Summary
هنا ، نصف طريقة مراقبة غير جراحية تتضمن تعبير لوسيفيراز وبروتين الفلورسنت الأخضر في خطوط خلايا سرطان الثدي المختلفة. يوفر هذا البروتوكول تقنية لمراقبة تكوين الورم والاستعمار النقيلي في الوقت الفعلي في الفئران.
Abstract
سرطان الثدي هو ورم خبيث غير متجانس متكرر والسبب الرئيسي الثاني للوفيات لدى النساء ، ويرجع ذلك أساسا إلى ورم خبيث في الأعضاء البعيدة. تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية ، بما في ذلك نماذج الفئران العظمية المستخدمة على نطاق واسع ، حيث يتم حقن الخلايا السرطانية في وسادة الدهون الثديية. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه النماذج المساعدة في مراقبة حركية نمو الورم والاستعمار النقيلي. الأدوات المتطورة لمراقبة الخلايا السرطانية في الوقت الحقيقي في الفئران ستعزز بشكل كبير فهم بيولوجيا الورم.
هنا ، تم إنشاء خطوط خلايا سرطان الثدي التي تعبر بثبات عن luciferase وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). على وجه التحديد ، تحتوي هذه التقنية على خطوتين متتابعتين بدأتا بقياس نشاط luciferase في المختبر وتليها زرع الخلايا السرطانية في منصات الدهون الثديية للفئران غير البدينة. بعد الحقن ، تتم مراقبة كل من نمو الورم والاستعمار النقيلي في الوقت الفعلي بواسطة نظام التصوير غير الباضع. بعد ذلك ، سيتم فحص القياس الكمي للنقائل المعبرة عن GFP في الرئتين بواسطة المجهر الفلوري للتحقق من صحة نتائج التلألؤ الحيوي المرصودة. يقوم هذا النظام المتطور الذي يجمع بين أدوات الكشف القائمة على اللوسيفيراز والتألق بتقييم ورم خبيث للسرطان في الجسم الحي ، والذي يتمتع بإمكانات كبيرة للاستخدام في علاجات سرطان الثدي وإدارة الأمراض.
Introduction
سرطان الثدي هي أنواع متكررة من السرطان في جميع أنحاء العالم ، مع ما يقرب من 250،000 حالة جديدة يتم تشخيصها كل عام في الولايات المتحدة1. على الرغم من ارتفاع معدل الإصابة به ، إلا أن مجموعة جديدة من الأدوية المضادة للسرطان قد حسنت بشكل كبير نتائج مرضى سرطان الثدي2. ومع ذلك ، لا تزال هذه العلاجات غير كافية ، حيث يعاني العديد من المرضى من انتكاس المرض وانتشاره النقيلي إلى الأعضاء الحيوية2 ، وهو السبب الرئيسي لاعتلال المرضى ووفياتهم. لذلك ، فإن أحد التحديات الرئيسية في أبحاث سرطان الثدي هو تحديد الآليات الجزيئية التي تنظم تكوين النقائل البعيدة لتطوير وسائل جديدة لمنع تطورها.
ورم خبيث سرطاني هو عملية ديناميكية تنفصل فيها الخلايا عن الورم الأساسي وتغزو الأنسجة المجاورة من خلال الدورة الدموية. وبالتالي ، فإن النماذج الحيوانية التي تخضع فيها الخلايا لسلسلة نقيلي مماثلة يمكن أن تسهل تحديد الآليات التي تحكم هذه العملية 3,4. بالإضافة إلى ذلك ، هذه النماذج في الجسم الحي ضرورية لتطوير عوامل علاج سرطان الثدي 5,6. ومع ذلك ، لا يمكن أن تشير هذه النماذج التقويمية إلى حركية نمو الورم الفعلية حيث يتم تحديد التأثير فقط عند الإنهاء. لذلك ، أنشأنا أداة قائمة على luciferase للكشف عن تطور الورم والاستعمار النقيلي في الوقت الفعلي. بالإضافة إلى ذلك، تعبر هذه الخلايا عن GFP للكشف عن المستعمرات النقيلية. هذا النهج بسيط نسبيا ولا ينطوي على أي إجراءات غازية3. وبالتالي ، فإن الجمع بين اكتشاف لوسيفيراز والتألق هو استراتيجية مفيدة للمضي قدما في الدراسات قبل السريرية لعلاجات سرطان الثدي وإدارة الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع تجارب الفئران بموجب البروتوكول المعتمد من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في الجامعة العبرية MD-21-16429-5. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجامعة العبرية معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبرات (AAALAC).
