Mesure des complexes de transfert d’électrons mitochondriaux dans le tissu cardiaque précédemment congelé de la progéniture de la truie: un modèle pour évaluer les changements bioénergétiques mitochondriaux induits par l’exercice
Summary
La préparation d’échantillons enrichis en mitochondries à partir de tissus solides archivés précédemment congelés a permis aux chercheurs d’effectuer des évaluations fonctionnelles et analytiques des mitochondries dans diverses modalités expérimentales. Cette étude montre comment préparer des préparations enrichies en mitochondries à partir de tissus cardiaques congelés et effectuer des évaluations analytiques des mitochondries.
Abstract
Le profil du complexe de transfert d’électrons mitochondrial (ETC) est modifié dans le tissu cardiaque de la progéniture née d’une truie exerçante. L’hypothèse proposée et testée était qu’un exercice maternel régulier d’une truie pendant la grossesse augmenterait l’efficacité mitochondriale de la bioénergétique cardiaque de la progéniture. Cette hypothèse a été testée en isolant les mitochondries à l’aide d’une procédure d’isolement léger pour évaluer les profils ETC et supercomplexes mitochondriaux. La procédure décrite ici a permis le traitement de tissus cardiaques archivés précédemment congelés et a éliminé la nécessité d’une préparation fraîche des mitochondries pour l’évaluation des complexes ETC mitochondriaux, des supercomplexes et des profils d’activité complexes ETC. Ce protocole décrit la mesure optimale du complexe protéique ETC dans l’immunoblotting multiplexé à base d’anticorps et l’évaluation super complexe à l’aide de l’électrophorèse sur gel bleu-natif.
Introduction
L’objectif de ce protocole était de fournir des étapes détaillées pour obtenir une préparation enrichie en mitochondries à partir de tissus cardiaques précédemment congelés avec une nouvelle technologie de perturbation mécanique à faible énergie des tissus qui améliore la lyse tissulaire et l’extraction des mitochondries. Avec cette méthode, une efficacité d’extraction améliorée sans générer de contrainte de cisaillement élevée ou de température élevée et un temps d’homogénéisation court (10-12 s) deviennent réalisables1.
Obtenir des mitochondries à partir de tissus congelés archivés est un atout précieux pour effectuer des études fonctionnelles2 et biochimiques3 autrement difficilement reproductibles dans les conditions expérimentales exactes. Un homogénéisateur classique en verre de pilon Potter-Elvehjem ou homogénéisateur Dounce a été utilisé et est toujours utilisé dans les laboratoires de recherche pour homogénéiser les tissus mous tels que le foie, les reins et le cerveau. Cependant, l’homogénéisation des tissus durs tels que les muscles et le cœur nécessite plus de temps d’homogénéisation, un traitement enzymatique, une homogénéisation à grande vitesse et une expérience utilisateur étendue. Ceci est désavantageux pour l’extraction d’organites intacts tels que les mitochondries des tissus durs tels que les muscles et le cœur. La méthode décrite dans ce protocole est utilisée pour obtenir une préparation enrichie en mitochondries à haut rendement pour analyser les complexes protéiques de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux (ETC) et leur formation supercomplexe dans les tissus cardiaques prélevés sur une progéniture née à une truie exercée et sédentaire, congelée dans de l’azote liquide et stockée à -80 ° C pour une utilisation future. Cette méthode permet à l’utilisateur d’isoler la préparation enrichie en mitochondries à partir de tissus archivés précédemment congelés.
L’exposition externe aux nanomatériaux aux rongeurs gravides peut affecter négativement la fonction cardiaque, la respiration mitochondriale et la bioénergétique sur la progéniture pendant la gestation4. Néanmoins, les changements positifs induits par l’exercice aérobie dans la bioénergétique des myocytes fœtaux pendant la grossesse n’ont pas encore été documentés. Cependant, de nouvelles études fournissent des preuves que l’exercice aérobique maternel pendant la grossesse a une influence positive sur la fonction cardiaque fœtale5. Afin de fournir des preuves supplémentaires, une analyse des effets longitudinaux de l’exercice maternel sur les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale cardiaque de la progéniture (c.-à-d. du complexe I au complexe V) pendant la grossesse a été effectuée.
Cette étude a une pertinence significative pour la santé puisque les résultats peuvent suggérer que l’exercice maternel améliore l’efficacité de la production d’énergie dans les mitochondries cardiaques de la progéniture. Dans cette étude, les truies (femelles porcines) ont été utilisées comme modèle animal pour deux raisons : (i) la physiologie cardiaque est similaire à celle de l’homme6, et (ii) la récolte de tissus cardiaques sur la progéniture à différents moments est réalisable sous une approbation institutionnelle de l’IACUC. L’étude proposée vise à répondre à de nombreuses questions fondamentales liant l’exercice maternel et ses effets positifs potentiels sur la composition cellulaire et biochimique du tissu cardiaque de la progéniture. Cette approche nécessite des techniques d’isolement des mitochondries douces mais efficaces à partir de tissus cardiaques précédemment congelés obtenus à partir d’études longitudinales longues et coûteuses qui ont abordé les problèmes des changements bioénergétiques dans les myocytes cardiaques fœtaux pendant la grossesse. La méthode décrite dans cette étude permet d’utiliser de grandes quantités de tissus archivés précédemment congelés pour une préparation enrichie en mitochondries pour des études analytiques et fonctionnelles. L’étude aidera également à combler le manque de connaissances dans ce domaine en fournissant des données préliminaires, ce qui pourrait conduire à de futures études déterminant les effets de l’exercice maternel sur la santé cardiaque in utero et au-delà.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques de ce protocole sont indiquées ici. Tout d’abord, l’homogénéisation des tissus doit être manipulée avec soin afin que des effets excessifs ne soient pas appliqués pendant le processus d’homogénéisation des tissus. Il faut utiliser un broyeur de tissus, qui fait partie de la technologie de cycle de pression (PCT) pour l’homogénéisation initiale des tissus9. Cette étape réduira le cycle excessif d’AVC de l’homogénéisateur verre sur verre (<strong class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu financièrement par la subvention intra-muros de l’Université de Kansas City pour Abdulbaki Agbas et la bourse de recherche d’été pour Daniel Barrera. Les auteurs sont reconnaissants pour le travail éditorial du Dr Jan Talley.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
Referências
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. . Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria–a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
