Medición de complejos de transferencia de electrones mitocondriales en tejido cardíaco previamente congelado de la descendencia de cerda: un modelo para evaluar los cambios bioenergéticos mitocondriales inducidos por el ejercicio
Summary
La preparación de muestras enriquecidas con mitocondrias a partir de tejidos sólidos archivados previamente congelados permitió a los investigadores realizar evaluaciones funcionales y analíticas de las mitocondrias en diversas modalidades experimentales. Este estudio demuestra cómo preparar preparaciones enriquecidas con mitocondrias a partir de tejido cardíaco congelado y realizar evaluaciones analíticas de las mitocondrias.
Abstract
El perfil del complejo de transferencia de electrones mitocondrial (ETC) se modifica en el tejido cardíaco de la descendencia nacida de una cerda ejercitada. La hipótesis propuesta y probada fue que un ejercicio materno regular de una cerda durante el embarazo aumentaría la eficiencia mitocondrial de la bioenergética cardíaca de la descendencia. Esta hipótesis se probó mediante el aislamiento de mitocondrias mediante un procedimiento de aislamiento leve para evaluar la ETC mitocondrial y los perfiles supercomplejos. El procedimiento descrito aquí permitió el procesamiento de tejidos cardíacos archivados previamente congelados y eliminó la necesidad de una preparación de mitocondrias frescas para la evaluación de complejos ETC mitocondriales, supercomplejos y perfiles de actividad compleja ETC. Este protocolo describe la medición óptima del complejo de proteínas ETC en la inmunoblotting basada en anticuerpos multiplexados y la evaluación súper compleja utilizando electroforesis en gel nativo azul.
Introduction
El objetivo de este protocolo era proporcionar pasos detallados para obtener una preparación enriquecida con mitocondrias a partir de tejido cardíaco previamente congelado con una nueva tecnología de interrupción mecánica de baja energía del tejido que mejora la lisis tisular y la extracción de mitocondrias. Con este método, se puede lograr una mayor eficiencia de extracción sin generar altas tensiones de cizallamiento o alta temperatura y un corto tiempo de homogeneización (10-12 s)10.0001.
Obtener mitocondrias a partir de tejido congelado archivado es un activo valioso para realizar estudios funcionales2 y bioquímicos3, de lo contrario no sería fácilmente repetible en las condiciones experimentales exactas. Se ha utilizado un homogeneizador de vidrio de mortero de teflón clásico Potter-Elvehjem o homogeneizador Dounce y todavía se usa en laboratorios de investigación para homogeneizar tejidos blandos como el hígado, el riñón y el cerebro. Sin embargo, la homogeneización de tejidos duros como el músculo y el corazón requiere más tiempo de homogeneización, tratamiento enzimático, homogeneización de alta velocidad y una amplia experiencia de usuario. Esto es desventajoso para extraer orgánulos intactos, como las mitocondrias, del tejido duro, como el músculo y el corazón. El método descrito en este protocolo se utiliza para obtener una preparación enriquecida con mitocondrias de alto rendimiento para analizar complejos de proteínas de cadena de transporte de electrones mitocondriales (ETC) y su formación supercompleja en tejidos cardíacos cosechados de crías nacidas de cerdas ejercitadas y sedentarias, congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80 ° C para su uso futuro. Este método permite al usuario aislar la preparación enriquecida con mitocondrias de tejidos archivados previamente congelados.
La exposición externa a nanomateriales a roedores preñados puede afectar negativamente la función cardíaca y la respiración mitocondrial y la bioenergética de la progenie durante la gestación4. Sin embargo, los cambios positivos inducidos por el ejercicio aeróbico en la bioenergética de los miocitos fetales durante el embarazo aún no se han documentado. Sin embargo, estudios emergentes aportan evidencia de que el ejercicio aeróbico materno durante el embarazo tiene una influencia positiva en la función cardíaca fetal5. Con el fin de proporcionar más evidencia, se realizó un análisis de los efectos longitudinales del ejercicio materno sobre los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial cardíaca de la descendencia (es decir, del Complejo I al Complejo V) durante el embarazo.
Este estudio tiene una relevancia significativa para la salud, ya que los resultados pueden sugerir que el ejercicio materno mejora la eficiencia de la producción de energía en las mitocondrias cardíacas de la descendencia. En este estudio, las cerdas (cerdo hembra) se utilizaron como modelo animal por dos razones: (i) la fisiología cardíaca es similar a la humana6, y (ii) la recolección de tejido cardíaco de la descendencia de diferentes puntos de tiempo es factible bajo una aprobación institucional de la IACUC. El estudio propuesto tiene como objetivo responder a muchas de las preguntas fundamentales que vinculan el ejercicio materno y sus posibles efectos positivos en la composición celular y bioquímica del tejido cardíaco de la descendencia. Este enfoque requiere técnicas de aislamiento de mitocondrias suaves pero efectivas a partir de tejido cardíaco previamente congelado obtenido de los largos y costosos estudios longitudinales que abordaron los problemas de los cambios bioenergéticos dentro de los miocitos cardíacos fetales durante el embarazo. El método descrito en este estudio permite utilizar grandes sumas de tejido archivado previamente congelado para la preparación enriquecida con mitocondrias para estudios analíticos y funcionales. El estudio también ayudará a llenar el vacío de conocimiento en este campo al proporcionar datos preliminares, lo que podría conducir a futuros estudios que determinen los efectos del ejercicio materno en la salud cardíaca en el útero y más allá.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos para este protocolo se indican aquí. En primer lugar, la homogeneización de tejidos debe manejarse cuidadosamente para que no se apliquen efectos excesivos durante el proceso de homogeneización de tejidos. Se debe utilizar una trituradora de tejidos, que forma parte de la tecnología de ciclo de presión (PCT) para la homogeneización inicial de tejidos9. Este paso reducirá el ciclo de carrera excesivo del homogeneizador de vidrio sobre vidrio (Figura 1…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente por la subvención intramuros de la Universidad de Kansas City para Abdulbaki Agbas y la Beca de Investigación de Verano para Daniel Barrera. Los autores están agradecidos por el trabajo editorial del Dr. Jan Talley.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
Referências
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. . Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria–a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