1. صيانة خط الخلية
ملاحظة: تم استخدام خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية (MCF-7 و MDA-MB-468 و MDA-MB-231) في هذا البروتوكول.
- استزرع جميع خطوط خلايا سرطان الثدي في وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) ، مع استكمال 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطبة (5٪ CO2).
ملاحظة: تحقق من كثافة الخلايا بانتظام. تقسيم وتوسيع للاستخدام في المستقبل عندما تصل إلى 70٪ التقاء.
2. تحضير الفيروسات
- عالج خلايا HEK293T ب 1 مل من التربسين حتى تنفصل.
- أضف 10 مل من DMEM (10٪ FBS) لتحييد نشاط التربسين ، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد 15 مل.
- جهاز طرد مركزي في 150 × غرام لمدة 5 دقائق لترسيب الخلايا. تخلص من المادة الفائقة بعد الطرد المركزي وأضف 1 مل من وسط DMEM الطازج.
- تحديد تركيز الخلية والبذور 1.2 × 106 خلايا / بئر في لوحة من ستة آبار.
- في اليوم التالي ، قم بتسخين جميع الكواشف اللازمة مسبقا ، بما في ذلك كاشف النقل ، DMEM الخالي من المصل ، بلازميد المغلف (VSV-G) ، بلازميد تغليف lentivirus (ΔVPR) ، و pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid أو بلازميد FUW GFP.
- في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل ، امزج 50 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل مع 0.3 ميكروغرام من بلازميد VSV-G ، و 1 ميكروغرام من ΔVPR ، و 1.2 ميكروغرام من بلازميد انفجار pLX304 Luciferase-V5 أو بلازميد FUW GFP.
- بعد خلط هذه البلازميدات جيدا مع الوسط ، أضف 5 ميكرولتر من كاشف النقل ، واخلطه بلطف ، واحتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- بعد الحضانة ، أضف الخليط قطرة إلى خلايا HEK293T.
- بعد 24 ساعة، استبدل وسط النمو ب 2 مل من (30٪ FBS) DMEM. في اليوم التالي (48 ساعة بعد النقل) ، قم بحصاد الوسط الذي يحتوي على الفيروسات ("pLX304 Luciferase-V5 أو فيروسات FUW GFP").
ملاحظة: استخدام 30٪ FBS يعزز كفاءة إنتاج الفيروسات. - لتجنب أي بقايا خلايا HEK293T ، قم بتمرير الوسط المحتوي على الفيروس من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر أو جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق ، وجمع supernatant.
ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل ، حافظ على أليكوتس العمل للفيروس عند -80 درجة مئوية.
3. إنشاء خلايا تعبر بثبات عن GFP و luciferase ("GFP + Luc + cells")
- في اليوم السابق لإصابة الخلايا ، البذور 8 × 105 خلايا لكل بئر في لوحة من ستة آبار.
- بعد الحضانة بين عشية وضحاها، استبدل وسط النمو بوسط طازج يحتوي على 8 ميكروغرام/مل من البوليبرين. أضف 200 ميكرولتر من فيروسات FUW GFP إلى الخلايا.
- اختياري: لتعزيز كفاءة الفيروس، قم بالطرد المركزي للصفيحة عند 560 × جم لمدة 30 دقيقة (37 درجة مئوية) (عدوى الدوران).
- احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة ، والتحقق من تعبير GFP بواسطة المجهر الفلوري.
- فرز الخلايا المعبرة عن GFP حسب فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) (GFP+) (الشكل 1A).
- إصابة الخلايا التي تم فرزها بواسطة GFP بفيروسات الانفجار pLX304 Luciferase-V5 كما هو موضح في الخطوة 3.2.
- عالج الخلايا بالبلاستيسيدين (10 ميكروغرام / مل) بعد 30 ساعة من الإصابة لإثراء الخلايا المعبرة عن الانفجار pLX304 Luciferase-V5 (GFP + ، خلايا Luc +). ثم ، كل يومين ، استبدله بوسط طازج يحتوي على البلاستسيدين. بالإضافة إلى ذلك ، كعنصر تحكم ، عالج الخلايا الساذجة بنفس الوسط المحتوي على البلاستيسيدين.
