Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu
Summary
Tümör içi heterojenlik gliomalar da dahil olmak üzere tümörlerin doğal bir özelliğidir. Tek çekirdek RNA ve ATAC dizileme çalışmaları için tek çekirdekleri taze donmuş glioma dokularından izole etmek için tamponlar ve gradyan santrifüjleme kombinasyonunu kullanan basit ve verimli bir protokol geliştirdik.
Abstract
Erişkin dağınık gliomalar tümörler arası ve tümör içi heterojenlik sergiler. Yakın zamana kadar, büyük ölçekli moleküler profilleme çabalarının çoğu, beyin tümörlerinin moleküler sınıflandırılmasına yol açan toplu yaklaşımlara odaklanmıştır. Son beş yılda, tek hücreli dizileme yaklaşımları gliomaların birkaç önemli özelliğine vurgu yaptı. Bu çalışmaların çoğunluğu, akış sitometrisi veya antikor bazlı ayırma yöntemlerini kullanarak tek hücreleri izole etmek için taze beyin tümörü örneklerinden yararlanmıştır. İleride, biyobankalardan taze dondurulmuş doku örneklerinin kullanılması tek hücre uygulamalarına daha fazla esneklik sağlayacaktır. Ayrıca, tek hücreli alan ilerledikçe, bir sonraki zorluk tümör karmaşıklığını daha iyi çözmek için tek bir hücreden veya aynı örnek hazırlığından çoklu omik verileri oluşturmak olacaktır. Bu nedenle, tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq) ve transposase-Accessible Chromatin için tek çekirdekli Tahlis gibi çeşitli yöntemler için veri üretimine izin veren basit ve esnek protokoller alan için önemli olacaktır.
10x genomik platformu gibi erişilebilir mikroakışkan aletlerle birleştiğinde tek hücre alanındaki son gelişmeler, araştırma laboratuvarlarında tek hücre uygulamalarını kolaylaştırmaktadır. Beyin tümörü heterojenliğini incelemek için, tek çekirdeğin taze donmuş gliomalardan izolesi için geliştirilmiş bir protokol geliştirdik. Bu protokol varolan tek hücre protokollerini birleştirir ve bir homojenleştirme adımini ve ardından filtrasyon ve arabellek aracılı gradyan santrifüjünü birleştirir. Elde edilen örnekler, aynı çekirdek preparatından tek çekirdek gen ekspresykülü ve kromatin erişilebilirlik verileri oluşturmak için kullanılabilecek saf tek çekirdek süspansiyonlarıdır.
Introduction
Yetişkinlerde en sık görülen primer beyin tümörü olan dağınık alt derece gliomalar (LGG), sıklıkla serebral yarımkürede ortaya çıkan infiltratif neoplazmlardır. LGG’ler sadece tümör popülasyonu tarafından değil, aynı zamanda tümör gelişimi ve ilerlemesinde karmaşık bir şekilde yer alan kötü huylu olmayan hücreler tarafından da yönlendirilen tümör içi heterojenliği hem inter-hem de intra-tümör heterojenliği sergiler 1,2,3,4,5.
Son on yılda gliomalar alanında toplanan bir dizi genomik veri vardır. Bu veriler esas olarak toplu tümör dizileme çalışmalarından gelir ve moleküler karakterizasyona ve beyin tümörlerinin mevcut sınıflandırılmasına son derece katkıda bulunmuştur5,6, 7,8,9,10,11. Bununla birlikte, bu çalışmalar gliomalarla ilişkili geniş moleküler manzarayı ortaya ortaya sürse de, terapötik müdahale konusunda hala hayal kırıklığı yaratan bir ilerleme eksikliği vardır. Beyin tümörlerinde tedavi direncinin önündeki engellerden biri de tümör içi heterojenliktir. Bu sorunu çözmek için, çeşitli çalışmalar tek hücreli düzeyde bir tümörde bulunan genomik, transkriptomik, proteomik ve epigenetik heterojeniteye odaklanmıştır12,13 ,14,15,16,17.
