Summary
Здесь мы описываем неинвазивный метод мониторинга, включающий экспрессию люциферазы и зеленого флуоресцентного белка в различных клеточных линиях рака молочной железы. Этот протокол обеспечивает технику мониторинга образования опухоли и метастатической колонизации в режиме реального времени у мышей.
Abstract
Рак молочной железы является частым гетерогенным злокачественным новообразованием и второй по значимости причиной смертности у женщин, в основном из-за отдаленных метастазов в органы. Было создано несколько моделей на животных, в том числе широко используемые ортотопические мышиные модели, где раковые клетки вводятся в жировую прокладку молочной железы. Однако эти модели не могут помочь контролировать кинетику роста опухоли и метастатическую колонизацию. Передовые инструменты для мониторинга раковых клеток в режиме реального времени у мышей значительно улучшат понимание биологии опухоли.
Здесь были установлены клеточные линии рака молочной железы, стабильно экспрессирующие люциферазу и зеленый флуоресцентный белок (GFP). В частности, этот метод содержит два последовательных шага, инициированных измерением активности люциферазы in vitro и сопровождаемых имплантацией раковых клеток в подушечки молочного жира мышей с комбинированным иммунодефицитом (NOD-SCID). После инъекции как рост опухоли, так и метастатическая колонизация контролируются в режиме реального времени неинвазивной системой визуализации биолюминесценции. Затем количественная оценка GFP-экспрессирующих метастазов в легких будет исследована флуоресцентной микроскопией для подтверждения наблюдаемых результатов биолюминесценции. Эта сложная система, сочетающая в себе люциферазу и инструменты обнаружения на основе флуоресценции, оценивает метастазирование рака in vivo, что имеет большой потенциал для использования в терапии рака молочной железы и лечении заболеваний.
Introduction
Рак молочной железы является частым типом рака во всем мире, причем в Соединенных Штатах ежегодно диагностируется около 250 000 новых случаев1. Несмотря на высокую заболеваемость, новый набор противоопухолевых препаратов значительно улучшил исходы лечения рака молочной железы2. Тем не менее, эти методы лечения по-прежнему неадекватны, так как многие пациенты испытывают рецидив заболевания и метастатическое распространение на жизненно важные органы2, что является основной причиной заболеваемости и смертности пациентов. Поэтому одной из основных задач в исследованиях рака молочной железы является выявление молекулярных механизмов, регулирующих образование дистальных метастазов, для разработки новых средств для ингибирования их развития.
Метастазирование рака – это динамический процесс, при котором клетки отделяются от первичной опухоли и вторгаются в соседние ткани через кровообращение. Таким образом, животные модели, в которых клетки подвергаются подобному метастатическому каскаду, могут облегчить идентификацию механизмов, управляющих этим процессом 3,4. Кроме того, эти модели in vivo необходимы для разработки терапевтических агентов рака молочной железы 5,6. Однако эти ортотопические модели не могут указывать фактическую кинетику роста опухоли, поскольку эффект определяется только после прекращения. Поэтому мы создали инструмент на основе люциферазы для обнаружения развития опухоли и метастатической колонизации в режиме реального времени. Кроме того, эти клетки экспрессируют GFP для обнаружения метастатических колоний. Этот подход относительно прост и не предполагает каких-либо инвазивных процедур3. Таким образом, сочетание люциферазы и обнаружения флуоресценции является полезной стратегией для продвижения доклинических исследований терапии рака молочной железы и лечения заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с протоколом MD-21-16429-5, одобренным Комитетом по уходу и использованию животных Еврейского университета. Кроме того, Еврейский университет сертифицирован Ассоциацией по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными животными (AAALAC).
1. Обслуживание клеточной линии
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовались клеточные линии рака молочной железы человека (MCF-7, MDA-MB-468 и MDA-MB-231).
- Культивируйте все клеточные линии рака молочной железы в модифицированной среде Eagle 's Dulbecco's (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином при 37 °C в увлажненном инкубаторе углекислого газа (5% CO2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно проверяйте плотность ячеек; разделение и расширение для будущего использования, когда они достигнут 70% слияния.