ملاحظة: يجب ملاحظة وجود فرق واضح بين الخلايا المصابة والخلايا الضابطة بعد بضعة أيام من علاج البلاستسيدين. يعتمد هذا التأثير على خط الخلية وعادة ما يستغرق حوالي 8-10 أيام. سيشير معدل البقاء على قيد الحياة الضعيف إلى انخفاض إنتاجية الفيروس. إذا كان الأمر كذلك ، فقم بإنتاج مجموعة جديدة من الفيروسات لأن الكفاءة المنخفضة قد تؤثر على التجارب المستقبلية.
4. التحقق من صحة نشاط لوسيفيراز في المختبر
- قم بزراعة خلايا MCF-7 و MDA-MB-468 و MDA-MB-231 GFP+ Luc+ في صفيحة 15 سم إلى 80٪ من التقاء. حصاد الخلايا عن طريق التربسينات ، كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.2.
- زرع عدد متزايد من الخلايا في كل بئر (0.1 ، 0.5 ، 1 ، 2 ، 3 ، 4 × 104) في صفيحة سوداء من 96 بئرا.
ملاحظة: تعد الألواح السوداء ذات ال 96 بئرا أكثر ملاءمة لقياس مستويات لوسيفيراز حيث ستنتج الألواح البيضاء أو الشفافة إشارات تلألؤ ذاتي. كعنصر تحكم ، استخدم المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) وحدها في بئر واحد لضمان عدم وجود تلألؤ ذاتي من PBS. - املأ جميع الآبار ب 100 ميكرولتر من DMEM واحتضنها لمدة 16-24 ساعة.
- تحضير محلول لوسيفيرين في PBS بتركيز 1.5 ملغم / مل من مخزون 30 ملغ / مل. Aliquot مخزون محلول luciferin وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS بلطف ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول لوسيفيرين في كل بئر ، وانتظر لمدة 2 دقيقة. أخيرا ، قم بقياس نشاط luciferase في جميع خلايا سرطان الثدي باستخدام التلألؤ الحيوي.
ملاحظة: يعد فحص تعبير GFP و luciferase في المختبر قبل التجارب على الحيوانات أمرا بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام الآبار الفارغة لطرح الخلفية.
5. حقن الفئران بخلايا GFP + Luc +
- انقل 5 × 10 6 (MCF-7 و MDA-MB-468) أو 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP + Luc + إلى 200 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر PBS ، على التوالي.
- قبل الحقن ، قم بتنظيف الغطاء البيولوجي المعقم بمحلول مطهر بنسبة 5٪ (انظر جدول المواد). ثم ، قم بتخدير الفئران بهواء مصفى (0.2 ميكرومتر) يحتوي على 4٪ من الأيزوفلوران بمعدل تدفق هواء 1 لتر / دقيقة لمدة 2-3 دقائق.
ملاحظة: من الضروري تأكيد التخدير المناسب. قرصة إصبع قدم الماوس وابحث عن أي استجابة. - ضع مخروطا فوق رأس الفأر المخدر في وضع ضعيف. ضع مرهم بيطري على عينيه لمنع الجفاف أثناء التخدير.
- امسح منطقة البطن من الماوس ، فوق الغدة الثديية ، باستخدام الإيثانول باستخدام قطعة قطن وارفع الغدة الثديية 4 بالملقط.
- أدخل الإبرة 27 جم × 3/4 (0.4 × 19 مم) تحت وسادة الدهون وحقن 100 ميكرولتر ببطء من تعليق الخلية.
ملاحظة: سيظهر انتفاخ دائري تحت الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي الحقن غير السليم إلى انحراف في معدل نمو الورم أو عدم وجود ورم في نفس المجموعة التجريبية. - بعد إجراء الحقن ، أخرج الفئران من الغطاء وانقلها إلى قفص جديد. راقب الفئران حتى تعود إلى الوعي.
ملاحظة: تأكد من التخلص من جميع الإبر والمحاقن المستخدمة في صندوق الأدوات الحادة.
