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Cancer Research

Bioluminescence का उपयोग कर चूहों में स्तन कैंसर के विकास और मेटास्टेटिक कॉलोनी गठन की निगरानी

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63060
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Institute for Medical Research Israel-Canada, The Hebrew University-Hadassah Medical School

Summary

यहां, हम विभिन्न स्तन कैंसर सेल लाइनों में लूसिफेरस और हरे रंग की फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को शामिल करने वाली एक noninvasive निगरानी विधि का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल चूहों में वास्तविक समय में ट्यूमर गठन और मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण की निगरानी करने के लिए एक तकनीक प्रदान करता है।

Abstract

स्तन कैंसर एक लगातार विषम दुर्दमता है और महिलाओं में मृत्यु दर का दूसरा प्रमुख कारण है, मुख्य रूप से दूर के अंग मेटास्टेसिस के कारण। कई पशु मॉडल उत्पन्न किए गए हैं, जिनमें व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल शामिल हैं, जहां कैंसर कोशिकाओं को स्तन वसा पैड में इंजेक्ट किया जाता है। हालांकि, ये मॉडल ट्यूमर विकास कैनेटीक्स और मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण की निगरानी करने में मदद नहीं कर सकते हैं। चूहों में वास्तविक समय में कैंसर कोशिकाओं की निगरानी करने के लिए अत्याधुनिक उपकरण ट्यूमर जीव विज्ञान की समझ को काफी आगे बढ़ाएंगे।

यहां, स्तन कैंसर सेल लाइनों को दृढ़ता से लुसिफेरस और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करते हुए स्थापित किया गया था। विशेष रूप से, इस तकनीक में विट्रो में लूसिफेरस गतिविधि को मापने के द्वारा शुरू किए गए दो अनुक्रमिक चरण शामिल हैं और इसके बाद कैंसर कोशिकाओं को गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंसी (एनओडी-एससीआईडी) चूहों के स्तन वसा पैड में प्रत्यारोपित किया जाता है। इंजेक्शन के बाद, ट्यूमर की वृद्धि और मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण दोनों को वास्तविक समय में noninvasive bioluminescence इमेजिंग सिस्टम द्वारा मॉनिटर किया जाता है। फिर, फेफड़ों में जीएफपी-व्यक्त मेटास्टेसिस के परिमाणीकरण की जांच प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा की जाएगी ताकि मनाया बायोल्यूमिनेसेंस परिणामों को मान्य किया जा सके। लूसिफेरस और प्रतिदीप्ति-आधारित पहचान उपकरणों के संयोजन वाली यह परिष्कृत प्रणाली विवो में कैंसर मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करती है, जिसमें स्तन कैंसर चिकित्सीय और रोग प्रबंधन में उपयोग की बड़ी क्षमता है।

Introduction

स्तन कैंसर दुनिया भर में कैंसर के अक्सर प्रकार हैं, संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल लगभग 250,000 नए मामलों का निदान किया जाताहै। इसकी उच्च घटनाओं के बावजूद, एंटीकैंसर दवाओं के एक नए सेट ने स्तन कैंसर के रोगी परिणामों में काफी सुधार कियाहै। हालांकि, ये उपचार अभी भी अपर्याप्त हैं, क्योंकि कई रोगियों को रोग के पुनरुत्थान और मेटास्टैटिक प्रसार का अनुभव होता हैमहत्वपूर्ण अंग2, जो रोगी रुग्णता और मृत्यु दर का प्राथमिक कारण है। इसलिए, स्तन कैंसर अनुसंधान में मुख्य चुनौतियों में से एक उनके विकास को रोकने के लिए नए साधन विकसित करने के लिए डिस्टल मेटास्टेसिस के गठन को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र की पहचान कर रहा है।

कैंसर मेटास्टेसिस एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें कोशिकाएं प्राथमिक ट्यूमर से अलग हो जाती हैं और रक्त परिसंचरण के माध्यम से पड़ोसी ऊतकों पर आक्रमण करती हैं। इस प्रकार, पशु मॉडल जिसमें कोशिकाएं एक समान मेटास्टैटिक कैस्केड से गुजरती हैं, इस प्रक्रियाको 3,4 नियंत्रित करने वाले तंत्र की पहचान की सुविधा प्रदान कर सकती हैं। इसके अतिरिक्त, विवो मॉडल में ये स्तन कैंसर चिकित्सीयएजेंटों 5,6 के विकास के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, ये ऑर्थोटोपिक मॉडल वास्तविक ट्यूमर विकास कैनेटीक्स को इंगित नहीं कर सकते हैं क्योंकि प्रभाव केवल समाप्ति पर निर्धारित किया जाता है। इसलिए, हमने वास्तविक समय में ट्यूमर के विकास और मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण का पता लगाने के लिए एक लूसिफेरस-आधारित उपकरण स्थापित किया। इसके अतिरिक्त, ये कोशिकाएं मेटास्टैटिक कॉलोनियों का पता लगाने के लिए जीएफपी व्यक्त करती हैं। यह दृष्टिकोण अपेक्षाकृत सरल है और इसमें कोई आक्रामक प्रक्रियाएं शामिल नहींहैं। इस प्रकार, लुसिफेरस और प्रतिदीप्ति का पता लगाने का संयोजन स्तन कैंसर चिकित्सीय और रोग प्रबंधन के प्रीक्लिनिकल अध्ययन को आगे बढ़ाने के लिए एक सहायक रणनीति है।