2. Подготовка к вирусам
- Обработайте клетки HEK293T 1 мл трипсина до тех пор, пока они не отделятся.
- Добавьте 10 мл DMEM (10% FBS) для нейтрализации активности трипсина и перенесите клеточную суспензию в новую 15 мл центрифужную трубку.
- Центрифуга при 150 × г в течение 5 мин для осаждения клеток. Выбросьте супернатант после центрифугирования и добавьте 1 мл свежей среды DMEM.
- Определяют концентрацию клеток и семена 1,2 × 106 клеток/лунку в шестилуночной пластине.
- На следующий день предваряют все необходимые реагенты, включая трансфекционный реагент, бессывороточный DMEM, плазмиду оболочки (VSV-G), плазмиду упаковки лентивируса (ΔVPR) и бластную плазмиду pLX304 Люциферазы-V5 или плазмиду FUW GFP.
- В 1,5 мл автоклавной центрифужной трубки смешайте 50 мкл бессывороточного DMEM с 0,3 мкг плазмиды VSV-G, 1 мкг ΔVPR и 1,2 мкг pLX304 Люциферазы-V5 бластной плазмиды или плазмиды FUW GFP.
- После тщательного смешивания этих плазмид со средой добавляют 5 мкл трансфекционного реагента, аккуратно перемешивают и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 15 мин.
- После инкубации добавьте смесь по каплям в клетки HEK293T.
- Через 24 ч заменить питательную среду 2 мл (30% FBS) DMEM. На следующий день (через 48 ч после трансфекции) соберите среду, содержащую вирусы («pLX304 Luciferase-V5 или вирусы FUW GFP»).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 30% FBS повышает эффективность производства вирусов. - Чтобы избежать остатков клеток HEK293T, пропустите вируссодержащую среду через шприцевой фильтр или центрифугу 0,45 мкм при 150 × г в течение 5 мин и соберите супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения держите рабочие аликвоты вируса при -80 °C.
3. Создание клеток, стабильно экспрессирующих GFP и люциферазу («GFP + Luc+ клетки»)
- За день до заражения клеток семена 8 × 105 клеток на лунку в шестилуночной пластине.
- После ночной инкубации замените питательную среду свежей средой, содержащей 8 мкг/мл полибрена. Добавьте 200 мкл вирусов FUW GFP по каплям в клетки.
- Дополнительно: Для повышения эффективности вируса центрифугируйте пластину при 560 × г в течение 30 мин (37 °C) (спиновая инфекция).
- Инкубируют клетки в течение 48 ч и проверяют экспрессию GFP с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Сортируйте GFP-экспрессирующие клетки с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) (GFP+) (рисунок 1A).
- Заразите клетки, отсортированные по GFP, бластными вирусами pLX304 Люциферазы-V5, как описано в шаге 3.2.
- Обрабатывайте клетки бластицидином (10 мкг/мл) через 30 ч после заражения для обогащения бласт-экспрессирующих клеток pLX304 Люциферазы-V5 (клетки GFP+, Luc+ ). Затем, каждые два дня, заменяйте свежей средой, содержащей бластицидин. Дополнительно, в качестве контроля, обрабатывайте наивные клетки той же бластицидинсодержащей средой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Четкая разница между инфицированными и контрольными клетками должна наблюдаться после нескольких дней лечения бластицидином. Этот эффект зависит от клеточной линии и обычно занимает ~ 8-10 дней. Плохая выживаемость будет указывать на низкий выход вирусной продукции. Если это так, произведите новую партию вирусов, так как низкая эффективность может повлиять на будущие эксперименты.
4. Подтверждение активности люциферазы in vitro
- Увеличьте ячейки MCF-7, MDA-MB-468 и MDA-MB-231 GFP+ Luc+ в пластине 15 см до 80% слияния. Собирают клетки путем трипсинизации, как описано в шагах 2.1-2.2.
- Посейте все большее количество клеток в каждой лунке (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 104) в черную 96-луночную пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Черные 96-луночные пластины больше подходят для измерения уровней люциферазы, поскольку белые или прозрачные пластины будут производить сигналы автолюминесценции. В качестве контроля используйте фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) только в одной скважине, чтобы убедиться, что нет автолюминесценции от PBS. - Заполните все колодцы 100 мкл DMEM и инкубируйте в течение 16-24 ч.