6. قياس مستويات luciferase في GFP + Luc + الفئران
- قبل اكتشاف التلألؤ الحيوي ، قم بتقييد الماوس الواعي عن طريق تثبيت رقبته باليد اليسرى. ثم ، قم بإمالة اليد إلى اليسار ، مما يؤدي إلى وجه الماوس لأعلى مع الجزء السفلي من الجسم في وضع ضعيف.
- حقن 100 ميكرولتر من لوسيفيرين (30 ملغم / مل) داخل الصفاق (i.p) في سطح البطن للفأر في الربع البطني السفلي الأيسر باستخدام حقنة 1.0 مل مع إبرة بحجم 27 جم × 3/4 (0.4 × 19 مم).
ملاحظة: لا ينبغي إدخال طرف الإبرة أكثر من 3-5 مم من جدار البطن ، لأنه قد يخترق الأعضاء الحشوية. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بإجراء حقن i.p. بدون تخدير لأن توزيع لوسيفيرين في جسم الفئران المخدرة أبطأ من الفئران الواعية. وبالتالي ، فإن مراقبة مستويات luciferase في الفئران الواعية هو إجراء أسرع. - احتفظ بالماوس لمدة 7 دقائق بدون تخدير تليها 3 دقائق داخل غرفة التخدير قبل قياس حركية الورم.
ملاحظة: يختلف وقت الحضانة بين التجارب المختلفة وخطوط الخلايا والأنواع إلى الأنواع. وبالتالي ، يوصى بمعايرة وقت الحضانة قبل بدء التجارب. - تخدير الفئران كما هو موضح في الخطوات 5.2-5.3.
- افتح البرنامج (جدول المواد) أثناء الحضانة ، وقم بتهيئة نظام التصوير ، وانقر فوق الزر تهيئة .
ملاحظة: كن على علم بأن الكاميرا ستستغرق حوالي 10 دقائق لتبرد وتصل إلى -90 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، كتحكم في الخلفية ، قم بقياس مستويات luciferase في الفئران الساذجة (أي الفئران GFP + التي تم حقنها بخلايا لا تعبر عن جين luciferase). - حافظ على الإعداد في التعريض الضوئي التلقائي باستخدام الإعدادات التالية: وقت التعرض التلقائي ، 60 ثانية ؛ وسط الربط ، F / Stop 1 ؛ مرشح الإثارة المحظورة. مرشح الانبعاثات مفتوح. عند انتهاء التهيئة ، حدد معالج التصوير | التلألؤ الحيوي ومن ثم انقر فوق التالي | فتح | تصفية حدد الماوس في موضوع الصورة.
- في طريقة عرض الحقل، حدد المرحلة C (10 سم) وارتفاع الهدف: 1.50 سم.
- انقر فوق مرحلة إعداد الصورة إلى C، وقبل النقر فوق الزر اكتساب ، تأكد من وضع الماوس على المسرح في وضع الاستلقاء المناسب.
- أغلق الباب، وانقر فوق الزر " اكتساب"، وانتظر ظهور صورة على الشاشة.
ملاحظة: مع خيار التعرض التلقائي ، تستغرق الإشارة القوية 5-20 ثانية اعتمادا على الإشارة. ستستغرق الإشارة الضعيفة حوالي 60 ثانية. - كرر هذه الخطوة للفئران الأخرى.
- للكشف عن ورم خبيث في الرئة، قم بتغطية الإشارة القوية للورم الأساسي باستخدام ورق مقوى أسود سميك وقم فقط بفضح الجانب البطني من الرئتين نحو الكاميرا. التقط الصورة باستخدام نفس المعلمات الموضحة أعلاه.
7. الحصول على صورة خارج الجسم الحي باستخدام التلألؤ الحيوي والتألق
- القتل الرحيم للفئران باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO2) في المجفف وتشريح الفئران باستخدام مقص وملقط معقم.
- قم بدمج الفئران باستخدام 0.9٪ من المياه المالحة ، وحصاد الأعضاء ، وشطفها باستخدام 1x PBS للقضاء على بقع الدم من العضو.
- انقل العضو المشطف إلى طبق بتري وضعه في مرحلة آلة التلألؤ الحيوي. تطبيق نفس إعداد التلألؤ الحيوي كما هو موضح في الخطوات 6.2-6.6.
