בידוד גרעינים מגידולים טריים במוח קפוא ל-RNA-seq חד-גרעיני ו-ATAC-seq
Summary
הטרוגניות תוך-גידולית היא תכונה אינהרנטית של גידולים, כולל גליומות. פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל המשתמש בשילוב של חוצצים וצנטריפוגה הדרגתית כדי לבודד גרעינים בודדים מרקמות גליומה קפואות טריות למחקרי רצף גרעין יחיד ו- ATAC.
Abstract
גליומות מפוזרות למבוגרים מציגות הטרוגניות בין-גידולית. עד לאחרונה, רוב מאמצי הפרופיל המולקולרי בקנה מידה גדול התמקדו בגישות בתפזורת שהובילו לסיווג המולקולרי של גידולים במוח. במהלך חמש השנים האחרונות, גישות רצף תאים בודדים הדגישו כמה תכונות חשובות של gliomas. רוב המחקרים הללו השתמשו בדגימות גידול במוח טרי כדי לבודד תאים בודדים באמצעות ציטומטריית זרימה או שיטות הפרדה מבוססות נוגדנים. במבט קדימה, השימוש בדגימות רקמות קפואות טריות מביו-בנקים יספק גמישות רבה יותר ליישומי תאים בודדים. יתר על כן, ככל שהשדה של התא הבודד מתקדם, האתגר הבא יהיה ליצור נתונים מרובי אומיקה מתא בודד או מאותה הכנה לדוגמה כדי לפענח טוב יותר את מורכבות הגידול. לכן, פרוטוקולים פשוטים וגמישים המאפשרים יצירת נתונים עבור שיטות שונות כגון רצף RNA חד-גרעין (snRNA-seq) וגרעין יחיד Assay עבור Chromatin נגיש Transposase עם רצף תפוקה גבוהה (snATAC-seq) יהיה חשוב עבור התחום.
ההתקדמות האחרונה בתחום התא הבודד בשילוב עם מכשירים מיקרופלואידיים נגישים כגון פלטפורמת הגנומיה 10x הקלו על יישומי תאים בודדים במעבדות מחקר. כדי לחקור את ההטרוגניות של גידול במוח, פיתחנו פרוטוקול משופר לבידוד גרעינים בודדים מגליומות קפואות טריות. פרוטוקול זה ממזג פרוטוקולים קיימים של תא בודד ומשלב שלב הומוגניזציה ואחריו סינון וצנטריפוגה הדרגתית בתיווך מאגר. הדגימות המתקבלות הן השעיות גרעין יחיד טהור שניתן להשתמש בהם כדי ליצור ביטוי גן גרעין יחיד נתוני נגישות כרומטין מאותה הכנת גרעין.
Introduction
גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה יותר (LGG), הגידול המוחי העיקרי הנפוץ ביותר במבוגרים, הן גידולים חודרניים המתעוררים לעתים קרובות בחצי הכדור המוחי. LGGs מפגינים הטרוגניות בין-גידולית, המונעת לא רק על ידי אוכלוסיית הגידול אלא גם על ידי התאים הלא ממאירים המעורבים באופן מורכב בהתפתחות הגידול ובהתקדמות1,2,3,4,5.
בעשור האחרון, יש מפולת של נתונים גנומיים שנאספו בתחום גליומות. נתונים אלה מגיעים בעיקר ממחקרי ריצוף גידול בתפזורת ותרמו רבות לאפיון המולקולרי, והסיווג הנוכחי של גידולים במוח5,6,7,8,9,10,11. עם זאת, למרות שמחקרים אלה חשפו את הנוף המולקולרי הרחב הקשור לגלומות, עדיין קיים חוסר התקדמות מאכזב לגבי התערבות טיפולית. אחד המכשולים לטיפול בהתנגדות בגידולים במוח הוא הטרוגניות תוך-גידולית. כדי לטפל בבעיה זו, מחקרים שונים התמקדו בהטרוגניות הגנומית, התמלולית, הפרוטאומית והאפיגנטית הקיימת בתוך גידול ברמת תא בודד12,13,14,15,16,17.