- Готовят раствор люциферина в PBS в концентрации 1,5 мг/мл из запаса 30 мг/мл. Аликвот на складе раствора люциферина и хранить при -20 °С.
- Аккуратно промыть клетки PBS, добавить 100 мкл раствора люциферина в каждую лунку и подождать 2 мин. Наконец, измерьте активность люциферазы во всех клетках рака молочной железы, используя биолюминесценцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изучение экспрессии GFP и люциферазы in vitro до экспериментов на животных имеет решающее значение. Кроме того, пустые колодцы используются для вычитания фона.
5. Инъекция мышам клеток GFP+ Luc+
- Перенос 5 × 106 (MCF-7 и MDA-MB-468) или 2 × 106 (MDA-MB-231) клеток GFP+ Luc+ в 200 мкл или 100 мкл PBS соответственно.
- Перед инъекцией очистите стерильную биологическую вытяжку 5% дезинфицирующим раствором (см. Таблицу материалов). Затем обезболивают мышей фильтрованным (0,2 мкм) воздухом, содержащим 4% изофлурана со скоростью воздушного потока 1 л/мин в течение 2−3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно подтвердить надлежащую анестезию; зажмите палец мыши и найдите любой ответ. - Поместите конус над головкой анестезированной мыши в лежачем положении. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Протрите брюшную область мыши, над молочной железой, этанолом ватным тампоном и поднимите4-ю молочную железу щипцами.
- Вставьте иглу 27 G x 3/4 (0,4 x 19 мм) под жировую прокладку и медленно введите 100 мкл клеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Под кожей появится круглая выпуклость. Кроме того, неправильная инъекция может привести к отклонению скорости роста опухоли или отсутствию опухоли в той же экспериментальной группе. - После процедуры инъекции выньте мышей из капюшона и перенесите их в новую клетку. Следите за мышами, пока они не вернутся в сознание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все использованные иглы и шприцы выброшены в коробку с острыми предметами.
6. Измерение уровня люциферазы у мышей GFP+ Luc+
- Перед обнаружением биолюминесценции удерживайте сознательную мышь, держа ее шею левой рукой. Затем наклоните руку влево, в результате чего мышь лицом вверх с нижней частью тела в положении лежа.
- Вводят 100 мкл люциферина (30 мг/мл) внутрибрюшинно (т..) в брюшную поверхность мыши в нижнем левом брюшном квадранте с помощью шприца объемом 1,0 мл с размером иглы 27 Г х 3/4 (0,4 х 19 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик иглы не следует вводить более чем на 3-5 мм от брюшной стенки, так как он может проникнуть в висцеральные органы. Кроме того, рекомендуется выполнять инъекции без анестезии, так как распределение люциферина в организме анестезируемых мышей происходит медленнее, чем у мышей в сознании. Таким образом, мониторинг уровня люциферазы у сознательных мышей является более быстрой процедурой. - Держите мышь в течение 7 минут без анестезии, а затем 3 минуты в анестезиологической камере перед измерением кинетики опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации варьируется между различными экспериментами, клеточными линиями и видами к видам. Таким образом, перед началом экспериментов рекомендуется откалибровать время инкубации. - Обезболивают мышей, как описано в шагах 5.2-5.3.
- Откройте программное обеспечение (Таблицу материалов) во время инкубации, инициализируйте систему обработки изображений и нажмите кнопку Инициализировать .
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что камере потребуется ~ 10 минут, чтобы остыть и достичь -90 ° C. Кроме того, в качестве фонового контроля измерьте уровни люциферазы у наивных мышей (то есть у мышей GFP+ , которым вводили клетки, которые не экспрессируют ген люциферазы). - Сохраните настройку в автоматической экспозиции, используя следующие настройки: время экспозиции авто, 60 с; Биннинг Средний, F/Stop 1; Фильтр возбуждения заблокирован; Эмиссионный фильтр открыт. По окончании инициализации выберите Мастер создания образов | Биолюминесценция и нажмите кнопку Далее | Открыть | фильтра выберите Мышь в теме изображения.