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Protocol

सभी माउस प्रयोगों को हिब्रू विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति-अनुमोदित प्रोटोकॉल एमडी -21-16429-5 के तहत किया गया था। इसके अलावा, हिब्रू विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु देखभाल (AAALAC) के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा प्रमाणित है।

1. सेल लाइन रखरखाव

नोट: मानव स्तन कैंसर सेल लाइनों (MCF-7, MDA-MB-468, और MDA-MB-231) का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया गया था।

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में सभी स्तन कैंसर सेल लाइनों को संस्कृति, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक एक humidified कार्बन डाइऑक्साइड (5% CO2) इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: नियमित रूप से सेल घनत्व की जाँच करें; विभाजित करें और भविष्य के उपयोग के लिए विस्तार जब वे 70% confluency तक पहुँचने.

2. वायरस की तैयारी

  1. HEK293T कोशिकाओं को ट्रिप्सिन के 1 मिलीलीटर के साथ तब तक व्यवहार करें जब तक कि वे अलग न हो जाएं।
  2. ट्रिप्सिन गतिविधि को बेअसर करने के लिए डीएमईएम (10% एफबीएस) के 10 एमएल जोड़ें, और सेल निलंबन को एक नई 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. कोशिकाओं को तलछट करने के लिए 5 मिनट के लिए 150 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। centrifugation के बाद supernatant त्यागें और ताजा DMEM माध्यम के 1 mL जोड़ें।
  4. सेल एकाग्रता और बीज 1.2 × 106 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक छह अच्छी तरह से प्लेट में निर्धारित करें।
  5. अगले दिन, अभिकर्मक अभिकर्मक, सीरम मुक्त डीएमईएम, लिफाफा प्लास्मिड (वीएसवी-जी), लेंटीवायरस पैकेजिंग प्लास्मिड (ΠVPR), और pLX304 लूसिफेरस-V5 ब्लास्ट प्लास्मिड या FUW GFP प्लास्मिड सहित सभी आवश्यक अभिकर्मकों को प्रीवार्म करें।
  6. एक 1.5 mL autoclaved centrifuge ट्यूब में, VSV-G प्लास्मिड के 0.3 μg के साथ सीरम-मुक्त DMEM के 50 μL, ΠVPR के 1 μg, और pLX304 Luciferase-V5 ब्लास्ट प्लास्मिड या FUW GFP प्लास्मिड के 1.2 μg मिश्रण।
  7. माध्यम के साथ इन प्लास्मिडों को अच्छी तरह से मिलाने के बाद, अभिकर्मक अभिकर्मक के 5 μL जोड़ें, धीरे से मिलाएं, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  8. इनक्यूबेशन के बाद, HEK293T कोशिकाओं के लिए मिश्रण ड्रॉपवाइज जोड़ें।
  9. 24 घंटे के बाद, विकास माध्यम को (30% FBS) DMEM के 2 mL के साथ बदलें। अगले दिन (48 ज पोस्ट-ट्रांसफैक्शन) पर, वायरस वाले माध्यम की कटाई करें ("pLX304 Luciferase-V5 या FUW GFP वायरस")।
    नोट: 30% FBS का उपयोग वायरस उत्पादन दक्षता को बढ़ाता है।
  10. किसी भी HEK293T सेल अवशेषों से बचने के लिए, 5 मिनट के लिए 150 × g पर 0.45 μm सिरिंज फ़िल्टर या सेंट्रीफ्यूज के माध्यम से वायरस युक्त माध्यम को पास करें, और supernatant इकट्ठा करें।
    नोट: लंबी अवधि के भंडारण के लिए, वायरस के काम करने वाले एलीकोट को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

3. जीएफपी और लूसिफेरस को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की स्थापना ("जीएफपी + ल्यूक + कोशिकाएं")

