単核RNA-seqおよびATAC-seqのための新鮮な凍結脳腫瘍からの核分離
Summary
腫瘍内不均一性は、神経膠腫を含む腫瘍の固有の特徴である。我々は、単核RNAおよびATACシーケンシング研究のために、新鮮な凍結したグリオーマ組織から単一核を単一核に分離するために、バッファーと勾配遠心分離の組み合わせを利用するシンプルで効率的なプロトコルを開発した。
Abstract
成人びまん性神経膠腫は、腫瘍間および腫瘍内不均一性を示す。最近まで、大規模な分子プロファイリングの大部分は、脳腫瘍の分子分類につながったバルクアプローチに焦点を当ててきた。過去5年間で、単一細胞シーケンシングアプローチは、神経膠腫のいくつかの重要な特徴を強調してきました。これらの研究の大半は、フローサイトメトリーまたは抗体ベースの分離方法を使用して単一細胞を単一細胞に分離するために新鮮な脳腫瘍標本を利用している。今後、バイオバンクからの新鮮な凍結組織サンプルを使用すると、単一細胞の用途に対する柔軟性が向上します。さらに、単一細胞分野が進むにつれて、次の課題は、腫瘍の複雑性をより良く解明するために、単一の細胞または同じサンプル調製物からマルチオミックスデータを生成することです。したがって、単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)や、高スループットシーケンシング(snATAC-seq)を備えたトランスポサーゼ対応クロマチン用単核アッセイなどの様々な方法のデータ生成を可能にするシンプルで柔軟なプロトコルが重要になります。
10xゲノムプラットフォームのようなアクセス可能なマイクロ流体機器と結合された単一細胞分野の最近の進歩は、研究室での単一細胞の適用を促進している。脳腫瘍の不均一性を研究するために、我々は新鮮な凍結神経膠腫からの単一核の単一の分離のための強化されたプロトコルを開発した。このプロトコルは、既存の単一セルプロトコルをマージし、均質化ステップに続いて濾過およびバッファー媒介勾配遠心分離を組み合わせます。得られたサンプルは、同じ核調製物から単一の核遺伝子発現およびクロマチンのアクセシビリティデータを生成するために使用することができる純粋な単一核懸濁液である。
Introduction
成人で最も一般的な原発性脳腫瘍であるびまん性低悪性神経膠腫(LGG)は、大脳半球でしばしば生じる浸潤性新生物である。LGGsは腫瘍間と腫瘍内の不均一性を示し、腫瘍集団によって駆動されるだけでなく、腫瘍の発達と進行に複雑に関与する非悪性細胞によっても1、2、3、4、5を示す。
過去10年間、神経膠腫の分野でゲノムデータが集まっていました。これらのデータは、主にバルク腫瘍シーケンシング研究から来て、分子特性評価に非常に貢献している、と脳腫瘍の現在の分類5、6、7、8、9、10、11。しかし、これらの研究は、神経膠腫に関連する広範な分子景観を明らかにしたにもかかわらず、治療介入に関する進歩の残念な欠如がまだある。脳腫瘍における治療抵抗性の障害の1つは、腫瘍内不均一性である。この問題に対処するために、様々な研究は、ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオミクス、および単一細胞レベル12、13、14、15、16、17で腫瘍内に存在するエピジェネティックな異種性に焦点を当ててきました。
ここ数年、単一細胞分野で顕著な技術進歩がありましたが、主な制限要因の1つは、細胞を単離し、これらの実験を行うために必要な新鮮な標本の入手可能性です。この制限を克服するために、凍結組織からのsnRNA-seqおよびsnATAC-seqのようなアッセイを、細胞18、19ではなく核を用いてアッセイを行う上で成功した試みがいくつか行われている。これらの方法の大部分は、蛍光活性化細胞選別(FACS)または濾過戦略のいずれかに依存しています。単一細胞と単一核アプローチの両方に長所と短所があります。単一細胞のアプローチは、ミトコンドリアの転写物を維持し、有益であるかもしれないが、その豊富さのためにトランスクリプトームのカバレッジを減らすことができる。単一核単離アプローチは、ミトコンドリア画分の高い割合を排除し、それによって核転写物20のより詳細なカバレッジを可能にする。
RNA-seqやATAC-seqを含む単一細胞ゲノミクスデータのアッセイに近年使用されている様々な市販のプラットフォームがあります。最も顕著なプラットフォームの1つは、単一細胞遺伝子発現および単一細胞ATACプロファイリングのための10xゲノミクスクロムプラットフォームである。プラットフォームはマイクロ流体室の助けを借りて動作するように、任意の破片や凝集物は、データ、試薬、および貴重な臨床サンプルの損失につながるシステムを詰まらせる可能性があります。したがって、単一細胞研究の成功は、単一細胞/核の正確な単離に大きく依存する。
ここで示すプロトコルは、DroNc-seqとOmni-ATAC-seqプロトコルのわずかに変更された組み合わせであり、snRNA-seqを利用してヒト脳18、19、21、22、23、24の神経疾患および神経細胞タイプを理解する最近の研究と同様のアプローチを利用している。このプロトコルは、凍結サンプルの酵素/機械的解離の組み合わせを使用し、その後ろ過および勾配遠心分離を行い、新鮮な凍結グリオーマ組織からの単一核の迅速かつ正確な単一の分離を可能にする。我々は、このプロトコルを使用して、脳腫瘍標本から同じ核調製物からsnRNA-seqおよびsnATAC-seqデータを生成することに成功した。
Protocol
Representative Results
Discussion
腫瘍内の異質性の分野は、既存の知識に挑戦し、拡大するために新しいアッセイやプラットフォームが開発され、エキサイティングな段階にあります。腫瘍内不均一性は、神経膠腫28における疾患の進行および現在の治療モダリティに対する耐性に寄与する重要な因子である。脳腫瘍に関する最近の研究は、同じ腫瘍内の細胞異質性をより良く特徴付けるために単一細胞転?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ドイツがんセンター(DKFZ)のシングルセルオープンラボ(scOpenLab)に感謝します。この研究は、ドイツのがん援助、マックス・イーダー・プログラムの助成金番号70111964(S.T.)によって支援されました。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
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