- В поле «Вид поля» выберите стадию C (10 см) и высоту объекта: 1,50 см.
- Щелкните Этап настройки изображения на C и перед нажатием кнопки Получить убедитесь, что мышь помещена на рабочую область в правильном положении лежа.
- Закройте дверь, нажмите кнопку «Получить» и дождитесь появления изображения на экране.
ПРИМЕЧАНИЕ: С опцией Auto-Exposure сильный сигнал занимает 5-20 с в зависимости от сигнала; слабый сигнал займет около 60 с. - Повторите этот шаг для других мышей.
- Чтобы обнаружить метастазы в легкие, накройте сильный сигнал первичной опухоли толстой черной картонной бумагой и обнажите только вентральную сторону легких по направлению к камере. Захват изображения с использованием тех же параметров, которые описаны выше.
7. Получение изображения ex vivo с использованием биолюминесценции и флуоресценции
- Усыпляйте мышей с помощью вдыхания углекислого газа (CO2) в осушителе и рассекайте мышей с помощью автоклавных ножниц и щипцов.
- Перфьюзируйте мышей, используя 0,9% физиологического раствора, извлекайте органы и промывайте 1x PBS, чтобы устранить пятна крови из органа.
- Перенесите промытый орган в чашку Петри и поместите его в стадию биолюминесцентной машины. Применяют ту же настройку биолюминесценции, как описано в шагах 6.2-6.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за снижения сигнала люциферазы этот шаг ограничен по времени. Таким образом, после эвтаназии мышей сразу же визуализируют орган по биолюминесценции. - Для изображений GFP примените ту же настройку, что и в шаге 6.3, используя флуоресцентный фильтр GFP вместо биолюминесценции.
- Делайте снимки легких с помощью стереомикроскопа для изучения наличия колоний GFP+ .
8. Анализ данных биолюминесценции
- Дважды щелкните программное обеспечение и выберите Открыть в меню Файл .
- Откройте все файлы и сверните их. Убедитесь, что все единицы измерения являются излучением (фотонами). Кроме того, нажмите кнопку Применить ко всем , чтобы сохранить одинаковые параметры для всех изображений.
- В меню Вид выберите инструментальную палитру, которая откроет новое окно.
- В окне Инструментальная палитра перейдите на вкладку Инструменты окупаемости инвестиций и в поле Тип выберите Среднюю рентабельность инвестиций в Bkg.
- В инструментах ROI выберите Круг и нарисуйте небольшой круг на грудной области мыши.
- Дважды щелкните по кругу, выберите параметр Использовать как BKG для будущих ROI на вкладке Фоновая рентабельность инвестиций и нажмите кнопку Готово.
9. Измерение общего потока
- В окне Инструментальная палитра перейдите на вкладку Инструменты окупаемости инвестиций и в поле Тип выберите Измерение окупаемости инвестиций.
- В инструментах ROI выберите Круг и нарисуйте большой круг на первичной опухоли мыши.
- Щелкните правой кнопкой мыши Копировать ROI и щелкните правой кнопкой мыши Вставить ROI в каждый отдельный файл каждой мыши.
- Щелкните Измерить рентабельность инвестиций на вкладке Инструменты окупаемости инвестиций , которая откроет новое окно с именем Измерения окупаемости инвестиций. На этой вкладке сохраните Типы измерений как Излучение (фотоны) и Атрибуты изображения как Все заполненные значения.
- Экспортируйте файл в формате Файла измерений (*.txt) или Csv (*.csv).