  1. कोशिकाओं को संक्रमित करने से एक दिन पहले, बीज 8 × छह-अच्छी तरह से प्लेट में प्रति अच्छी तरह से 105 कोशिकाएं।
  2. रात भर इनक्यूबेशन के बाद, विकास माध्यम को ताजा माध्यम के साथ बदलें जिसमें पॉलीब्रेन के 8 μg / mL होते हैं। कोशिकाओं के लिए dropwise FUW GFP वायरस के 200 μL जोड़ें।
  3. वैकल्पिक: वायरस दक्षता को बढ़ाने के लिए, 30 मिनट (37 डिग्री सेल्सियस) (स्पिन संक्रमण) के लिए 560 × जी पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. 48 ज के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जीएफपी अभिव्यक्ति को सत्यापित करें।
  5. GFP-अभिव्यक्त करने वाली कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) (GFP+) (चित्र1A) द्वारा सॉर्ट करें.
  6. चरण 3.2 में वर्णित के रूप में pLX304 Luciferase-V5 ब्लास्ट वायरस के साथ GFP-सॉर्ट की गई कोशिकाओं को संक्रमित करें।
  7. blasticidin (10 μg / mL) के साथ कोशिकाओं का इलाज करें 30 ज पोस्ट-संक्रमण pLX304 Luciferase-V5 विस्फोट-व्यक्त कोशिकाओं (GFP +, Luc + कोशिकाओं) के लिए समृद्ध करने के लिए। फिर, हर दो दिनों में, ब्लास्टिसिडिन युक्त ताजा माध्यम के साथ बदलें। इसके अतिरिक्त, एक नियंत्रण के रूप में, एक ही ब्लास्टिसिडिन युक्त माध्यम के साथ भोली कोशिकाओं का इलाज करें।
    नोट: ब्लास्टिसिडिन उपचार के कुछ दिनों के बाद संक्रमित और नियंत्रण कोशिकाओं के बीच एक स्पष्ट अंतर देखा जाना चाहिए। यह प्रभाव सेल लाइन-निर्भर है और आमतौर पर ~ 8-10 दिन लगते हैं। एक खराब जीवित रहने की दर एक कम वायरल उत्पादन उपज का संकेत देगी। यदि हां, तो वायरस के एक नए बैच का उत्पादन करें क्योंकि कम दक्षता भविष्य के प्रयोगों को प्रभावित कर सकती है।

4. विट्रो luciferase गतिविधि में मान्य

  1. MCF-7, MDA-MB-468, और MDA-MB-231 GFP+ Luc+ कोशिकाओं को 15 सेमी प्लेट में 80% confluency तक बढ़ाएं। चरण 2.1-2.2 में वर्णित के रूप में ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा कक्षों को काटें।
  2. प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं की बढ़ती संख्या (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 104) को एक काले रंग की 96-अच्छी तरह से प्लेट में बीज दें।
    नोट: काले 96-अच्छी तरह से प्लेटों को सफेद या पारदर्शी प्लेटों autoluminescence संकेतों का उत्पादन होगा के रूप में luciferase के स्तर को मापने के लिए अधिक उपयुक्त हैं। एक नियंत्रण के रूप में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि पीबीएस से कोई ऑटोल्यूमिनेसेंस नहीं है, अकेले एक कुएं में फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) का उपयोग करें।
  3. DMEM के 100 μL के साथ सभी कुओं को भरें और 16-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. पीबीएस में 30 मिलीग्राम / एमएल के स्टॉक से 1.5 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता पर लूसिफेरिन समाधान तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर लूसिफेरिन समाधान और स्टोर के स्टॉक को एलीकोट करें।
  5. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धीरे से एक बार धोएं, प्रत्येक अच्छी तरह से ल्यूसिफेरिन समाधान के 100 μL जोड़ें, और 2 मिनट तक प्रतीक्षा करें। अंत में, बायोल्यूमिनेसेंस का उपयोग करके सभी स्तन कैंसर कोशिकाओं में लूसिफेरस गतिविधि को मापें।
    नोट: पशु प्रयोगों से पहले इन विट्रो जीएफपी और लूसिफेरस अभिव्यक्ति की जांच करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, रिक्त कुओं का उपयोग पृष्ठभूमि को घटाने के लिए किया जाता है।

5. GFP + ल्यूक + कोशिकाओं के साथ चूहों को इंजेक्ट करना

  1. 5 × 106 (MCF-7 और MDA-MB-468) या 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP + Luc + कोशिकाओं को क्रमशः 200 μL या 100 μL PBS में स्थानांतरित करें।
  2. इंजेक्शन से पहले, 5% कीटाणुनाशक समाधान के साथ बाँझ जैविक हुड को साफ करें ( सामग्री की तालिका देखें)। फिर, फ़िल्टर्ड (0.2 μm) हवा के साथ चूहों को एनेस्थेटिकाइज़ करें जिसमें 2-3 मिनट के लिए 1 एल / मिनट की एयरफ्लो दर पर 4% आइसोफ्लुरेन होता है।
    नोट: उचित संवेदनाहारीकरण की पुष्टि करना आवश्यक है; माउस के पैर की अंगुली चुटकी और किसी भी प्रतिक्रिया के लिए देखो.
  3. एक सुपाइन स्थिति में anesthetized माउस सिर पर एक शंकु जगह. संज्ञाहरण के तहत रहते हुए सूखापन को रोकने के लिए इसकी आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें।
  4. चूहे के पेट के क्षेत्र को पोंछें, स्तन ग्रंथि के ऊपर, इथेनॉल के साथ एक कपास झाड़ू का उपयोग करके और संदंश के साथ 4वें स्तन ग्रंथि को उठाएं।
  5. वसा पैड के नीचे सुई 27 G x 3/4 (0.4 x 19 मिमी) डालें और धीरे-धीरे सेल निलंबन के 100 μL को इंजेक्ट करें।
    नोट: एक गोल उभार त्वचा के नीचे दिखाई देगा। इसके अलावा, एक अनुचित इंजेक्शन ट्यूमर की वृद्धि दर में विचलन या एक ही प्रयोगात्मक समूह में ट्यूमर की अनुपस्थिति का कारण बन सकता है।
  6. इंजेक्शन प्रक्रिया के बाद, चूहों को हुड से बाहर निकालें और उन्हें एक नए पिंजरे में स्थानांतरित करें। चूहों की निगरानी करें जब तक कि वे चेतना में वापस नहीं आते।
    नोट:: सुनिश्चित करें कि सभी प्रयुक्त सुइयों और सिरिंज शार्प बॉक्स में छोड़ दिए जाते हैं।