ملاحظة: نظرا لانخفاض إشارة luciferase ، فإن هذه الخطوة محددة زمنيا. وهكذا ، بعد القتل الرحيم للفئران ، تصور العضو على الفور عن طريق التلألؤ الحيوي. - بالنسبة لصور GFP، قم بتطبيق نفس الإعداد كما هو موضح في الخطوة 6.3، باستخدام مرشح GFP الفلوري بدلا من التلألؤ الحيوي.
- التقط صورا للرئة باستخدام مجهر ستيريو لفحص وجود مستعمرات GFP +.
8. تحليل بيانات التلألؤ الحيوي
- انقر نقرا مزدوجا فوق البرنامج وحدد فتح من القائمة ملف .
- افتح جميع الملفات وقم بتصغيرها. تأكد من أن جميع الوحدات هي Radiance (الفوتونات). بالإضافة إلى ذلك، انقر فوق تطبيق على الكل للحفاظ على نفس المعلمات لكافة الصور.
- من القائمة عرض ، حدد لوحة الأدوات، التي ستفتح نافذة جديدة.
- من نافذة لوحة الأدوات، حدد علامة التبويب أدوات عائد الاستثمار وفي النوع، اختر متوسط عائد الاستثمار على Bkg.
- من أدوات عائد الاستثمار، حدد دائرة، وارسم دائرة صغيرة على المنطقة الصدرية للماوس.
- انقر نقرا مزدوجا فوق الدائرة، وحدد الخيار استخدام ك BKG لعائد الاستثمار المستقبلي من علامة التبويب عائد الاستثمار في الخلفية ، وانقر فوق تم.
9. قياس التدفق الكلي
- من نافذة لوحة الأدوات ، حدد علامة التبويب أدوات عائد الاستثمار وفي النوع، اختر قياس عائد الاستثمار.
- من أدوات عائد الاستثمار، حدد دائرة، وارسم دائرة كبيرة على الورم الأساسي للماوس.
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق نسخ عائد الاستثمار وانقر بزر الماوس الأيمن فوق لصق عائد الاستثمار في كل ملف فردي لكل ماوس.
- انقر فوق قياس عائد الاستثمار من علامة التبويب أدوات عائد الاستثمار، والتي ستفتح نافذة جديدة تسمى قياسات عائد الاستثمار. من علامة التبويب هذه، احتفظ بأنواع القياسات كإشعاع (فوتونات) وسمات الصورة ككل القيم المملوءة.
- قم بتصدير الملف بتنسيق ملف القياسات (*.txt) أو Csv (*.csv).
- افتح البيانات المصدرة في جدول بيانات وخذ إجمالي التدفق (p/s) والقيم للأسابيع.
ملاحظة: يمكن استخدام هذه الخطوة لقياس مجموعات مختلفة. على سبيل المثال ، عولجت الفئران بسيارة مقابل تلك التي عولجت بعقار. - قم بإنشاء مخطط XY ، حيث يتم تقديم الوقت على طول المحور X والتدفق الكلي (p / s) على طول المحور Y. لكل أسبوع ، خذ معلمة التدفق الكلي (p / s) لكل مجموعة عينة وحدد أي اختلافات كبيرة باستخدام اختبار t للطالب غير المعلمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد أنشأنا خطوط خلايا سرطان الثدي (MDA-MB-231 و MCF-7 و MDA-MB-468) التي تعبر عن ناقلات GFP و luciferase. على وجه التحديد ، تم تحقيق ذلك عن طريق عدوى متتابعة. أولا ، أصيبت خطوط خلايا سرطان الثدي بناقل فيروس lentivirus يعبر عن GFP الفلورسنت. تم فرز الخلايا الإيجابية GFP (GFP +) بعد يومين من الإصابة (الشكل 1A ، B) وأصيبت بناقل pLX304 Luciferase-V5. بعد ذلك ، تم استخدام blasticidin لاختيار luciferase لتوليد الخلايا المشار إليها (GFP + ، Luc +). للتحقق من صحة نشاط لوسيفيراز في المختبر ، أظهرنا زيادة تعتمد على عدد الخلايا في مستويات نشاط لوسيفيراز (الشكل 1C). بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على علاقة خطية بين نشاط luciferase ورقم الخلية (الشكل 1D).
