ソウの子孫から以前に凍結した心臓組織におけるミトコンドリア電子伝達複合体の測定:運動誘発ミトコンドリアバイオエネルギーの変化を評価するモデル
Summary
以前に凍結したアーカイブされた固体組織からのミトコンドリア濃縮サンプルを調製し、研究者は様々な実験モダリティでミトコンドリアの機能的および分析的評価を行うことを可能にした。この研究は、凍結した心臓組織からミトコンドリア濃縮製剤を調製し、ミトコンドリアの分析評価を行う方法を示す。
Abstract
ミトコンドリア電子移動複合体(ETC)プロファイルは、運動した種まきに生まれた子孫の心臓組織で修飾され、提案され、テストされた仮説は、妊娠中の種まきの定期的な母親の運動は、子孫の心臓の生体エネルギーのミトコンドリア効率を増加させるだろうという仮説でした。この仮説は、ミトコンドリアETCおよび超複合体プロファイルを評価するための軽度の分離手順を用いてミトコンドリアを単離することによって試験された。ここで説明した手順は、以前に凍結されたアーカイブされた心臓組織の処理を可能にし、ミトコンドリアETC複合体、超複合体、およびETC複合体の評価のための新鮮なミトコンドリア調製の必要性を排除した。このプロトコルは、青色天然ゲル電気泳動を用いた多重化抗体ベースの免疫ブロット法および超複合評価における最適なETCタンパク質複合体測定について説明する。
Introduction
このプロトコルの目的は、以前に凍結した心臓組織からミトコンドリア濃縮製剤を得るための詳細なステップを提供し、組織のリシスとミトコンドリアの抽出を改善する組織の低エネルギー機械的破壊の新技術を提供することであった。この方法により、高い剪断応力や高温と短い均質化時間(10-12s)を発生させることなく抽出効率が向上する1。
アーカイブされた凍結組織からミトコンドリアを得ることは、機能的2 および生化学的研究の両方を行う貴重な資産である3 それ以外の場合は、正確な実験条件下で容易に再現できない。古典的なポッター・エルフェイェム・テフロン・ペスルガラスホモジナイザーまたはDounceホモジナイザーが使用されており、肝臓、腎臓、脳などの軟部組織を均質化するために研究ラボで使用されています。しかし、筋肉や心臓などの硬い組織を均質化するには、より均質化時間、酵素処理、高速均質化、および広範なユーザー体験が必要です。これは、筋肉や心臓などの硬い組織からミトコンドリアなどの無傷のオルガネラを抽出する場合には不利です。本プロトコルに記載されている方法は、ミトコンドリア電子輸送鎖(ETC)タンパク質複合体およびそれらの超錯体形成を、生まれた子孫から採取した心臓組織中の超錯体形成を分析するための高収量ミトコンドリア濃縮製剤を得るために使用され、運動および座りっぱなしの種まき、液体窒素中でフラッシュ凍結、および-80°Cで保存され、将来の使用のために保存される。この方法により、ユーザは、以前に凍結されたアーカイブ組織からミトコンドリア濃縮製剤を分離することができる。
妊娠中のげっ歯類への外部ナノ材料暴露は、妊娠4の間に心機能およびミトコンドリア呼吸および生物エネルギーに悪影響を及ぼす可能性がある。それにもかかわらず、妊娠中の胎児筋細胞生物エネルギーの有酸素運動誘発陽性変化はまだ文書化されていない。しかし、新たな研究は、妊娠中の母親の有酸素運動が胎児の心機能にプラスの影響を与える証拠を提供する5。さらなる証拠を提供するために、妊娠中の母体運動が胎児の心臓ミトコンドリア呼吸鎖複合体(すなわち、コンプレックスIからコンプレックスV)に及ぼす縦方向の影響の分析が行われた。
この研究は、母親の運動が子孫の心臓ミトコンドリアにおけるエネルギー産生の効率を向上させる可能性があるため、健康に有意な関連性を有する。本研究では、雌豚(雌豚)は、(i)心臓生理学はヒト6に類似しており、(ii)異なる時点から子孫からの心臓組織収穫が制度的なIACUC承認の下で実現可能である2つの理由で動物モデルとして使用された。提案された研究は、母親の運動とその潜在的な肯定的な効果が子孫の心臓組織の細胞および生化学的構成に及ぼす基本的な質問の多くを答えることを目的としています。このアプローチは、妊娠中の胎児心筋細胞内の生体エネルギー変化の問題に対処した長く高価な縦断研究から得られた以前に凍結した心臓組織からの穏やかで効果的なミトコンドリア分離技術を必要とする。本研究で説明された方法は、分析および機能研究の両方のためのミトコンドリア濃縮調製物のために、以前に凍結されたアーカイブされた組織の大量を利用することを可能にする。この研究はまた、予備的なデータを提供することによって、この分野の知識のギャップを埋めるのに役立ち、子宮内およびそれ以降の心臓の健康に対する母親の運動の影響を決定する将来の研究につながる可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの重要な手順をここに示します。まず、組織均質化プロセス中に過剰な効果が適用されないように、組織均質化を慎重に行う必要があります。初期組織均質化のための圧力サイクリング技術(PCT)の一部であるティッシュシュレッダーを使用する必要があります9。このステップは、凍結組織状態のために既に脆弱なミトコンドリアをさらに破壊する可能性のあ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カンザスシティ大学のアブドゥルバキ・アグバスに対する壁内助成金とダニエル・バレラの夏の研究フェローシップによって財政的に支援されました。著者たちはヤン・タリー博士の編集作業に感謝しています。
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
Referências
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