6. जीएफपी + ल्यूक + चूहों में लूसिफेरस के स्तर को मापने

  1. बायोल्यूमिनेसेंस डिटेक्शन से पहले, बाएं हाथ से अपनी गर्दन को पकड़कर सचेत माउस को रोकें। फिर, हाथ को बाईं ओर झुकाएं, जिसके परिणामस्वरूप माउस का चेहरा निचले शरीर के साथ ऊपर की ओर एक सुपाइन स्थिति में होता है।
  2. सुई के आकार 27 जी एक्स 3/4 (0.4 x 19 मिमी) के साथ 1.0 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके निचले-बाएं पेट के चतुर्भुज में माउस की पेट की सतह में लूसिफेरिन (30 मिलीग्राम / एमएल) इंट्रापेरिटोनियल (आई.पी.) के 100 μL इंजेक्ट करें।
    नोट: सुई की नोक को पेट की दीवार से 3-5 मिमी से अधिक नहीं डाला जाना चाहिए, क्योंकि यह आंत के अंगों में प्रवेश कर सकता है। इसके अतिरिक्त, संज्ञाहरण के बिना आईपी इंजेक्शन करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि एनेस्थेटिक चूहों के शरीर में लूसिफेरिन वितरण जागरूक चूहों की तुलना में धीमा होता है। इस प्रकार, जागरूक चूहों में लूसिफेरस के स्तर की निगरानी एक तेज प्रक्रिया है।
  3. ट्यूमर कैनेटीक्स को मापने से पहले संज्ञाहरण कक्ष के भीतर 3 मिनट के बाद संज्ञाहरण के बिना माउस को 7 मिनट के लिए रखें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय विभिन्न प्रयोगों, सेल लाइनों, और प्रजातियों से प्रजातियों के बीच भिन्न होता है। इस प्रकार, प्रयोगों को शुरू करने से पहले इनक्यूबेशन समय को कैलिब्रेट करने की सिफारिश की जाती है।
  4. चरण 5.2-5.3 में वर्णित के रूप में चूहों को anesthetize।
  5. इनक्यूबेशन के दौरान सॉफ़्टवेयर (सामग्री तालिका) खोलें, इमेजिंग सिस्टम को प्रारंभ करें, और प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करें.
    नोट: ध्यान रखें कि कैमरा नीचे ठंडा करने और -90 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए ~ 10 मिनट लगेगा। इसके अतिरिक्त, पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में, भोले चूहों में लूसिफेरस के स्तर को मापें (यानी, जीएफपी + चूहों को कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया जाता है जो लूसिफेरस जीन को व्यक्त नहीं करते हैं)।
  6. निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके सेटअप को ऑटो एक्सपोज़र में रखें: एक्सपोज़र टाइम ऑटो, 60 एस; बिनिंग मध्यम, एफ / स्टॉप 1; उत्तेजना फ़िल्टर अवरुद्ध; उत्सर्जन फ़िल्टर खुला. जब प्रारंभ समाप्त हो जाता है, तो इमेजिंग विज़ार्ड | का चयन करें Bioluminescence , और उसके बाद अगला | क्लिक करें फ़िल्टर | खोलें छवि विषय में माउस का चयन करें।
  7. फ़ील्ड दृश्य में, चरण C (10 सेमी) और विषय ऊँचाई: 1.50 सेमी का चयन करें.
  8. C करने के लिए छवि सेटअप चरण क्लिक करें, और प्राप्त करें बटन पर क्लिक करने से पहले, सुनिश्चित करें कि माउस उचित सुपाइन स्थिति में मंच पर रखा गया है।
  9. दरवाजा बंद करें, प्राप्त करें बटन क्लिक करें, और स्क्रीन पर किसी छवि के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें.
    नोट: ऑटो-एक्सपोज़र विकल्प के साथ, एक मजबूत सिग्नल सिग्नल के आधार पर 5-20 सेकंड लेता है; एक कमजोर संकेत लगभग 60 सेकंड लेगा।
  10. अन्य चूहों के लिए इस चरण को दोहराएँ।
  11. फेफड़ों के मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए, मोटे काले कार्डबोर्ड पेपर का उपयोग करके प्राथमिक ट्यूमर के मजबूत संकेत को कवर करें और कैमरे की ओर फेफड़ों के केवल वेंट्रल पक्ष को उजागर करें। ऊपर वर्णित समान पैरामीटर का उपयोग करके छवि को कैप्चर करें।