لتأكيد الكشف عن لوسيفيراز في الفئران ، تم حقن جميع خطوط خلايا سرطان الثدي الثلاثة GFP + و Luc + في وسادة الدهون الثديية لإناث الفئران NOD / SCID. بعد ذلك ، خضعت الفئران لقراءة التلألؤ الحيوي كل أسبوعين لتحديد حركية نمو الورم. وجدنا أن حركية نمو الورم تختلف بين خطوط الخلايا. إنه أسرع في MDA-MB-231 الأكثر عدوانية وأبطأ في خطوط الخلايا الأقل عدوانية MCF-7 و MDA-MB-468 (الشكل 2).
بعد ذلك ، تم الحصول على قراءات التألق للأورام المعزولة الناتجة عن خط خلية MDA-MB-231. على وجه التحديد ، بعد 6 أسابيع من الحقن ، تم حصاد الأورام من الفئران لتأكيد تألق GFP. تم العثور على الأورام للحفاظ على تعبيرها GFP (الشكل 3A). وكان الهدف التالي هو تحديد ما إذا كان يمكن تقييم تكوين مستعمرة النقيلية في الوقت الحقيقي في رئة فأر حي باستخدام آلة التلألؤ الأحيائي. تم الحصول على قراءات التلألؤ الحيوي الإيجابية من رئة الفأر بأكمله (الشكل 3B). للتحقق من أن هذه كانت مستعمرات نقيلية إيجابية ، تم حصاد الرئة ، ولوحظت المستعمرات النقيلية ل GFP والتلألؤ الحيوي (الشكل 3C).
الشكل 1: التحقق من صحة تعبير GFP ونشاط luciferase في الخلايا . (أ) تم فرز خلايا GFP بواسطة FACS. صور تمثيلية لخلايا MDA-MB-231 غير GFP و GFP + . (ب) أصيبت خلايا MDA-MB-231 و MCF-7 و MDA-MB-468 بفيروس يعبر عن GFP ، يليه فرز FACS. يتم تمثيل صورة لكل خط خلية في brightfield (يسار) و GFP (يمين). تم التقاط الخلايا تحت مجهر نيكون Eclipse 80i عند تكبير 10x. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (C) تم تحديد التلألؤ الحيوي بسبب نشاط luciferase في كل خلية بواسطة مقياس لمعان. تم زرع عدد متزايد من الخلايا (كما هو الحال في A) في صفيحة سوداء من 96 بئرا. يمثل شريط الألوان شدة التلألؤ. (د) مخطط XY يوضح نشاط لوسيفيراز لخلايا MDA-MB-231 (كما تم قياسه في C). الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. SSC-A = منطقة الذروة المتناثرة جانبيا ؛ GFP+ = GFP-positive; FACS = فرز الخلايا المنشط بالفلور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تم تحديد حركية نمو الورم بواسطة آلة التلألؤ الحيوي. تم تحديد حركية نمو الورم في الجسم الحي أسبوعيا في الفئران NOD-SCID ، وتم التقاط الصور التمثيلية باستخدام التلألؤ الحيوي ل (A) MDA-MB-231 ، (B) MCF-7 ، (C) MDA-MB-468. يمثل شريط الألوان شدة التلألؤ. (د) يعرض التقدير الكمي لنشاط التلألؤ على أنه تدفق كلي. (ه) الفئران MDA-MB-231؛ القراءة الفردية ممثلة كمؤامرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: طرق مختلفة للتحقق من تكوين الورم وورم خبيث في الرئة. (أ) تم اختراق الفئران ، وتم حصاد الأورام الناتجة عن خلايا MDA-MB-231. تم قياس مستويات GFP في الأورام بواسطة آلة التلألؤ الحيوي. (ب) ورم خبيث في الرئة في الفئران بأكملها ، كما هو موضح في التلألؤ الحيوي. (ج) لتأكيد وجود النقائل ، تم حصاد الرئتين ورصدهما تحت SMZ18 Nikon Stereomicroscope (برايتفيلد و GFP). تم أخذ عينات Bioluminescent-Luc مباشرة بعد القتل الرحيم للفئران. يمثل شريط الألوان شدة التلألؤ. الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. لوك = لوسيفيراس; BLI = تصوير التلألؤ الحيوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التجارب القائمة على الحيوانات إلزامية لأبحاث السرطان7،8،9 ، وبالفعل تم تطوير العديد من البروتوكولات3،6،10،11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الدراسات حددت التأثير البيولوجي فقط في نهاية التجارب ، وبالتالي فإن التأثير على حركية نمو الورم أو استعمار النقائل لا يزال غير محدد. هنا ، نقدم نهج التلألؤ الحيوي المزدوج غير الغازي عن طريق تلقيح الخلايا التي تعبر عن GFP و luciferase في وسادة الدهون الثديية. باستخدام هذه الأداة القوية ، يمكن مراقبة تطور الورم والانبثاث في الفئران في الوقت الفعلي14. ومع ذلك ، تحتوي هذه التقنية على بعض الخطوات الحرجة ، والتي تتطلب المزيد من الحذر. على سبيل المثال ، تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة لنجاح هذه التجربة في التحقق من كفاءة العدوى من خلال مراقبة مستويات تعبير luciferase و GFP في الخلايا قبل حقن الفئران. وبالتالي ، ينبغي تحسين جرعات البلاستيسيدين15 وبروتوكول إنتاج الفيروسات الخيطية16 لكل خط خلية لزيادة الكفاءة التجريبية.
