Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes
Summary
Die Aufbereitung von mit Mitochondrien angereicherten Proben aus zuvor gefrorenem archiviertem festem Gewebe ermöglichte es den Forschern, sowohl funktionelle als auch analytische Bewertungen von Mitochondrien in verschiedenen experimentellen Modalitäten durchzuführen. Diese Studie zeigt, wie man mit Mitochondrien angereicherte Präparate aus gefrorenem Herzgewebe herstellt und analytische Bewertungen von Mitochondrien durchführt.
Abstract
Das mitochondriale Elektronentransferkomplexprofil (ETC) ist im Herzgewebe der Nachkommen, die von einer trainierten Sau geboren wurden, modifiziert. Die Hypothese, die vorgeschlagen und getestet wurde, war, dass eine regelmäßige mütterliche Übung einer Sau während der Schwangerschaft die mitochondriale Effizienz der Herzbioenergetik der Nachkommen erhöhen würde. Diese Hypothese wurde getestet, indem Mitochondrien mit einem milden Isolationsverfahren isoliert wurden, um mitochondriale ETC und superkomplexe Profile zu bewerten. Das hier beschriebene Verfahren ermöglichte die Verarbeitung von zuvor gefrorenem archiviertem Herzgewebe und eliminierte die Notwendigkeit einer frischen Mitochondrienvorbereitung für die Beurteilung von mitochondrialen ETC-Komplexen, Superkomplexen und ETC-Komplex-Aktivitätsprofilen. Dieses Protokoll beschreibt die optimale ETC-Proteinkomplexmessung beim multiplexierten Antikörper-basierten Immunoblotting und der superkomplexen Bewertung mittels Blau-nativer Gelelektrophorese.
Introduction
Das Ziel dieses Protokolls war es, detaillierte Schritte zur Gewinnung eines mit Mitochondrien angereicherten Präparats aus zuvor gefrorenem Herzgewebe mit einer neuen Technologie der niederenergetischen mechanischen Störung von Gewebe bereitzustellen, die die Gewebelyse und die Extraktion von Mitochondrien verbessert. Mit diesem Verfahren wird eine verbesserte Extraktionseffizienz ohne erzeugung hoher Scherspannung oder hoher Temperatur und kurze Homogenisierungszeit (10-12 s) erreicht1.
Mitochondrien aus archiviertem gefrorenem Gewebe zu gewinnen, ist ein wertvolles Gut, um sowohl funktionelle2 als auch biochemische Studien3 durchzuführen, die sonst unter den genauen experimentellen Bedingungen nicht leicht wiederholbar sind. Ein klassischer Potter-Elvehjem Teflon Stößelglas-Homogenisator oder Dounce-Homogenisator wurde verwendet und wird immer noch in Forschungslabors verwendet, um Weichteile wie Leber, Niere und Gehirn zu homogenisieren. Die Homogenisierung von Hartgeweben wie Muskeln und Herz erfordert jedoch mehr Homogenisierungszeit, Enzymbehandlung, Hochgeschwindigkeitshomogenisierung und umfangreiche Benutzererfahrung. Dies ist nachteilig für die Extraktion intakter Organellen wie Mitochondrien aus hartem Gewebe wie Muskel und Herz. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode wird verwendet, um ein mit Mitochondrien angereichertes Präparat mit hoher Ausbeute zu erhalten, um mitochondriale Elektronentransportketten (ETC) Proteinkomplexe und ihre superkomplexe Bildung in Herzgeweben zu analysieren, die von Nachkommen geerntet werden, die von trainierten und sitzenden Sauen geboren, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung gelagert werden. Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, mit Mitochondrien angereicherte Zubereitung aus zuvor gefrorenem archiviertem Gewebe zu isolieren.
Externe Nanomaterialexposition gegenüber schwangeren Nagetieren kann die Herzfunktion und die mitochondriale Atmung und Bioenergetik von Nachkommen während der Schwangerschaft negativ beeinflussen4. Dennoch müssen aerobe, durch Bewegung induzierte positive Veränderungen der fetalen Myozyten-Bioenergetik während der Schwangerschaft noch dokumentiert werden. Neuere Studien belegen jedoch, dass mütterliche Aerobic-Übungen während der Schwangerschaft einen positiven Einfluss auf die fetale Herzfunktion haben5. Um weitere Beweise zu liefern, wurde eine Analyse der longitudinalen Auswirkungen von mütterlicher Bewegung auf kardiale mitochondriale Atmungskettenkomplexe der Nachkommen (d.h. Komplex I bis Komplex V) während der Schwangerschaft durchgeführt.
Diese Studie hat eine signifikante gesundheitliche Relevanz, da die Ergebnisse darauf hindeuten könnten, dass mütterliche Bewegung die Effizienz der Energieproduktion in den Herzmitochondrien der Nachkommen verbessert. In dieser Studie wurden Sauen (weibliches Schwein) aus zwei Gründen als Tiermodell verwendet: (i) Die Herzphysiologie ähnelt der des Menschen6 und (ii) die Herzgewebeentnahme von Nachkommen aus verschiedenen Zeitpunkten ist im Rahmen einer institutionellen IACUC-Zulassung möglich. Die vorgeschlagene Studie zielt darauf ab, viele der grundlegenden Fragen zu beantworten, die mütterliche Bewegung und ihre potenziellen positiven Auswirkungen auf die zelluläre und biochemische Zusammensetzung des Herzgewebes der Nachkommen miteinander verbinden. Dieser Ansatz erfordert sanfte, aber effektive Mitochondrien-Isolationstechniken aus zuvor gefrorenem Herzgewebe, die aus den langwierigen und kostspieligen Längsschnittstudien gewonnen wurden, die sich mit den Problemen der bioenergetischen Veränderungen in fetalen Herzmyozyten während der Schwangerschaft befassten. Die in dieser Studie beschriebene Methode ermöglicht es, große Mengen zuvor gefrorenen archivierten Gewebes für die mit Mitochondrien angereicherte Vorbereitung sowohl für analytische als auch für funktionelle Studien zu verwenden. Die Studie wird auch dazu beitragen, die Wissenslücke in diesem Bereich zu schließen, indem sie vorläufige Daten liefert, die zu zukünftigen Studien führen könnten, die die Auswirkungen von mütterlicher Bewegung auf die Herzgesundheit in utero und darüber hinaus bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die kritischen Schritte für dieses Protokoll sind hier angegeben. Erstens sollte die Gewebehomogenisierung sorgfältig gehandhabt werden, damit während des Gewebehomogenisierungsprozesses keine übermäßigen reinen Effekte angewendet werden. Es sollte ein Gewebezerkleinerer verwendet werden, der Teil der Druckzyklustechnologie (PCT) für die anfängliche Gewebehomogenisierung ist9. Dieser Schritt reduziert den übermäßigen Schlaganfallzyklus eines Glas-auf-Glas-Homogenisators (<strong class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das intramurale Stipendium der Kansas City University für Abdulbaki Agbas und das Summer Research Fellowship für Daniel Barrera finanziell unterstützt. Die Autoren sind dankbar für die redaktionelle Arbeit von Dr. Jan Talley.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
Referências
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- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
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