Выделение ядер из свежезамороженных опухолей головного мозга для одноядерных РНК-seq и ATAC-seq
Summary
Внутриопухоловная гетерогенность является неотъемлемой чертой опухолей, в том числе и глиом. Мы разработали простой и эффективный протокол, который использует комбинацию буферов и градиентного центрифугирования для выделения одиночных ядер из свежезамороженных тканей глиомы для исследований секвенирования одноядерной РНК и ATAC.
Abstract
Взрослые диффузные глиомы проявляют меж- и внутриопухоляистую гетерогенность. До недавнего времени большинство крупномасштабных усилий по молекулярному профилированию были сосредоточены на объемных подходах, которые привели к молекулярной классификации опухолей головного мозга. За последние пять лет подходы к секвенированию одиночных клеток выявили несколько важных особенностей глиом. В большинстве этих исследований использовались свежие образцы опухолей головного мозга для выделения отдельных клеток с использованием проточной цитометрии или методов разделения на основе антител. В дальнейшем использование свежезамороженных образцов тканей из биобанков обеспечит большую гибкость для одноклеточных применений. Кроме того, по мере продвижения одноклеточного поля следующей задачей будет генерация мультиомических данных либо из одной клетки, либо из одного образца препарата, чтобы лучше разгадать сложность опухоли. Поэтому простые и гибкие протоколы, которые позволяют генерацию данных для различных методов, таких как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) и анализ одного ядра для транспозазно-доступного хроматина с высокопроизводительный секвенированием (snATAC-seq), будут важны для этой области.
Последние достижения в области одноклеточных клеток в сочетании с доступными микрофлюидными инструментами, такими как платформа 10x genomics, облегчили применение одной клетки в исследовательских лабораториях. Для изучения гетерогенности опухоли головного мозга мы разработали расширенный протокол выделения одиночных ядер из свежезамороженных глиом. Этот протокол объединяет существующие одноклеточные протоколы и сочетает в себе этап гомогенизации, за которым следует фильтрация и буферное опосредованное градиентное центрифугирование. Полученные образцы представляют собой чистые суспензии одиночных ядер, которые могут быть использованы для генерации экспрессии гена одного ядра и данных о доступности хроматина из одного и того же препарата ядер.
Introduction
Диффузные глиомы более низкой степени (LGG), наиболее распространенная первичная опухоль головного мозга у взрослых, являются инфильтративными новообразованиями, которые часто возникают в полушарии головного мозга. LGG проявляют как меж-, так и внутриопухоловную гетерогенность, которая обусловлена не только опухолевой популяцией, но и незлокачественными клетками, причудливо участвующими в развитии и прогрессировании опухоли1,2,3,4,5.
За последнее десятилетие произошла лавина геномных данных, собранных в области глиом. Эти данные в основном поступают из объемных исследований секвенирования опухолей и внесли огромный вклад в молекулярную характеристику и текущую классификацию опухолей головного мозга5,6,7,8,9,10,11. Однако, несмотря на то, что эти исследования выявили широкий молекулярный ландшафт, связанный с глиомами, все еще существует разочаровывающий недостаток прогресса в отношении терапевтического вмешательства. Одним из препятствий для резистентности к лечению опухолей головного мозга является внутриопухолевая гетерогенность. Чтобы решить эту проблему, различные исследования были сосредоточены на геномной, транскриптомной, протеомной и эпигенетической гетерогенности, присутствующей в опухоли на уровне одной клетки12,13,14,15,16,17.
Хотя за последние пару лет в области одиночных клеток были достигнуты замечательные технологические достижения, одним из основных ограничивающих факторов является наличие свежих образцов, необходимых для изоляции клеток и проведения этих экспериментов. Чтобы преодолеть это ограничение, было несколько успешных попыток выполнения анализов, таких как snRNA-seq и snATAC-seq из замороженных тканей, с использованием ядер, а не клеток18,19. Большинство из этих методов основаны либо на флуоресцентной активации сортировки клеток (FACS), либо на стратегиях фильтрации. Как одноклеточные, так и одноядерные подходы имеют свои сильные и слабые стороны. Одноклеточные подходы поддерживают митохондриальные транскрипты, которые, хотя и могут быть информативными, также могут уменьшить охват транскриптома из-за их высокого изобилия. Подходы к изоляции одиночных ядер устраняют высокий процент митохондриальной фракции, тем самым позволяя более глубоко охватить ядерные транскрипты20.
Существуют различные коммерчески доступные платформы, которые использовались в последние годы для анализа данных геномики одиночных клеток, включая RNA-seq и ATAC-seq. Одной из наиболее известных платформ является 10-кратная платформа Genomics Chromium для экспрессии одноклеточных генов и профилирования одноклеточных ATAC. Поскольку платформа работает с помощью микрофлюидных камер, любой мусор или агрегаты могут засорить систему, что приведет к потере данных, реагентов и ценных клинических образцов. Поэтому успех одноклеточных исследований во многом зависит от точной изоляции одиночных клеток/ядер.
Протокол, который мы продемонстрируем здесь, представляет собой слегка модифицированную комбинацию протоколов DroNc-seq и Omni-ATAC-seq и использует аналогичный подход к недавним исследованиям, которые используют snRNA-seq для понимания неврологических расстройств и типов нейрональных клеток в человеческом мозге18,19,21,22,23,24. Протокол использует комбинацию ферментативной/механической диссоциации замороженных образцов с последующей фильтрацией и градиентным центрифугированием и позволяет быстро и точно выделять одиночные ядра из свежезамороженных тканей глиомы. Мы успешно использовали этот протокол для генерации данных snRNA-seq и snATAC-seq из одного и того же препарата ядер из образцов опухолей головного мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Область внутриопухолевой гетерогенности находится на захватывающей стадии, когда разрабатываются новые анализы и платформы, чтобы бросить вызов и расширить существующие знания. Внутриопухоловная гетерогенность является решающим фактором, который способствует прогрессированию заб…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Открытую лабораторию с одной клеткой (scOpenLab) в Немецком онкологическом центре (DKFZ) за полезные обсуждения. Это исследование было поддержано немецкой онкологической помощью, грантом программы Max-Eder Под номером 70111964 (S.T.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Referências
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
- Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
- Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
- Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
- Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
- Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Pesquisa do Câncer. 69 (24), 9157-9159 (2009).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer’s disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19 (2020).
- Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
- Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
- Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
- Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
- Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
- Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201 (2019).