7. bioluminescence और प्रतिदीप्ति का उपयोग कर पूर्व विवो छवि प्राप्त करना

  1. Desiccator में कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) साँस लेने का उपयोग कर चूहों euthanize और autoclaved कैंची और संदंश का उपयोग कर चूहों विच्छेदन.
  2. 0.9% खारा का उपयोग कर चूहों perfuse, अंगों फसल, और अंग से bloodstains को खत्म करने के लिए 1x PBS के साथ कुल्ला.
  3. एक पेट्री डिश के लिए कुल्ला अंग हस्तांतरण और यह bioluminescence मशीन के चरण में जगह. चरण 6.2-6.6 में वर्णित के रूप में एक ही bioluminescence सेटिंग लागू करें।
    नोट:: लूसिफेरस सिग्नल में कमी के कारण, यह चरण समय-सीमित है। इस प्रकार, चूहों को euthanizing के बाद, तुरंत bioluminescence द्वारा अंग की कल्पना।
  4. GFP छवियों के लिए, Bioluminescence के बजाय प्रतिदीप्ति GFP फ़िल्टर का उपयोग करते हुए, चरण 6.3 में वर्णित के रूप में एक ही सेटिंग लागू करें।
  5. जीएफपी + उपनिवेशों की उपस्थिति की जांच करने के लिए स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फेफड़ों की छवियों को लें।

8. Bioluminescence डेटा विश्लेषण

  1. सॉफ़्टवेयर को डबल-क्लिक करें और फ़ाइल मेनू से खोलें का चयन करें.
  2. सभी फ़ाइलों को खोलें और उन्हें कम करें। सुनिश्चित करें कि सभी इकाइयां चमक (फोटॉन) हैं। साथ ही, सभी छवियों के लिए समान पैरामीटर रखने के लिए सभी पर लागू करें क्लिक करें ।
  3. दृश्य मेनू से, उपकरण पैलेट का चयन करें, जो एक नई विंडो खोलेगा.
  4. उपकरण पैलेट विंडो से, ROI उपकरण टैब का चयन करें और प्रकार में, औसत Bkg ROI चुनें।
  5. ROI उपकरणों से, सर्कल का चयन करें, और माउस के वक्षीय क्षेत्र पर एक छोटा सा सर्कल आकर्षित करें।
  6. सर्कल पर डबल-क्लिक करें, पृष्ठभूमि ROI टैब से भविष्य के ROIs विकल्प के लिए BKG के रूप में उपयोग करें विकल्प का चयन करें, और पूर्ण क्लिक करें.

9. कुल फ्लक्स को मापने

  1. उपकरण पैलेट विंडो से, ROI उपकरण टैब का चयन करें और प्रकार में, ROI का मापन चुनें।
  2. ROI उपकरण से, सर्कल का चयन करें, और माउस के प्राथमिक ट्यूमर पर एक बड़ा सर्कल आकर्षित करें।
  3. ROI की प्रतिलिपि बनाएँ राइट-क्लिक करें और प्रत्येक माउस की प्रत्येक व्यक्तिगत फ़ाइल में ROI चिपकाएँ राइट-क्लिक करें।
  4. ROI उपकरण टैब से ROIs को मापें क्लिक करें, जो ROI मापनाम की एक नई विंडो खोलेगा. इस टैब से, माप प्रकार ों को चमक (फोटॉन) और छवि विशेषताओं के रूप में सभी पॉपुलेटेड मानों के रूप में रखें.
  5. फ़ाइल को मापन फ़ाइल (*.txt) या Csv (*.csv) स्वरूप के रूप में निर्यात करें.
  6. एक स्प्रेडशीट में निर्यात किए गए डेटा को खोलें और हफ्तों के लिए कुल फ्लक्स (पी / एस) और मान लें।
    नोट:: इस चरण का उपयोग विभिन्न समूहों को मापने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चूहों को एक वाहन बनाम एक दवा के साथ इलाज किया जाता है ।
  7. एक XY प्लॉट उत्पन्न करें, जहां समय को X-अक्ष और कुल फ्लक्स (p/s) के साथ Y-अक्ष के साथ प्रस्तुत किया जाता है। प्रत्येक सप्ताह के लिए, प्रत्येक नमूना समूह के लिए कुल फ्लक्स (पी / एस) पैरामीटर लें और गैर-पैरामीट्रिक छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किसी भी महत्वपूर्ण अंतर को निर्धारित करें।

