Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen
Summary
Bereiding van mitochondriën-verrijkte monsters van eerder bevroren gearchiveerde vaste weefsels stelde de onderzoekers in staat om zowel functionele als analytische beoordelingen van mitochondriën uit te voeren in verschillende experimentele modaliteiten. Deze studie toont aan hoe mitochondria-verrijkte preparaten kunnen worden bereid uit bevroren hartweefsel en analytische beoordelingen van mitochondriën kunnen worden uitgevoerd.
Abstract
Het mitochondriale elektronenoverdrachtscomplex (ETC) -profiel wordt gewijzigd in het hartweefsel van de nakomelingen die zijn geboren uit een geoefende zeug. De hypothese die werd voorgesteld en getest was dat een regelmatige maternale oefening van een zeug tijdens de zwangerschap de mitochondriale efficiëntie van de hart-energetica van het nageslacht zou verhogen. Deze hypothese werd getest door mitochondriën te isoleren met behulp van een milde isolatieprocedure om mitochondriale ETC en supercomplexprofielen te beoordelen. De hier beschreven procedure maakte de verwerking van eerder bevroren gearchiveerde hartweefsels mogelijk en elimineerde de noodzaak van verse mitochondriale voorbereiding voor de beoordeling van mitochondriale ETC-complexcomplexen, supercomplexen en ETC-complexe activiteitsprofielen. Dit protocol beschrijft de optimale ETC-eiwitcomplexmeting in multiplexed antilichaamgebaseerde immunoblotting en supercomplexe beoordeling met behulp van blue-native gel-elektroforese.
Introduction
Het doel van dit protocol was om gedetailleerde stappen te bieden om mitochondria-verrijkte preparaten te verkrijgen uit eerder bevroren hartweefsel met een nieuwe technologie van lage energie mechanische verstoring van weefsel die weefsellysis en extractie van mitochondriën verbetert. Met deze methode wordt een verbeterde extractie-efficiëntie zonder hoge schuifspanning of hoge temperatuur en een korte homogenisatietijd (10-12 s) haalbaar1.
Het verkrijgen van mitochondriën uit gearchiveerd bevroren weefsel is een waardevolle aanwinst om zowel functionele2 – als biochemische studies uit te voeren3 anders niet gemakkelijk herhaalbaar onder de exacte experimentele omstandigheden. Een klassieke Potter-Elvehjem Teflon stamperglashomogenisator of Dounce-homogenisator is gebruikt en wordt nog steeds gebruikt in onderzoekslaboratoria om zachte weefsels zoals lever, nieren en hersenen te homogeniseren. Het homogeniseren van harde weefsels zoals spieren en hart vereist echter meer homogenisatietijd, enzymbehandeling, snelle homogenisatie en uitgebreide gebruikerservaring. Dit is nadelig voor het extraheren van intacte organellen zoals mitochondriën uit hard weefsel zoals spieren en hart. De methode die in dit protocol wordt beschreven, wordt gebruikt om mitochondriaal verrijkt preparaat met hoge opbrengst te verkrijgen om mitochondriale elektronentransportketen (ETC) eiwitcomplexen en hun supercomplexe vorming te analyseren in hartweefsels geoogst van nakomelingen geboren uit geoefende en sedentaire zeug, flash-bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Met deze methode kan de gebruiker mitochondriaal verrijkt preparaat isoleren uit eerder bevroren gearchiveerde weefsels.
Blootstelling aan externe nanomaterialen aan zwangere knaagdieren kan de hartfunctie en mitochondriale ademhaling en bio-energetica op nakomelingen tijdens de zwangerschap negatief beïnvloeden4. Niettemin moeten aërobe door inspanning geïnduceerde positieve veranderingen in foetale myocytenbio-energetica tijdens de zwangerschap nog worden gedocumenteerd. Opkomende studies leveren echter bewijs dat maternale aerobe oefening tijdens de zwangerschap een positieve invloed heeft op de foetale hartfunctie5. Om verder bewijs te leveren, werd een analyse uitgevoerd van de longitudinale effecten van maternale oefening op de cardiale mitochondriale respiratoire ketencomplexen van nakomelingen (d.w.z. Complex I tot en met Complex V) tijdens de zwangerschap.
Deze studie heeft een aanzienlijke gezondheidsrelevantie omdat de resultaten kunnen suggereren dat maternale oefening de efficiëntie van de energieproductie in de hartochondriën van het nageslacht verbetert. In deze studie werden zeugen (vrouwelijk varken) om twee redenen als diermodel gebruikt: (i) hartfysiologie is vergelijkbaar met die van de mens6, en (ii) hartweefseloogst van nakomelingen uit verschillende tijdspunten is haalbaar onder een institutionele IACUC-goedkeuring. De voorgestelde studie is bedoeld om veel van de fundamentele vragen te beantwoorden die moederlijke oefening en de potentiële positieve effecten ervan op de cellulaire en biochemische samenstelling van het hartweefsel van de nakomelingen verbinden. Deze aanpak vereist zachte maar effectieve mitochondriale isolatietechnieken van eerder bevroren hartweefsel verkregen uit de langdurige en kostbare longitudinale studies die de problemen van de bio-energetische veranderingen in foetale hartmyocyten tijdens de zwangerschap aanpakten. De methode die in deze studie wordt beschreven, maakt het mogelijk om grote sommen eerder bevroren gearchiveerd weefsel te gebruiken voor mitochondria-verrijkte voorbereiding voor zowel analytische als functionele studies. De studie zal ook helpen de kenniskloof op dit gebied te dichten door voorlopige gegevens te verstrekken, wat zou kunnen leiden tot toekomstige studies die de effecten van maternale lichaamsbeweging op de gezondheid van het hart in de baarmoeder en daarbuiten bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritieke stappen voor dit protocol worden hier aangegeven. Ten eerste moet weefselhomogenisatie zorgvuldig worden behandeld, zodat overmatige pure effecten niet worden toegepast tijdens het weefselhomogenisatieproces. Er moet een weefselversnipperaar worden gebruikt, die deel uitmaakt van de drukcyclustechnologie (PCT) voor initiële weefselhomogenisatie9. Deze stap zal de overmatige slagcyclus van glas-op-glas homogenisator verminderen (figuur 1B) die de toch al f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd financieel ondersteund door de intramurale beurs van de Kansas City University voor Abdulbaki Agbas en de Summer Research Fellowship voor Daniel Barrera. De auteurs zijn dankbaar voor het redactionele werk van Dr. Jan Talley.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
Referências
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. . Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria–a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
