Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq
Summary
A heterogeneidade intra-tumoral é uma característica inerente aos tumores, incluindo gliomas. Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente que utiliza uma combinação de buffers e centrífugas gradientes para isolar núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos para estudos de sequenciamento de núcleo único RNA e ATAC.
Abstract
Gliomas difusos adultos apresentam heterogeneidade inter e intra-tumor. Até recentemente, a maioria dos esforços de perfil molecular em larga escala se concentraram em abordagens em massa que levaram à classificação molecular de tumores cerebrais. Nos últimos cinco anos, abordagens de sequenciamento de células únicas têm destacado várias características importantes dos gliomas. A maioria desses estudos tem utilizado amostras de tumores cerebrais frescos para isolar células únicas usando citometria de fluxo ou métodos de separação baseados em anticorpos. Seguindo em frente, o uso de amostras de tecido fresco congelados de biobancos fornecerá maior flexibilidade às aplicações de células únicas. Além disso, à medida que o campo unicelular avança, o próximo desafio será gerar dados multi-omics de uma única célula ou da mesma preparação amostral para desvendar melhor a complexidade tumoral. Portanto, protocolos simples e flexíveis que permitem a geração de dados para vários métodos, como sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e ensaio de núcleo único para Chromatina Transposase-Acessível com sequenciamento de alto throughput (snATAC-seq) serão importantes para o campo.
Os recentes avanços no campo de células únicas, juntamente com instrumentos microfluidos acessíveis, como a plataforma de genômica 10x, facilitaram aplicações de células únicas em laboratórios de pesquisa. Para estudar a heterogeneidade do tumor cerebral, desenvolvemos um protocolo aprimorado para o isolamento de núcleos únicos de gliomas congelados frescos. Este protocolo mescla protocolos de célula única existentes e combina uma etapa de homogeneização seguida de filtração e centrifugação de gradiente mediada por buffer. As amostras resultantes são suspensões de núcleos únicos puros que podem ser usadas para gerar dados de expressão genética de núcleo único e de acessibilidade de cromatina a partir da mesma preparação de núcleos.
Introduction
Gliomas de menor grau difuso (LGG), o tumor cerebral primário mais comum em adultos, são neoplasias infiltrativas que frequentemente surgem no hemisfério cerebral. Os LGGs apresentam heterogeneidade inter e intra-tumor, que não é apenas impulsionada pela população tumoral, mas também pelas células não malignas intrincadamente envolvidas no desenvolvimento e progressão do tumor1,2,3,4,5.
Na última década, houve uma avalanche de dados genômicos coletados no campo dos gliomas. Esses dados vêm principalmente de estudos de sequenciamento de tumores em massa e têm contribuído imensamente para a caracterização molecular, e a classificação atual dos tumores cerebrais5,6,7,8,9,10,11. No entanto, embora esses estudos tenham revelado a ampla paisagem molecular associada aos gliomas, ainda há uma decepcionante falta de progresso em relação à intervenção terapêutica. Um dos obstáculos à resistência ao tratamento em tumores cerebrais é a heterogeneidade intra-tumoral. Para abordar essa questão, vários estudos têm se concentrado na heterogenidade genômica, transcriômica, proteômica e epigenética presente dentro de um tumor em um único nível celular12,13,14,15,16,17.
Embora tenha havido notáveis avanços tecnológicos no campo de células únicas nos últimos dois anos, um dos principais fatores limitantes é a disponibilidade de espécimes frescos necessários para isolar as células e realizar esses experimentos. Para superar essa limitação, houve várias tentativas bem sucedidas de realizar ensaios, como snRNA-seq e snATAC-seq de tecidos congelados, utilizando núcleos em vez de células18,19. A maioria desses métodos depende tanto da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) quanto das estratégias de filtragem. Tanto as abordagens de células únicas quanto de núcleos únicos têm seus pontos fortes e desvantagens. Abordagens unicelulares mantêm transcrições mitocondriais, que embora possam ser informativas, também podem reduzir a cobertura do transcriptome devido à sua alta abundância. Abordagens de isolamento de núcleos únicos eliminam uma alta porcentagem da fração mitocondrial, permitindo assim uma cobertura mais aprofundada das transcrições nucleares20.
Existem várias plataformas comercialmente disponíveis que têm sido usadas ao longo dos últimos anos para avaliar dados de genômica de células únicas, incluindo RNA-seq e ATAC-seq. Uma das plataformas mais proeminentes é a plataforma 10x Genomics Chromium para expressão genética de células únicas e perfil de célula única ATAC. Como a plataforma trabalha com a ajuda de câmaras microfluídicas, quaisquer detritos ou agregados podem entupir o sistema levando à perda de dados, reagentes e amostras clínicas valiosas. Portanto, o sucesso de estudos unicelulares depende em grande parte do isolamento preciso de células/núcleos únicos.
O protocolo que demonstraremos aqui é uma combinação ligeiramente modificada dos protocolos DroNc-seq e Omni-ATAC-seq, e utiliza uma abordagem semelhante aos estudos recentes que utilizam o snRNA-seq para entender distúrbios neurológicos e tipos de células neuronais no cérebro humano18,19,21,22,23,24. O protocolo utiliza uma combinação de dissociação enzimática/mecânica de amostras congeladas seguida de filtração e centrifugação gradiente e permite o isolamento rápido e preciso de núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos. Usamos com sucesso este protocolo para gerar dados snRNA-seq e snATAC-seq a partir da mesma preparação de núcleos de amostras de tumores cerebrais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O campo da heterogeneidade intra-tumoral está em uma fase emocionante, com novos ensaios e plataformas sendo desenvolvidos para desafiar e expandir o conhecimento existente. A heterogeneidade intra-tumoral é um fator crucial que contribui para a progressão da doença e resistência às modalidades atuais de tratamento em gliomas28. Estudos recentes sobre tumores cerebrais têm focado nesse importante aspecto usando ensaios transcriômicos e epigenômicos de células únicas para melhor caracter…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Laboratório Aberto de Células Únicas (scOpenLab) do Centro Alemão de Câncer (DKFZ) por discussões úteis. Esta pesquisa foi apoiada pelo German Cancer Aid, Max-Eder Program grant number 70111964 (S.T.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Referências
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