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Representative Results

हमने स्तन कैंसर सेल लाइनों (एमडीए-एमबी -231, एमसीएफ -7, और एमडीए-एमबी -468) को जीएफपी और लूसिफेरस वैक्टर व्यक्त किया। विशेष रूप से, यह एक अनुक्रमिक संक्रमण द्वारा प्राप्त किया गया था। सबसे पहले, स्तन कैंसर सेल लाइनों को फ्लोरोसेंट जीएफपी व्यक्त करने वाले एक लेंटीवायरस वेक्टर से संक्रमित किया गया था। GFP-positive cells (GFP+) को 2 दिन बाद के संक्रमण (चित्रा 1A, B) को सॉर्ट किया गया था और pLX304 Luciferase-V5 वेक्टर से संक्रमित किया गया था। फिर, ब्लास्टिसिडिन का उपयोग संकेतित (जीएफपी +, ल्यूक +) कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए लूसिफेरस के लिए चयन करने के लिए किया गया था। इन विट्रो लूसिफेरस गतिविधि को मान्य करने के लिए, हमने लूसिफेरस गतिविधि के स्तर (चित्रा 1 सी) में एक सेल नंबर-निर्भर वृद्धि का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, लूसिफेरस गतिविधि और सेल नंबर (चित्रा 1 डी) के बीच एक रैखिक सहसंबंध पाया गया था।

चूहों में लूसिफेरस का पता लगाने की पुष्टि करने के लिए, सभी तीन जीएफपी +, ल्यूक + स्तन कैंसर सेल लाइनों को मादा एनओडी / एससीआईडी चूहों के स्तन वसा पैड में इंजेक्ट किया गया था। फिर, चूहों को ट्यूमर के विकास कैनेटीक्स को निर्धारित करने के लिए हर दो सप्ताह में बायोल्यूमिनेसेंस पढ़ने के अधीन किया गया था। हमने पाया कि ट्यूमर विकास कैनेटीक्स सेल लाइनों के बीच भिन्न होता है; यह अधिक आक्रामक एमडीए-एमबी-231 में तेज है और कम आक्रामक सेल लाइनों MCF-7 और MDA-MB-468 (चित्रा 2) में धीमा है।

इसके बाद, एमडीए-एमबी -231 सेल लाइन द्वारा उत्पन्न अलग-थलग ट्यूमर की प्रतिदीप्ति रीडिंग प्राप्त की गई थी। विशेष रूप से, इंजेक्शन के बाद 6 सप्ताह, जीएफपी प्रतिदीप्ति की पुष्टि करने के लिए चूहों से ट्यूमर काटा गया था; ट्यूमर को उनके जीएफपी अभिव्यक्ति (चित्रा 3 ए) को बनाए रखने के लिए पाया गया था। अगला लक्ष्य यह निर्धारित करना था कि क्या मेटास्टैटिक कॉलोनी गठन का मूल्यांकन बायोल्यूमिनेसेंस मशीन का उपयोग करके जीवित माउस के फेफड़ों में वास्तविक समय में किया जा सकता है; सकारात्मक bioluminescence रीडिंग पूरे माउस के फेफड़ों से प्राप्त किए गए थे (चित्रा 3 बी)। यह सत्यापित करने के लिए कि ये सकारात्मक मेटास्टैटिक उपनिवेश थे, फेफड़ों को काटा गया था, और मेटास्टैटिक उपनिवेशों को जीएफपी और बायोल्यूमिनेसेंस (चित्रा 3 सी) के लिए देखा गया था।