- Откройте экспортированные данные в электронной таблице и возьмите общий поток (p/s) и значения за недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно использовать для измерения различных групп. Например, мыши, обработанные транспортным средством , по сравнению с теми, кого лечили препаратом. - Создайте график XY, где время представлено вдоль оси X, а общий поток (p/s) вдоль оси Y. Для каждой недели принимайте параметр Total Flux (p/s) для каждой выборочной группы и определяйте любые существенные различия с помощью t-теста непараметрического студента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы сгенерировали клеточные линии рака молочной железы (MDA-MB-231, MCF-7 и MDA-MB-468), экспрессирующие векторы GFP и люциферазы. В частности, это было достигнуто путем последовательной инфекции. Во-первых, клеточные линии рака молочной железы были инфицированы лентивирусным вектором, экспрессирующим флуоресцентный GFP. GFP-положительные клетки (GFP+) были отсортированы через 2 дня после заражения (рисунок 1A,B) и инфицированы вектором pLX304 Люциферазы-V5. Затем бластицидин использовали для отбора люциферазы для генерации указанных (GFP+, Luc+) клеток. Чтобы подтвердить активность люциферазы in vitro, мы продемонстрировали зависящее от количества клеток увеличение уровней активности люциферазы (рисунок 1C). Кроме того, была обнаружена линейная корреляция между активностью люциферазы и номером клетки (рисунок 1D).
Чтобы подтвердить обнаружение люциферазы у мышей, все три клеточные линии рака молочной железы GFP+, Luc+ были введены в жировую прокладку молочной железы самок мышей NOD / SCID. Затем мышей подвергали показаниям биолюминесценции каждые две недели, чтобы определить кинетику роста опухоли. Мы обнаружили, что кинетика роста опухоли варьируется между клеточными линиями; он быстрее в более агрессивных MDA-MB-231 и медленнее в менее агрессивных клеточных линиях MCF-7 и MDA-MB-468 (рисунок 2).
Далее были получены показания флуоресценции изолированных опухолей, генерируемых клеточной линией MDA-MB-231. В частности, через 6 недель после инъекции опухоли были собраны у мышей, чтобы подтвердить флуоресценцию GFP; было обнаружено, что опухоли сохраняют экспрессию GFP (рисунок 3A). Следующая цель состояла в том, чтобы определить, можно ли оценить метастатическое образование колоний в реальном времени в легких живой мыши с помощью биолюминесцентной машины; положительные показания биолюминесценции были получены из легкого всей мыши (рисунок 3B). Чтобы убедиться, что это были положительные метастатические колонии, было собрано легкое, и метастатические колонии наблюдались для GFP и биолюминесценции (рисунок 3C).
Рисунок 1: Валидация экспрессии GFP и активности люциферазы в клетках. (A) Клетки GFP были отсортированы по FACS. Репрезентативные изображения Ячеек MDA-MB-231, не относящихся к GFP и GFP+ . (B) Клетки MDA-MB-231, MCF-7 и MDA-MB-468 были инфицированы вирусом, экспрессирующим GFP, с последующей сортировкой FACS. Изображение каждой клеточной линии представлено в brightfield (слева) и GFP (справа). Клетки были захвачены под микроскопом Nikon Eclipse 80i с 10-кратным увеличением. Шкала баров = 100 мкм. (C) Биолюминесценция, обусловленная активностью люциферазы в каждой клетке, определялась люминометром. Все большее число клеток (как в А) были засеяны в черную 96-луночную пластину. Цветовая шкала представляет интенсивность люминесценции. (D) График XY, демонстрирующий активность люциферазы клеток MDA-MB-231 (измеренная в C). Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; SSC-A = площадь бокового рассеянного пика; GFP+ = GFP-положительный; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Кинетика роста опухоли определялась с помощью биолюминесцентной машины. Кинетику роста опухоли in vivo определяли еженедельно у мышей NOD-SCID, а репрезентативные изображения были получены с использованием биолюминесценции для (A) MDA-MB-231, (B) MCF-7, (C) MDA-MB-468. Цветовая шкала представляет интенсивность люминесценции. D) Количественная оценка люминесцентной активности представлена в виде общего потока. (E) мыши MDA-MB-231; индивидуальное чтение представлено в виде сюжета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Различные подходы к проверке образования опухоли и метастазирования в легкие. (A) Мыши были перфузированы, и опухоли, полученные из клеток MDA-MB-231, были собраны. Уровни GFP в опухолях измерялись с помощью биолюминесцентной машины. (B) Метастазирование в легкие у целых мышей, о чем свидетельствует биолюминесценция. (C) Для подтверждения наличия метастазов легкие собирали и наблюдали под стереомикроскопом SMZ18 Nikon (brightfield и GFP). Биолюминесцентные образцы Luc были взяты сразу после эвтаназии мышей. Цветовая шкала представляет интенсивность люминесценции. