Medindo complexos de transferência de elétrons mitocondrial em tecido cardíaco previamente congelado da prole da porca: um modelo para avaliar alterações bioenergetics mitocondrial induzidas pelo exercício
Summary
A preparação de amostras enriquecidas com mitocôndrias de tecidos sólidos arquivados previamente congelados permitiu que os pesquisadores realizassem avaliações funcionais e analíticas de mitocôndrias em várias modalidades experimentais. Este estudo demonstra como preparar preparações enriquecidas com mitocôndrias a partir de tecido cardíaco congelado e realizar avaliações analíticas de mitocôndrias.
Abstract
O perfil do complexo de transferência de elétrons mitocondrial (ETC) é modificado no tecido cardíaco da prole nascido em uma porca exercida. A hipótese proposta e testada foi que um exercício materno regular de uma porca durante a gravidez aumentaria a eficiência mitocondrial da bioenergetic do coração da prole. Essa hipótese foi testada por mitocôndrias isolando utilizando um procedimento de isolamento leve para avaliar perfis mitocondriais etc e supercomplexo. O procedimento aqui descrito permitiu o processamento de tecidos cardíacos arquivados previamente congelados e eliminou a necessidade de preparação de mitocôndrias frescas para a avaliação de complexos etc mitocondrial, supercomplexos e perfis de atividades complexas etc. Este protocolo descreve a medição ideal do complexo proteico ETC em imunoblotting baseado em anticorpos multiplexados e avaliação super complexa usando eletroforese de gel azul-nativa.
Introduction
O objetivo deste protocolo foi fornecer passos detalhados para obter a preparação enriquecida com mitocôndrias a partir de tecido cardíaco previamente congelado com uma nova tecnologia de interrupção mecânica de baixa energia do tecido que melhora a lise tecidual e a extração de mitocôndrias. Com este método, a melhoria da eficiência extração sem gerar alto estresse de tesoura ou alta temperatura e curto tempo de homogeneização (10-12 s) tornam-se alcançáveis1.
Obter mitocôndrias a partir de tecido congelado arquivado é um ativo valioso para realizar estudos funcionais2 e bioquímicos3, caso contrário, não facilmente repetível sob as condições experimentais exatas. Um clássico homogeneizador de vidro de pilão Potter-Elvehjem Teflon ou homogeneizador de dounce tem sido usado e ainda está sendo usado em laboratórios de pesquisa para homogeneizar tecidos moles como fígado, rim e cérebro. No entanto, homogeneizar tecidos duros como músculo e coração requer mais tempo de homogeneização, tratamento enzimático, homogeneização de alta velocidade e ampla experiência do usuário. Isso é desvantajoso para extrair organelas intactas, como mitocôndrias de tecido duro, como músculo e coração. O método descrito neste protocolo é usado para obter uma preparação enriquecida com mitocôndrias de alto rendimento para analisar complexos proteicos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) e sua formação supercomplexa em tecidos cardíacos colhidos de descendentes nascidos a porcas exercitadas e sedentárias, congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C para uso futuro. Este método permite que o usuário isole a preparação enriquecida de mitocôndrias de tecidos arquivados previamente congelados.
A exposição nanomaterial externa a roedores gestantes pode afetar negativamente a função cardíaca e a respiração mitocondrial e bioenergésicos na prole durante a gestação4. No entanto, as alterações positivas induzidas pelo exercício aeróbico nos bioenergésicos do miócito fetal durante a gravidez ainda não foram documentadas. No entanto, estudos emergentes fornecem evidências de que o exercício aeróbico materno durante a gravidez tem uma influência positiva na função cardíaca fetal5. Para fornecer mais evidências, foi realizada uma análise dos efeitos longitudinais do exercício materno nos complexos da cadeia respiratória mitocondrial cardíaca (ou seja, Complexo I através do Complexo V) durante a gravidez.
Este estudo tem relevância significativa para a saúde, uma vez que os resultados podem sugerir que o exercício materno melhora a eficiência da produção de energia nas mitocôndrias cardíacas da prole. Neste estudo, as porcas (porcas fêmeas) foram utilizadas como modelo animal por duas razões: (i) a fisiologia cardíaca é semelhante à humana6, e (ii) a colheita de tecido cardíaco de descendentes de diferentes pontos de tempo é viável sob aprovação institucional da IACUC. O estudo proposto tem como objetivo responder a muitas das questões fundamentais que ligam o exercício materno e seus potenciais efeitos positivos na composição celular e bioquímica do tecido cardíaco da prole. Esta abordagem requer técnicas suaves, mas eficazes de isolamento de mitocôndrias de tecido cardíaco previamente congelado obtido a partir dos longos e caros estudos longitudinais que abordaram as questões das alterações bioenergésticas dentro dos miócitos cardíacos fetais durante a gravidez. O método descrito neste estudo permite utilizar grandes somas de tecido arquivado previamente congelado para preparação enriquecida com mitocôndrias para estudos analíticos e funcionais. O estudo também ajudará a preencher a lacuna de conhecimento nesse campo, fornecendo dados preliminares, o que poderia levar a estudos futuros determinando os efeitos do exercício materno sobre a saúde do coração no útero e além.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos críticos para este protocolo estão indicados aqui. Em primeiro lugar, a homogeneização do tecido deve ser cuidadosamente tratada para que efeitos excessivos não sejam aplicados durante o processo de homogeneização do tecido. Deve-se utilizar um triturador de tecidos, que faz parte da tecnologia de ciclismo de pressão (PCT) para homogeneização inicial do tecido9. Esta etapa reduzirá o ciclo excessivo de avc do homogeneizador de vidro em vidro (Figura 1B</st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela bolsa intramuros da Universidade de Kansas City para Abdulbaki Agbas e Summer Research Fellowship para Daniel Barrera. Os autores agradecem pelo trabalho editorial do Dr. Jan Talley.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
Referências
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