Son birkaç yıldır tek hücre alanında dikkat çekici teknolojik gelişmeler olmasına rağmen, en önemli sınırlayıcı faktörlerden biri, hücreleri izole etmek ve bu deneyleri gerçekleştirmek için gereken taze örneklerin mevcudiyetidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için,18 , 19hücreleri yerine çekirdek kullanarak donmuş dokulardan snRNA-seq ve snATAC-seq gibi tahliller yapmak için birkaç başarılı girişimolmuştur. Bu yöntemlerin çoğu floresan ile etkinleştirilen hücre sıralama (FACS) veya filtrasyon stratejilerine dayanır. Hem tek hücreli hem de tek çekirdekli yaklaşımların güçlü ve dezavantajları vardır. Tek hücreli yaklaşımlar mitokondriyal transkriptleri korur, bu da bilgilendirici olsa da, yüksek bollukları nedeniyle transkriptome kapsamını azaltabilir. Tek çekirdek izolasyon yaklaşımları mitokondriyal fraksiyonun yüksek bir yüzdesini ortadan kaldırır, böylece nükleer transkriptlerin daha derinlemesine kapsanmasına izin verir20.
RNA-seq ve ATAC-seq dahil olmak üzere tek hücreli genomik verileri test etmek için son yıllarda kullanılan çeşitli ticari platformlar vardır. En belirgin platformlardan biri, tek hücreli gen ekspresyumu ve tek hücreli ATAC profilleme için 10x Genomik Krom platformudur. Platform mikroakışkan odaların yardımıyla çalıştığından, herhangi bir döküntü veya agrega sistemi tıkayabilir ve bu da veri, reaktif ve değerli klinik örneklerin kaybına yol açabilir. Bu nedenle, tek hücreli çalışmaların başarısı büyük ölçüde tek hücrelerin/ çekirdeklerin doğru izolasyonuna bağlıdır.
Burada göstereceğimiz protokol, DroNc-seq ve Omni-ATAC-seq protokollerinin biraz değiştirilmiş bir kombinasyonudur ve insan beynindeki nörolojik bozuklukları ve nöronal hücre tiplerini anlamak için snRNA-seq kullanan son çalışmalara benzer bir yaklaşım kullanır18,19,21,22,23,24. Protokol, donmuş numunelerin enzipmatik/mekanik ayrışmasının ve ardından filtrasyon ve gradyan santrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullanır ve tek çekirdeğin taze dondurulmuş glioma dokularından hızlı ve doğru bir şekilde izole edilmesini sağlar. Bu protokolü, beyin tümörü örneklerinden aynı çekirdek hazırlığından snRNA-seq ve snATAC-seq verileri oluşturmak için başarıyla kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tümör içi heterojenlik alanı heyecan verici bir aşamadadır ve mevcut bilgiye meydan okumak ve genişletmek için yeni tahliller ve platformlar geliştirilmektedir. Tümör içi heterojenlik gliomalarda hastalığın ilerlemesine ve mevcut tedavi yöntemlerine direnç gösteren önemli bir faktördür28. Beyin tümörleri üzerinde yapılan son çalışmalar, aynı tümör içindeki hücresel heterojenliği daha iyi karakterize etmek için tek hücreli transkriptomik ve epigenomik tahliller k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alman Kanser Merkezi’ndeki (DKFZ) Tek Hücreli Açık Laboratuvar’a (scOpenLab) yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu araştırma Alman Kanser Yardımı, Max-Eder Programı hibe numarası 70111964 (S.T.) tarafından desteklendi.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Referências
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
- Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
- Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
- Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
- Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
- Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Pesquisa do Câncer. 69 (24), 9157-9159 (2009).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer’s disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19 (2020).
- Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
- Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
- Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
- Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
- Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
- Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201 (2019).
