선한 냉동 신경교종 조직에서 단일 핵을 빠르고 정확하게 분리할 수 있게 합니다. 우리는 성공적으로 뇌종양 견본에서 동일 핵 준비에서 snRNA-seq 및 snATAC-seq 데이터를 생성하기 위하여 이 프로토콜을 이용했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종양 내 이질성 분야는 흥미로운 단계에 있으며, 기존의 지식에 도전하고 확장하기 위해 새로운 에세이와 플랫폼이 개발되고 있습니다. 종양 내 이질성은진모(28)의현재 치료 양식에 대한 질병 진행 및 저항에 기여하는 중요한 요소입니다. 뇌종양에대한 최근 연구는 동일한 종양29,30,31, 32내의 세포 이질성을 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
독일 암 센터(DKFZ)의 단일 세포 오픈 랩(scOpenLab)에 유용한 토론을 해 주셔서 감사합니다. 이 연구는 독일 암 원조에 의해 지원 되었다, 맥스 에데르 프로그램 보조금 수 70111964 (S.T.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Referências
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