قد تؤثر بعض المشكلات الفنية على إشارة التلألؤ الحيوي في تجربة الجسم الحي . وتشمل هذه القضايا حركة الماوس أثناء قراءة التلألؤ الحيوي ، والتي قد تتداخل مع جودة الصورة وبالتالي تؤثر على منحنيات حركية الورم. وبالتالي ، يجب تخدير الحيوانات بالكامل بعد حقن الركيزة وأثناء الإجراء بأكمله. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي وضع متعددة في الماكينة في وقت واحد إلى عدم الاتساق في قراءة التلألؤ حيث يمكن للفئران ذات الإشارة العالية إخفاء الحيوانات الأقل كثافة. لذلك ، يجب أن تؤخذ قراءات التلألؤ بشكل فردي لكل ماوس.
عند إجراء قراءة التلألؤ الحيوي في المختبر ، من الضروري استبدال وسط الثقافة ب PBS ، لأن الوسط يحتوي على مصل ومكملات أخرى قد تتداخل مع الإشارة. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري القضاء على قراءة الخلفية عن طريق قياس إشارة التلألؤ لعينة تحتوي فقط على PBS (بدون خلايا).
يصف هذا البروتوكول تقنية غير جراحية لقياس نمو خلايا سرطان الثدي والنقائل. على وجه التحديد ، تصف هذه الورقة حقن خطوط خلايا سرطان الثدي ، معبرا عن كل من GFP و luciferase في وسادة الدهون الثديية للماوس. يوفر هذا المزيج طريقة سريعة وموثوقة لقياس الاستعمار النقيلي في الجسم الحي والجسم الحي السابق.
على الرغم من المزايا الواضحة لهذه الطريقة ، إلا أنها تحتوي على بعض القيود. القيد الأساسي هو الحاجة إلى آلة التلألؤ الحيوي ، لأنها آلة باهظة الثمن نسبيا وبالتالي فهي ليست متاحة دائما. بالإضافة إلى ذلك ، تستغرق كل قراءة وقتا طويلا ، وبالتالي يمكن حجز الجهاز بشكل مفرط وغير متاح. وهناك قيد آخر يشير إلى البروتوكول نفسه. للكشف عن إشارة التلألؤ الحيوي في عينات خارج الجسم الحي ، يوصى بالقتل الرحيم للفئران وفحص العينة على الفور. هذه الخطوة هي مرحلة محددة زمنيا وغير مجدية لمجموعة كبيرة من التجارب.
في الختام ، فإن أداة التلألؤ الحيوي غير الباضعة هذه حساسة للغاية للكشف عن تطور الورم والانبثاث في الفئران. لا يقتصر هذا البروتوكول على سرطان الثدي ويمكن تطبيقه على سرطانات أخرى مثل سرطان الرئة والبنكرياس. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه غير جراحي ، يمكن تطبيقه لقياس فعالية الأدوية المضادة للسرطان12 وآثارها على حركية نمو الورم في الوقت الفعلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد كشف جميع المؤلفين أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر أعضاء مختبر Y.D.S. نود أن نشكر معهد وول للطب الانتقالي في مركز هداسا الطبي في القدس على توفير مرفق تصوير الحيوانات الصغيرة. تم دعم هذه الدراسة من قبل جائزة التطوير الوظيفي البحثي من صندوق أبحاث السرطان الإسرائيلي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P.
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M.
- Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
