Misurazione dei complessi di trasferimento di elettroni mitocondriali nel tessuto cardiaco precedentemente congelato dalla prole della scrofa: un modello per valutare i cambiamenti bioenergetici mitocondriali indotti dall'esercizio
Summary
La preparazione di campioni arricchiti di mitocondri da tessuti solidi archiviati precedentemente congelati ha permesso ai ricercatori di eseguire valutazioni sia funzionali che analitiche dei mitocondri in varie modalità sperimentali. Questo studio dimostra come preparare preparati arricchiti con mitocondri dal tessuto cardiaco congelato ed eseguire valutazioni analitiche dei mitocondri.
Abstract
Il profilo del complesso di trasferimento di elettroni mitocondriale (ETC) è modificato nel tessuto cardiaco della prole nata da una scrofa esercitata. L’ipotesi proposta e testata era che un regolare esercizio materno di una scrofa durante la gravidanza avrebbe aumentato l’efficienza mitocondriale della bioenergetica cardiaca della prole. Questa ipotesi è stata testata isolando i mitocondri utilizzando una procedura di isolamento lieve per valutare l’ETC mitocondriale e i profili supercomplessi. La procedura qui descritta ha permesso l’elaborazione di tessuti cardiaci archiviati precedentemente congelati ed ha eliminato la necessità di una preparazione di mitocondri freschi per la valutazione di complessi ETC mitocondriali, supercomplessi e profili di attività complessi ETC. Questo protocollo descrive la misurazione ottimale del complesso proteico ETC nell’immunoblotting a base di anticorpi multiplexati e nella valutazione super complessa utilizzando l’elettroforesi su gel blu-nativa.
Introduction
L’obiettivo di questo protocollo era quello di fornire passaggi dettagliati per ottenere una preparazione arricchita con mitocondri da tessuto cardiaco precedentemente congelato con una nuova tecnologia di interruzione meccanica a bassa energia del tessuto che migliora la lisi tissutale e l’estrazione dei mitocondri. Con questo metodo, è possibile migliorare l’efficienza di estrazione senza generare elevate sollecitazioni di taglio o alte temperature e tempi di omogeneizzazione brevi (10-12 s)12 s1.
Ottenere mitocondri da tessuti congelati archiviati è una risorsa preziosa per eseguire studi sia funzionali2 che biochimici3 altrimenti non facilmente ripetibili nelle esatte condizioni sperimentali. Un classico omogeneizzatore di vetro per pestelli Potter-Elvehjem Teflon o omogeneizzatore Dounce è stato utilizzato ed è ancora utilizzato nei laboratori di ricerca per omogeneizzare i tessuti molli come fegato, reni e cervello. Tuttavia, l’omogeneizzazione dei tessuti duri come muscoli e cuore richiede più tempo di omogeneizzazione, trattamento enzimatico, omogeneizzazione ad alta velocità e ampia esperienza utente. Questo è svantaggioso per l’estrazione di organelli intatti come i mitocondri da tessuti duri come muscoli e cuore. Il metodo descritto in questo protocollo viene utilizzato per ottenere una preparazione arricchita con mitocondri ad alto rendimento per analizzare i complessi proteici della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali (ETC) e la loro formazione di supercomplessi nei tessuti cardiaci raccolti dalla prole nati da scrofe esercitate e sedentarie, congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C per un uso futuro. Questo metodo consente all’utente di isolare la preparazione arricchita con mitocondri da tessuti archiviati precedentemente congelati.
L’esposizione di nanomateriali esterni a roditori gravidi può influenzare negativamente la funzione cardiaca e la respirazione mitocondriale e la bioenergetica sulla progenie durante la gestazione4. Tuttavia, i cambiamenti positivi indotti dall’esercizio aerobico nella bioenergetica dei miociti fetali durante la gravidanza devono ancora essere documentati. Tuttavia, studi emergenti forniscono la prova che l’esercizio aerobico materno durante la gravidanza ha un’influenza positiva sulla funzione cardiaca fetale5. Al fine di fornire ulteriori prove, è stata eseguita un’analisi degli effetti longitudinali dell’esercizio materno sui complessi della catena respiratoria mitocondriale cardiaca della prole (cioè dal complesso I al complesso V) durante la gravidanza.
Questo studio ha una significativa rilevanza per la salute poiché i risultati possono suggerire che l’esercizio materno migliora l’efficienza della produzione di energia nei mitocondri cardiaci della prole. In questo studio, le scrofe (suine femmine) sono state utilizzate come modello animale per due motivi: (i) la fisiologia cardiaca è simile a quella umana6 e (ii) la raccolta di tessuto cardiaco dalla prole da diversi punti temporali è fattibile sotto un’approvazione istituzionale IACUC. Lo studio proposto mira a rispondere a molte delle domande fondamentali che collegano l’esercizio materno e i suoi potenziali effetti positivi sulla composizione cellulare e biochimica del tessuto cardiaco della prole. Questo approccio richiede tecniche di isolamento dei mitocondri delicati ma efficaci da tessuto cardiaco precedentemente congelato ottenuto da lunghi e costosi studi longitudinali che hanno affrontato i problemi dei cambiamenti bioenergetici all’interno dei miociti cardiaci fetali durante la gravidanza. Il metodo descritto in questo studio consente di utilizzare grandi somme di tessuto archiviato precedentemente congelato per la preparazione arricchita di mitocondri sia per studi analitici che funzionali. Lo studio contribuirà anche a colmare il divario di conoscenze in questo campo fornendo dati preliminari, che potrebbero portare a studi futuri che determinano gli effetti dell’esercizio materno sulla salute del cuore in utero e oltre.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi critici per questo protocollo sono indicati qui. In primo luogo, l’omogeneizzazione dei tessuti deve essere gestita con cura in modo che non vengano applicati effetti eccessivi durante il processo di omogeneizzazione dei tessuti. Dovrebbe essere utilizzato un trituratore di tessuti, che fa parte della tecnologia del ciclo di pressione (PCT) per l’omogeneizzazione iniziale dei tessuti9. Questo passaggio ridurrà l’eccessivo ciclo di corsa dell’omogeneizzatore vetro su vetro (<strong clas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla sovvenzione intramurale della Kansas City University per Abdulbaki Agbas e dalla Summer Research Fellowship per Daniel Barrera. Gli autori sono grati per il lavoro editoriale del Dr. Jan Talley.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
Referências
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