Figure 1
चित्र 1: GFP अभिव्यक्ति और कोशिकाओं में लूसिफेरस गतिविधि का सत्यापन। (A) GFP कोशिकाओं को FACS द्वारा क्रमबद्ध किया गया था। MDA-MB-231 गैर-GFP और GFP+ कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियाँ. (बी) एमडीए-एमबी-231, एमसीएफ-7 और एमडीए-एमबी-468 कोशिकाएं जीएफपी-एक्सप्रेसिंग वायरस से संक्रमित थीं, जिसके बाद एफएसीएस छंटाई हुई। प्रत्येक सेल लाइन की एक छवि को ब्राइटफील्ड (बाएं) और जीएफपी (दाएं) में दर्शाया गया है। कोशिकाओं को 10x आवर्धन पर एक Nikon Eclipse 80i माइक्रोस्कोप के तहत कब्जा कर लिया गया था। स्केल बार = 100 μm. (C) प्रत्येक सेल में लूसिफेरस गतिविधि के कारण बायोल्यूमिनेसेंस को एक ल्यूमिनोमीटर द्वारा निर्धारित किया गया था। कोशिकाओं की बढ़ती संख्या (जैसा कि ए में) को एक काले 96-अच्छी तरह से प्लेट में बीज दिया गया था। रंग पट्टी luminescence की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है. (डी) एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं की लूसिफेरस गतिविधि का प्रदर्शन करने वाला एक एक्सवाई प्लॉट (जैसा कि सी में मापा गया है)। संक्षेप: GFP = हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एसएससी-ए = साइड-बिखरे हुए शिखर का क्षेत्र; GFP+ = GFP-positive; FACS = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ट्यूमर के विकास के कैनेटीक्स bioluminescence मशीन द्वारा निर्धारित किया गया था। विवो ट्यूमर वृद्धि कैनेटीक्स में NOD-SCID चूहों में साप्ताहिक रूप से निर्धारित किया गया था, और प्रतिनिधि छवियों को (ए) एमडीए-एमबी -231, (बी) एमसीएफ -7, (सी) एमडीए-एमबी -468 के लिए बायोल्यूमिनेसेंस का उपयोग करके कब्जा कर लिया गया था। रंग पट्टी luminescence की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है. (d) ल्यूमिनेसेंस गतिविधि का परिमाणीकरण कुल फ्लक्स के रूप में प्रस्तुत किया गया है। (ई) एमडीए-एमबी -231 चूहों; व्यक्तिगत पठन एक साजिश के रूप में प्रतिनिधित्व किया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ट्यूमर गठन और फेफड़ों के मेटास्टेसिस को मान्य करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण। (ए) चूहों को परफ्यूज किया गया था, और एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं से उत्पन्न ट्यूमर को काटा गया था। ट्यूमर में जीएफपी के स्तर को बायोल्यूमिनेसेंस मशीन द्वारा मापा गया था। (बी) पूरे चूहों में फेफड़ों के मेटास्टेसिस, जैसा कि बायोल्यूमिनेसेंस द्वारा दिखाया गया है। (सी) मेटास्टेसिस की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, फेफड़ों को SMZ18 Nikon Stereomicroscope (brightfield और GFP) के तहत काटा और मनाया गया था। बायोल्यूमिनेसेंट-ल्यूक-नमूने चूहों को euthanizing के तुरंत बाद लिए गए थे। रंग पट्टी luminescence की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है. संक्षेप: GFP = हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन; ल्यूक = लूसिफेरस; BLI = bioluminescence इमेजिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पशु-आधारित प्रयोग कैंसर अनुसंधान 7,8,9 के लिए अनिवार्य हैं, और वास्तव में कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं 3,6,10,11,12,13,14। हालांकि, इनमें से अधिकांश अध्ययनों ने केवल प्रयोगों के अंत में जैविक प्रभाव को निर्धारित किया, और इस प्रकार ट्यूमर विकास कैनेटीक्स या मेटास्टेसिस उपनिवेशीकरण पर प्रभाव अनिर्धारित रहता है। यहां, हम स्तन वसा पैड में जीएफपी और लूसिफेरस को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को संक्रमित करके एक noninvasive दोहरी bioluminescence दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। इस शक्तिशाली उपकरण का उपयोग करके, ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस को वास्तविक समय14 में चूहों में मॉनिटर किया जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं, जो अतिरिक्त सावधानी की मांग करते हैं। उदाहरण के लिए, इस प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण चरणों में से एक माउस इंजेक्शन से पहले कोशिकाओं में लूसिफेरस और जीएफपी अभिव्यक्ति के स्तर की निगरानी करके संक्रमण की दक्षता को सत्यापित करना है। इस प्रकार, ब्लास्टिसिडिन खुराक15 और लेंटिवायरल उत्पादन16 प्रोटोकॉल को प्रयोगात्मक दक्षता बढ़ाने के लिए प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

कुछ तकनीकी मुद्दों में vivo प्रयोग में bioluminescence संकेत को प्रभावित कर सकते हैं. इन मुद्दों में बायोल्यूमिनेसेंस रीडिंग के दौरान माउस का आंदोलन शामिल है, जो छवि की गुणवत्ता में हस्तक्षेप कर सकता है और इस प्रकार ट्यूमर गतिज घटता को प्रभावित कर सकता है। इस प्रकार, जानवरों को सब्सट्रेट इंजेक्शन के बाद और पूरी प्रक्रिया के दौरान पूरी तरह से एनेस्थेटिक किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, मशीन में कई जानवरों को एक साथ रखने से ल्यूमिनेसेंस रीडिंग में असंगतता हो सकती है क्योंकि उच्च सिग्नल वाले चूहे कम तीव्रता वाले लोगों को मुखौटा कर सकते हैं। इसलिए, ल्यूमिनेसेंस रीडिंग को प्रत्येक माउस के लिए व्यक्तिगत रूप से लिया जाना चाहिए।

इन विट्रो बायोल्यूमिनेसेंस रीडिंग का संचालन करते समय, पीबीएस के साथ संस्कृति माध्यम को बदलना महत्वपूर्ण है, क्योंकि माध्यम में सीरम और अन्य पूरक होते हैं जो संकेत के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, केवल पीबीएस (कोई कोशिकाएं नहीं) वाले नमूने के ल्यूमिनेसेंस सिग्नल को मापकर पृष्ठभूमि पढ़ने को समाप्त करना आवश्यक है।

