Daha Önce Dondurulmuş Kardiyak Dokudaki Mitokondriyal Elektron Transfer Komplekslerinin Sow'un Yavrularından Ölçülmesi: Egzersize Bağlı Mitokondriyal Biyoenergetik Değişikliklerini Değerlendirmek için Bir Model
Summary
Daha önce dondurulmuş arşivlenmiş katı dokulardan mitokondri ile zenginleştirilmiş örneklerin hazırlanması, araştırmacıların çeşitli deneysel yöntemlerde mitokondrilerin hem fonksiyonel hem de analitik değerlendirmelerini yapmalarına izin verdi. Bu çalışma, donmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatların nasıl hazırlanacağını ve mitokondrilerin analitik değerlendirmelerinin nasıl yapıldığını göstermektedir.
Abstract
Mitokondriyal elektron transfer kompleksi (ETC) profili, egzersiz yapılan bir ekimden doğan yavruların kalp dokusunda modifiye edilir. Önerilen ve test edilen hipotez, hamilelik sırasında bir ekimin düzenli bir anne egzersizinin yavru kalp biyoenergetiklerinin mitokondriyal verimliliğini artıracağıydı. Bu hipotez, mitokondriyal ETC ve süperkompleks profillerini değerlendirmek için hafif izolasyon prosedürü kullanılarak mitokondri izole edilmesiyle test edildi. Burada açıklanan prosedür, daha önce dondurulmuş arşivlenmiş kalp dokularının işlenmesine izin verdi ve mitokondriyal ETC komplekslerinin, süperkomplekslerin ve ETC karmaşık aktivite profillerinin değerlendirilmesi için taze mitokondri hazırlığının gerekliliğini ortadan kaldırdı. Bu protokol, çok katlı antikor bazlı immünoblojlamada optimal ETC protein kompleksi ölçümünü ve mavi-yerli jel elektroforezi kullanılarak süper karmaşık değerlendirmeyi açıklar.
Introduction
Bu protokolün amacı, doku lizizini ve mitokondri ekstraksiyonunu iyileştiren düşük enerjili dokuların düşük enerjili mekanik bozulması teknolojisi ile daha önce dondurulmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparat elde etmek için ayrıntılı adımlar sağlamaktı. Bu yöntemle, yüksek kesme stresi veya yüksek sıcaklık ve kısa homojenizasyon süresi (10-12 s) üretmeden ekstraksiyon verimliliğinin artırılması ulaşılabilir hale gelir1.
Arşivlenmiş donmuş dokudan mitokondri elde etmek, hem fonksiyonel2 hem de biyokimyasal çalışmaları gerçekleştirmek için değerli bir varlıktır3 aksi takdirde tam deneysel koşullar altında kolayca tekrarlanamaz. Klasik bir Potter-Elvehjem Teflon pestle cam homojenizatörü veya Dounce homojenizatörü kullanılmıştır ve hala karaciğer, böbrek ve beyin gibi yumuşak dokuları homojenize etmek için araştırma laboratuvarlarında kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kas ve kalp gibi homojenizasyon sert dokuları daha fazla homojenizasyon süresi, enzim tedavisi, yüksek hızlı homojenizasyon ve kapsamlı kullanıcı deneyimi gerektirir. Bu, mitokondri gibi bozulmamış organelleri kas ve kalp gibi sert dokulardan çıkarmak için dezavantajlıdır. Bu protokolde açıklanan yöntem, mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) protein komplekslerini ve bunların egzersiz ve sedanter ekime doğan yavrulardan hasat edilen, sıvı nitrojende flash dondurulan ve gelecekteki kullanım için -80 °C’de depolanan kalp dokularındaki süperkompleks oluşumunu analiz etmek için yüksek verimli mitokondri bakımından zenginleştirilmiş preparat elde etmek için kullanılır. Bu yöntem, kullanıcının daha önce dondurulmuş arşivlenmiş dokulardan mitokondri zenginleştirilmiş preparatını izole etmesini sağlar.
Hamile kemirgenlere dış nanomalzeme maruziyeti, gebelik sırasında kalp fonksiyonunu ve mitokondriyal solunumu ve biyoenergetikleri olumsuz yönde etkileyebilir4. Bununla birlikte, gebelikte fetal miyosit biyoenergetiklerinde aerobik egzersize bağlı olumlu değişiklikler henüz belgelenmiştir. Bununla birlikte, ortaya çıkan çalışmalar, hamilelik sırasında anne aerobik egzersizin fetal kardiyak fonksiyon üzerinde olumlu bir etkisi olduğuna dair kanıtlar samaktadır5. Daha fazla kanıt sağlamak için, gebelik sırasında anne egzersizinin yavru kardiyak mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri (yani Kompleks I’den Kompleks V’ye) üzerindeki uzunlamasına etkilerinin analizi yapıldı.
Sonuçlar, anne egzersizinin yavruların kardiyak mitokondrilerinde enerji üretiminin verimliliğini artırdığını düşündürebileceğinden, bu çalışmanın sağlıkla önemli bir ilgisi vardır. Bu çalışmada, ekmekler (dişi domuz) iki nedenden dolayı hayvan modeli olarak kullanılmıştır: (i) kardiyak fizyoloji insan6’ya benzer ve (ii) farklı zaman noktalarından yavrulardan kalp dokusu hasadı kurumsal bir IACUC onayı altında mümkündür. Önerilen çalışma, anne egzersizini ve yavruların kalp dokusunun hücresel ve biyokimyasal makyajı üzerindeki potansiyel olumlu etkilerini bağlayan temel soruların çoğunu yanıtlamayı amaçlamaktadır. Bu yaklaşım, gebelik sırasında fetal kardiyak miyositler içindeki biyoenergetik değişikliklerin sorunlarını ele alan uzun ve maliyetli boyuna çalışmalardan elde edilen daha önce dondurulmuş kardiyak dokudan nazik ama etkili mitokondri izolasyon teknikleri gerektirir. Bu çalışmada açıklanan yöntem, hem analitik hem de fonksiyonel çalışmalar için mitokondri ile zenginleştirilmiş hazırlık için daha önce dondurulmuş arşivlenmiş dokunun büyük miktarda kullanılmasını sağlar. Çalışma ayrıca, anne egzersizinin rahim ve ötesinde kalp sağlığı üzerindeki etkilerini belirleyen gelecekteki çalışmalara yol açabilecek ön veriler sağlayarak bu alandaki bilgi boşluğunun doldurulmasına yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için kritik adımlar burada belirtilmiştir. İlk olarak, doku homojenizasyonu işlemi sırasında aşırı saf etkilerin uygulanmaması için doku homojenizasyonu dikkatlice ele alınmalıdır. İlk doku homojenizasyonu için basınç döngüsü teknolojisinin (PCT) bir parçası olan bir doku parçalayıcı kullanılmalıdır9. Bu adım, donmuş doku koşulları nedeniyle zaten kırılgan olan mitokondrileri daha da tahrip edebilecek cam üzerine cam homojenizatörün (<strong class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kansas City Üniversitesi’nin Abdulbaki Agbas için intramural hibesi ve Daniel Barrera için Yaz Araştırma Bursu ile finansal olarak desteklendi. Yazarlar Dr. Jan Talley’nin editörlük çalışmaları için minnettarlar.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
Referências
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. . Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria–a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