למרות שחלו התפתחויות טכנולוגיות יוצאות דופן בתחום התא הבודד בשנים האחרונות, אחד הגורמים המגבילים העיקריים הוא הזמינות של דגימות טריות הדרושות כדי לבודד את התאים ולבצע את הניסויים האלה. כדי להתגבר על מגבלה זו, היו כמה ניסיונות מוצלחים לבצע ניסיונות, כגון snRNA-seq ו snATAC-seq מרקמות קפואות, באמצעות גרעינים ולא תאים18,19. רוב השיטות הללו מסתמכות על מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) או על אסטרטגיות סינון. הן לגישות של תא בודד והן לגרעין יחיד יש את נקודות החוזק והחסרונות שלהם. גישות תא בודד לשמור על תמלילים מיטוכונדריאליים, אשר למרות עשוי להיות אינפורמטיבי, יכול גם להפחית את כיסוי שעתוק בשל השפע הגבוה שלהם. גישות בידוד גרעינים יחיד לחסל אחוז גבוה של שבר המיטוכונדריה, ובכך לאפשר כיסוי מעמיק יותר של תמלילים גרעיניים20.
ישנן פלטפורמות מסחריות שונות ששימשו בשנים האחרונות כדי לאבדק נתוני גנומיקה של תאים בודדים, כולל RNA-seq ו- ATAC-seq. אחת הפלטפורמות הבולטות ביותר היא פלטפורמת כרום גנומיקה 10x לביטוי גנים של תא בודד ופרופיל ATAC של תא יחיד. כאשר הפלטפורמה פועלת בעזרת תאים מיקרופלואידיים, כל פסולת או אגרגטים יכולים לסתום את המערכת המובילה לאובדן נתונים, ריאגנטים ודגימות קליניות יקרות ערך. לכן, ההצלחה של מחקרי תא יחיד תלויה במידה רבה בבידוד מדויק של תאים בודדים / גרעינים.
הפרוטוקול שנדגים כאן הוא שילוב שונה במקצת של פרוטוקולי DroNc-seq ו- Omni-ATAC-seq, ומשתמש בגישה דומה למחקרים אחרונים המשתמשים ב- snRNA-seq כדי להבין הפרעות נוירולוגיות וסוגי תאים עצביים במוחהאנושי 18,19,21,22,23,24. הפרוטוקול משתמש בשילוב של דיסוציאציה אנזימטית/מכנית של דגימות קפואות ואחריו סינון וצנטריפוגה הדרגתית ומאפשר בידוד מהיר ומדויק של גרעינים בודדים מרקמות גליומה קפואות טריות. השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה כדי ליצור נתוני snRNA-seq ו- snATAC-seq מאותה הכנת גרעין מדגימות גידול במוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
תחום ההטרוגניות התוך-גידולית נמצא בשלב מרגש, עם בדיקות ופלטפורמות חדשניות שפותחו כדי לאתגר ולהרחיב את הידע הקיים. הטרוגניות תוך-גידולית היא גורם מכריע התורם להתקדמות המחלה ולעמידות בפני שיטות הטיפול הנוכחיות בגליומות28. מחקרים אחרונים על גידולים במוח התמקדו בהיבט חשוב זה בא?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למעבדה הפתוחה של תא יחיד (scOpenLab) במרכז הסרטן הגרמני (DKFZ) על דיונים מועילים. מחקר זה נתמך על ידי הסיוע הגרמני לסרטן, מקס-Eder תוכנית מענק מספר 70111964 (S.T.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Referências
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
- Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
- Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
- Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
- Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
- Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Pesquisa do Câncer. 69 (24), 9157-9159 (2009).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer’s disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19 (2020).
- Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
- Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
- Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
- Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
- Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
- Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201 (2019).
