Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq
Summary
La heterogeneidad intramoral es una característica inherente de los tumores, incluidos los gliomas. Desarrollamos un protocolo simple y eficiente que utiliza una combinación de tampones y centrifugación por gradiente para aislar núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados para estudios de secuenciación de ARN de núcleo único y ATAC.
Abstract
Los gliomas difusos adultos exhiben heterogeneidad inter e intratitumoral. Hasta hace poco, la mayoría de los esfuerzos de perfiles moleculares a gran escala se han centrado en enfoques masivos que condujeron a la clasificación molecular de los tumores cerebrales. En los últimos cinco años, los enfoques de secuenciación de células individuales han destacado varias características importantes de los gliomas. La mayoría de estos estudios han utilizado muestras de tumores cerebrales frescos para aislar células individuales utilizando citometría de flujo o métodos de separación basados en anticuerpos. En el futuro, el uso de muestras de tejido fresco congelado de biobancos proporcionará una mayor flexibilidad a las aplicaciones de una sola célula. Además, a medida que avance el campo unicelular, el próximo desafío será generar datos multiómicos a partir de una sola célula o de la misma preparación de muestras para desentrañar mejor la complejidad del tumor. Por lo tanto, los protocolos simples y flexibles que permiten la generación de datos para diversos métodos, como la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a la transposasa con secuenciación de alto rendimiento (snATAC-seq) serán importantes para el campo.
Los avances recientes en el campo de una sola célula, junto con instrumentos microfluídicos accesibles, como la plataforma genómica 10x, han facilitado las aplicaciones de células individuales en laboratorios de investigación. Para estudiar la heterogeneidad de los tumores cerebrales, desarrollamos un protocolo mejorado para el aislamiento de núcleos individuales de gliomas frescos congelados. Este protocolo combina los protocolos existentes de una sola célula y combina un paso de homogeneización seguido de filtración y centrifugación de gradiente mediado por tampón. Las muestras resultantes son suspensiones puras de núcleos individuales que se pueden utilizar para generar datos de expresión génica de un solo núcleo y accesibilidad a la cromatina a partir de la misma preparación de núcleos.
Introduction
Los gliomas difusos de grado inferior (LGG), el tumor cerebral primario más común en adultos, son neoplasias infiltrativas que a menudo surgen en el hemisferio cerebral. Los LGG exhiben heterogeneidad inter e intratitumoral, que no solo es impulsada por la población tumoral sino también por las células no malignas intrincadamente involucradas en el desarrollo y la progresión del tumor1,2,3,4,5.
Durante la última década, ha habido una avalancha de datos genómicos recopilados en el campo de los gliomas. Estos datos provienen principalmente de estudios de secuenciación tumoral a granel y han contribuido enormemente a la caracterización molecular, y a la clasificación actual de los tumores cerebrales5,6,7,8,9,10,11. Sin embargo, a pesar de que estos estudios revelaron el amplio panorama molecular asociado con los gliomas, todavía hay una decepcionante falta de progreso con respecto a la intervención terapéutica. Uno de los obstáculos para la resistencia al tratamiento en los tumores cerebrales es la heterogeneidad intratitumoral. Para abordar este problema, diversos estudios se han centrado en la heterogeneidad genómica, transcriptómica, proteómica y epigenética presente dentro de un tumor a nivel de una sola célula12,13,14,15,16,17.
Aunque ha habido avances tecnológicos notables en el campo de una sola célula en los últimos años, uno de los principales factores limitantes es la disponibilidad de especímenes frescos necesarios para aislar las células y realizar estos experimentos. Para superar esta limitación, ha habido varios intentos exitosos de realizar ensayos, como snRNA-seq y snATAC-seq de tejidos congelados, utilizando núcleos en lugar de células18,19. La mayoría de estos métodos se basan en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o en estrategias de filtración. Tanto los enfoques de células individuales como de núcleos individuales tienen sus fortalezas e inconvenientes. Los enfoques de una sola célula mantienen las transcripciones mitocondriales, que aunque pueden ser informativas, también pueden reducir la cobertura del transcriptoma debido a su alta abundancia. Los enfoques de aislamiento de núcleos individuales eliminan un alto porcentaje de la fracción mitocondrial, lo que permite una cobertura más profunda de las transcripciones nucleares20.
Hay varias plataformas disponibles comercialmente que se han utilizado en los últimos años para analizar datos genómicos de células individuales, incluidos RNA-seq y ATAC-seq. Una de las plataformas más destacadas es la plataforma 10x Genomics Chromium para la expresión génica de una sola célula y el perfil ATAC de una sola célula. Como la plataforma funciona con la ayuda de cámaras microfluídicas, cualquier residuo o agregado puede obstruir el sistema, lo que lleva a la pérdida de datos, reactivos y muestras clínicas valiosas. Por lo tanto, el éxito de los estudios de células individuales depende en gran medida del aislamiento preciso de células / núcleos individuales.
El protocolo que demostraremos aquí es una combinación ligeramente modificada de los protocolos DroNc-seq y Omni-ATAC-seq, y utiliza un enfoque similar a estudios recientes que utilizan snRNA-seq para comprender los trastornos neurológicos y los tipos de células neuronales en el cerebro humano18,19,21,22,23,24. El protocolo utiliza una combinación de disociación enzimática/mecánica de muestras congeladas seguida de filtración y centrifugación por gradiente y permite un aislamiento rápido y preciso de núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados. Hemos utilizado con éxito este protocolo para generar datos de snRNA-seq y snATAC-seq a partir de la misma preparación de núcleos a partir de muestras de tumores cerebrales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El campo de la heterogeneidad intramoral se encuentra en una etapa emocionante, con nuevos ensayos y plataformas que se están desarrollando para desafiar y expandir el conocimiento existente. La heterogeneidad intramoral es un factor crucial que contribuye a la progresión de la enfermedad y a la resistencia a las modalidades de tratamiento actuales en los gliomas28. Estudios recientes sobre tumores cerebrales se han centrado en este importante aspecto mediante el uso de ensayos transcriptómicos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Single Cell Open Lab (scOpenLab) en el Centro Alemán del Cáncer (DKFZ) por sus útiles discusiones. Esta investigación fue apoyada por la subvención número 70111964 (S.T.) de la Ayuda Alemana contra el Cáncer, Programa Max-Eder.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Referências
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