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; Люк = люцифераза; BLI = биолюминесцентная визуализация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эксперименты на животных являются обязательными для исследования рака 7,8,9, и действительно было разработано много протоколов 3,6,10,11,12,13,14. Однако большинство из этих исследований определяли биологический эффект только в конце экспериментов, и, таким образом, влияние на кинетику роста опухоли или колонизацию метастазов остается неопределенным. Здесь мы предлагаем неинвазивный подход двойной биолюминесценции путем инокуляции клеток, экспрессирующих GFP и люциферазу, в жировую прокладку молочной железы. С помощью этого мощного инструмента развитие опухоли и метастазирование можно контролировать у мышей в режиме реального времени14. Тем не менее, этот метод содержит несколько критических шагов, которые требуют дополнительной осторожности. Например, одним из важнейших шагов для успеха этого эксперимента является проверка эффективности инфекции путем мониторинга уровней экспрессии люциферазы и GFP в клетках перед инъекцией мыши. Таким образом, дозы бластицидина15 и протокол16 лентивирусной продукции должны быть оптимизированы для каждой клеточной линии для повышения экспериментальной эффективности.
Некоторые технические проблемы могут повлиять на сигнал биолюминесценции в эксперименте in vivo . Эти проблемы включают движение мыши во время считывания биолюминесценции, что может повлиять на качество изображения и, таким образом, повлиять на кинетические кривые опухоли. Таким образом, животные должны быть полностью обезболены после инъекции субстрата и в течение всей процедуры. Кроме того, одновременное размещение нескольких животных в машине может привести к несогласованности показаний люминесценции, поскольку мыши с высоким сигналом могут маскировать животных меньшей интенсивности. Поэтому показания люминесценции должны измеряться индивидуально для каждой мыши.
При проведении показаний биолюминесценции in vitro жизненно важно заменить культуральную среду PBS, так как среда содержит сыворотку и другие добавки, которые могут мешать сигналу. Кроме того, необходимо устранить фоновое считывание путем измерения сигнала люминесценции образца, который содержит только PBS (без клеток).
Этот протокол описывает неинвазивный метод измерения роста клеток рака молочной железы и метастазов. В частности, в этой статье описывается инъекция клеточных линий рака молочной железы, экспрессирующих как GFP, так и люциферазу в жировую прокладку молочной железы мыши. Эта комбинация обеспечивает быстрый и надежный метод измерения метастатической колонизации in vivo и ex vivo.
Несмотря на явные преимущества этого метода, он имеет некоторые ограничения. Основным ограничением является необходимость в биолюминесцентной машине, поскольку это относительно дорогая машина и, следовательно, не всегда доступна. Кроме того, каждое чтение отнимает много времени, и, таким образом, машина может быть перегружена и недоступна. Другое ограничение относится к самому протоколу. Для обнаружения сигнала биолюминесценции в образцах ex vivo рекомендуется усыпить мышей и немедленно изучить образец. Этот шаг является ограниченным по времени этапом и неосуществим для большого набора экспериментов.
В заключение, этот неинвазивный инструмент биолюминесценции очень чувствителен к обнаружению развития опухоли и метастазирования у мышей. Этот протокол не ограничивается раком молочной железы и может применяться к другим карциномам, таким как рак легких и поджелудочной железы. Кроме того, поскольку он неинвазивный, его можно применять для измерения эффективности противоопухолевых препаратов12 и их влияния на кинетику роста опухоли в режиме реального времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы раскрыли, что у них нет никаких конфликтов интересов.
Acknowledgments
Благодарим сотрудников лаборатории Y.D.S. Мы хотели бы поблагодарить Институт трансляционной медицины Воля в Медицинском центре Хадасса, Иерусалим, за предоставление центра визуализации мелких животных. Это исследование было поддержано премией Research Career Development Award от Израильского фонда исследований рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P.
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M.
- Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
