Измерение митохондриальных комплексов переноса электронов в ранее замороженной сердечной ткани от потомства свиноматки: модель для оценки изменений митохондриальной биоэнергетики, вызванных физической нагрузкой
Summary
Подготовка образцов, обогащенных митохондриями, из ранее замороженных архивных твердых тканей позволила исследователям выполнить как функциональные, так и аналитические оценки митохондрий в различных экспериментальных модальностях. Это исследование демонстрирует, как готовить обогащенные митохондриями препараты из замороженной сердечной ткани и выполнять аналитические оценки митохондрий.
Abstract
Профиль митохондриального комплекса переноса электронов (ETC) модифицируется в сердечной ткани потомства, рожденного от тренированной свиноматки. Предложенная и проверенная гипотеза заключалась в том, что регулярное материнское упражнение свиноматки во время беременности повысит митохондриальную эффективность биоэнергетики сердца потомства. Эта гипотеза была проверена путем выделения митохондрий с использованием процедуры мягкой изоляции для оценки митохондриальных внеземных и суперкомплексных профилей. Описанная здесь процедура позволила обработать ранее замороженные архивные ткани сердца и исключила необходимость подготовки свежих митохондрий для оценки митохондриальных комплексов внеземных цивилизаций, суперкомплексов и сложных профилей активности внеземных цивилизаций. Этот протокол описывает оптимальное измерение белкового комплекса ETC в мультиплексированном иммуноблоттинге на основе антител и суперсложную оценку с использованием электрофореза синего геля.
Introduction
Цель этого протокола состояла в том, чтобы предоставить подробные шаги для получения обогащенного митохондриями препарата из ранее замороженной сердечной ткани с новой технологией низкоэнергетического механического разрушения ткани, которая улучшает лизис тканей и извлечение митохондрий. При этом методе повышается эффективность экстракции без создания высокого напряжения сдвига или высокой температуры и достигается короткое время гомогенизации (10-12 с)1.
Получение митохондрий из архивной замороженной ткани является ценным активом для выполнения как функциональных2 , так и биохимических исследований3, которые в противном случае нелегко повторить в точных экспериментальных условиях. Классический гомогенизатор стекла Potter-Elvehjem Teflon pestle или гомогенизатор Dounce использовался и до сих пор используется в исследовательских лабораториях для гомогенизации мягких тканей, таких как печень, почки и мозг. Тем не менее, гомогенизация твердых тканей, таких как мышцы и сердце, требует большего времени гомогенизации, ферментной обработки, высокоскоростной гомогенизации и обширного пользовательского опыта. Это невыгодно для извлечения интактных органелл, таких как митохондрии, из твердых тканей, таких как мышцы и сердце. Способ, описанный в этом протоколе, используется для получения высокопродуктивного обогащенного митохондриями препарата для анализа белковых комплексов митохондриальной электронной транспортной цепи (ETC) и их суперкомплексного образования в тканях сердца, собранных от потомства, рожденного от тренируемой и сидячей свиноматки, замороженного в жидком азоте и хранящегося при -80 °C для будущего использования. Этот метод позволяет пользователю изолировать обогащенный митохондриями препарат из ранее замороженных архивных тканей.
Внешнее воздействие наноматериалов на беременных грызунов может негативно повлиять на сердечную функцию и митохондриальное дыхание и биоэнергетику на потомство во время беременности4. Тем не менее, вызванные аэробными упражнениями положительные изменения в биоэнергетике миоцитов плода во время беременности еще предстоит задокументировать. Тем не менее, новые исследования свидетельствуют о том, что материнские аэробные упражнения во время беременности оказывают положительное влияние на сердечную функцию плода5. Чтобы предоставить дополнительные доказательства, был проведен анализ продольного воздействия материнских упражнений на митохондриальные комплексы дыхательной цепи сердца потомства (т.е. комплекс I через комплекс V) во время беременности.
Это исследование имеет важное значение для здоровья, поскольку результаты могут свидетельствовать о том, что материнские физические упражнения улучшают эффективность производства энергии в сердечных митохондриях потомства потомства. В этом исследовании свиноматки (самки свиней) использовались в качестве животной модели по двум причинам: (i) физиология сердца аналогична человеческой6, и (ii) сбор сердечной ткани у потомства из разных временных периодов возможен при институциональном одобрении IACUC. Предлагаемое исследование направлено на то, чтобы ответить на многие фундаментальные вопросы, связывающие материнские физические упражнения и их потенциальное положительное влияние на клеточный и биохимический состав сердечной ткани потомства. Этот подход требует мягких, но эффективных методов выделения митохондрий из ранее замороженной сердечной ткани, полученных в результате длительных и дорогостоящих продольных исследований, которые рассматривали вопросы биоэнергетических изменений в сердечных миоцитах плода во время беременности. Метод, описанный в данном исследовании, позволяет использовать большие суммы ранее замороженной архивной ткани для обогащенной митохондриями подготовки как для аналитических, так и для функциональных исследований. Исследование также поможет заполнить пробел в знаниях в этой области, предоставив предварительные данные, которые могут привести к будущим исследованиям, определяющим влияние материнских упражнений на здоровье сердца в утробе матери и за ее пределами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги для этого протокола указаны здесь. Во-первых, гомогенизация тканей должна быть тщательно обработана, чтобы во время процесса гомогенизации тканей не применялись чрезмерные эффекты. Следует использовать тканевой измельчитель, который является частью технологии цикли…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансово поддержана внутренним грантом Университета Канзас-Сити для Абдулбаки Агбаса и Летней исследовательской стипендией для Даниэля Барреры. Авторы благодарны за редакционную работу доктора Яна Тэлли.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
Referências
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. . Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria–a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