यह प्रोटोकॉल स्तन कैंसर कोशिका वृद्धि और मेटास्टेसिस को मापने के लिए एक noninvasive तकनीक का वर्णन करता है। विशेष रूप से, यह पेपर स्तन कैंसर सेल लाइनों के इंजेक्शन का वर्णन करता है, जो माउस स्तन वसा पैड में जीएफपी और लूसिफेरस दोनों को व्यक्त करता है। यह संयोजन विवो और पूर्व विवो में मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण को मापने के लिए एक त्वरित और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है।

इस विधि के स्पष्ट लाभों के बावजूद, इसकी कुछ सीमाएं हैं। प्राथमिक बाधा एक बायोल्यूमिनेसेंस मशीन की आवश्यकता है, क्योंकि यह एक अपेक्षाकृत महंगी मशीन है और इसलिए हमेशा उपलब्ध नहीं है। इसके अलावा, प्रत्येक पठन समय लेने वाला है, और इस प्रकार मशीन को ओवरबुक और अनुपलब्ध किया जा सकता है। एक और सीमा प्रोटोकॉल को ही संदर्भित करती है। पूर्व विवो नमूनों में बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल का पता लगाने के लिए, चूहों को euthanize करने और तुरंत नमूने की जांच करने की सिफारिश की जाती है। यह चरण एक समय-सीमित चरण है और प्रयोगों के एक बड़े सेट के लिए संभव नहीं है।

अंत में, यह noninvasive bioluminescence उपकरण चूहों में ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए अत्यधिक संवेदनशील है। यह प्रोटोकॉल स्तन कैंसर तक सीमित नहीं है और इसे फेफड़ों और अग्नाशय के कैंसर जैसे अन्य कार्सिनोमा पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, क्योंकि यह noninvasive है, यह एंटीकैंसर दवाओं12 की प्रभावकारिता और वास्तविक समय में ट्यूमर विकास कैनेटीक्स पर उनके प्रभाव को मापने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

सभी लेखकों ने खुलासा किया है कि उनके पास हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम वाईडीएस प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम छोटे पशु इमेजिंग सुविधा प्रदान करने के लिए हदासाह मेडिकल सेंटर, यरूशलेम में ट्रांसलेशनल मेडिसिन के लिए वोहल इंस्टीट्यूट को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस अध्ययन को इज़राइल कैंसर रिसर्च फंड से अनुसंधान कैरियर विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL eppendorf tubes Lifegene LMCT1.7B-500
10 µL tips Lifegene LRT10
1000 µL tips Lifegene LRT1000
15 mL tubes Lifegene LTB15-500
200 µL tips Lifegene LRT200
6 well cell culture plate COSTAR 3516
96 well Plates BLACK flat bottom Bar Naor BN30496
Automated Cell Counters Thermofisher A50298
BD FACSAria III sorter BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') BD 302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 BD 303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish CORNING 430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish CORNING 430599
Countess cell counting chamber slides Thermofisher C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine Biological Industries 01-055-1A
Eclipse 80i microscope Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R Sigma Aldrich EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
FUW GFP Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell Piramal NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
L-Glutamine Solution Biological industries 03-020-1A
Living Image Software PerkinElmer bioluminescence measurement
MCF-7 ATCC ATCC HTB-22
MDA-MB-231 ATCC ATCC HTB-26
MDA-MB-468 ATCC ATCC HTB-132
Pasteur pipettes NORMAX 2430-475
PBS Hylabs BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr Addgene #8455 Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G Addgene #8454 Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution Biological Industries 03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15) MINI PLAST 820-090-01-017
Pipettes 10ml Lifegene LG-GSP010010S
Pipettes 25ml Lifegene LG-GSP010050S
Pipettes 5ml Lifegene LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid Addgene #98580
Polybrene Sigma Aldrich #107689
Prism 9 GraphPad
Reagent Reservoirs Bar Naor BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes Nikon
Sodium Chloride Bio-Lab 190359400
Syringe filters Lifegene LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution Biological industries 03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1a
Vacuum driven Filters SOFRA LIFE SCIENCE SPE-22-500
Virusolve disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade Promega P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Sigma Aldrich #6366236001

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 177 स्तन कैंसर पशु मॉडल फेफड़ों के मेटास्टेसिस Lentivirus लूसिफेरस Bioluminescence Orthotopic ट्यूमर विकास
Bioluminescence का उपयोग कर चूहों में स्तन कैंसर के विकास और मेटास्टेटिक कॉलोनी गठन की निगरानी
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Solaimuthu, B., Hayashi, A., Khatib, … More

Solaimuthu, B., Hayashi, A., Khatib, A., Shaul, Y. D. Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence. J. Vis. Exp. (177), e63060, doi:10.3791/63060 (2021).

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