Summary
Qui, descriviamo un metodo di monitoraggio non invasivo che coinvolge la luciferasi e l'espressione di proteine fluorescenti verdi in varie linee cellulari di cancro al seno. Questo protocollo fornisce una tecnica per monitorare la formazione del tumore e la colonizzazione metastatica in tempo reale nei topi.
Abstract
Il cancro al seno è una frequente neoplasia eterogenea e la seconda causa di mortalità nelle donne, principalmente a causa di metastasi di organi a distanza. Sono stati generati diversi modelli animali, tra cui i modelli murini ortotopici ampiamente utilizzati, in cui le cellule tumorali vengono iniettate nel cuscinetto di grasso mammario. Tuttavia, questi modelli non possono aiutare a monitorare la cinetica di crescita del tumore e la colonizzazione metastatica. Strumenti all'avanguardia per monitorare le cellule tumorali in tempo reale nei topi faranno progredire significativamente la comprensione della biologia tumorale.
Qui sono state stabilite linee cellulari di cancro al seno che esprimono stabilmente luciferasi e proteina fluorescente verde (GFP). In particolare, questa tecnica contiene due passaggi sequenziali iniziati misurando l'attività della luciferasi in vitro e seguiti dall'impianto delle cellule tumorali in cuscinetti di grasso mammario di topi non obesi diabetici-gravi immunodeficienza combinata (NOD-SCID). Dopo l'iniezione, sia la crescita tumorale che la colonizzazione metastatica vengono monitorate in tempo reale dal sistema di imaging a bioluminescenza non invasivo. Quindi, la quantificazione delle metastasi che esprimono GFP nei polmoni sarà esaminata al microscopio a fluorescenza per convalidare i risultati di bioluminescenza osservati. Questo sofisticato sistema che combina luciferasi e strumenti di rilevamento basati sulla fluorescenza valuta le metastasi del cancro in vivo, che ha un grande potenziale per l'uso nelle terapie del cancro al seno e nella gestione della malattia.
Introduction
I tumori al seno sono tipi frequenti di cancro in tutto il mondo, con circa 250.000 nuovi casi diagnosticati ogni anno negli Stati Uniti1. Nonostante la sua alta incidenza, una nuova serie di farmaci antitumorali ha migliorato significativamente gli esiti delle pazienti con cancro al seno2. Tuttavia, questi trattamenti sono ancora inadeguati, poiché molti pazienti sperimentano una recidiva della malattia e una diffusione metastatica agli organi vitali2, che è la causa principale della morbilità e della mortalità del paziente. Pertanto, una delle principali sfide nella ricerca sul cancro al seno è identificare i meccanismi molecolari che regolano la formazione di metastasi distali per sviluppare nuovi mezzi per inibire il loro sviluppo.
Le metastasi del cancro sono un processo dinamico in cui le cellule si staccano dal tumore primario e invadono i tessuti vicini attraverso la circolazione sanguigna. Pertanto, i modelli animali in cui le cellule subiscono una cascata metastatica simile possono facilitare l'identificazione dei meccanismi che governano questo processo 3,4. Inoltre, questi modelli in vivo sono essenziali per lo sviluppo di agenti terapeutici per il cancro al seno 5,6. Tuttavia, questi modelli ortotopici non possono indicare l'effettiva cinetica di crescita del tumore in quanto l'effetto è determinato solo al termine. Pertanto, abbiamo istituito uno strumento basato sulla luciferasi per rilevare lo sviluppo del tumore e la colonizzazione metastatica in tempo reale. Inoltre, queste cellule esprimono GFP per rilevare le colonie metastatiche. Questo approccio è relativamente semplice e non comporta alcuna procedura invasiva3. Pertanto, la combinazione di luciferasi e rilevamento della fluorescenza è una strategia utile per far progredire gli studi preclinici sulle terapie del cancro al seno e sulla gestione della malattia.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti nell'ambito del protocollo MD-21-16429-5 approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Ebraica. Inoltre, l'Università Ebraica è certificata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC).
1. Manutenzione della linea cellulare
NOTA: Le linee cellulari del cancro al seno umano (MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231) sono state utilizzate in questo protocollo.
- Coltivare tutte le linee cellulari del cancro al seno nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina a 37 °C in un incubatore di anidride carbonica umidificata (5% CO2).
NOTA: Controllare regolarmente la densità cellulare; dividere ed espandere per un uso futuro quando raggiungono il 70% di confluenza.
2. Preparazione del virus
- Trattare le cellule HEK293T con 1 mL di tripsina fino a quando non si staccano.
- Aggiungere 10 ml di DMEM (10% FBS) per neutralizzare l'attività della tripsina e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo centrifugo da 15 mL.
- Centrifugare a 150 × g per 5 minuti per sedimentare le cellule. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione e aggiungere 1 mL di mezzo DMEM fresco.
- Determinare la concentrazione cellulare e il seme 1,2 × 106 cellule / pozzetto in una piastra a sei pozzetti.
- Il giorno seguente, pre-riscaldamento tutti i reagenti necessari, tra cui reagente di trasfezione, DMEM privo di siero, plasmide dell'involucro (VSV-G), plasmide di imballaggio del lentivirus (ΔVPR) e plasmide esplosivo di pLX304 Luciferasi-V5 o plasmide GFP FUW.
- In un tubo di centrifuga autoclavata da 1,5 mL, mescolare 50 μL di DMEM privo di siero con 0,3 μg di plasmide VSV-G, 1 μg di ΔVPR e 1,2 μg di plasmide blastizzato di pLX304 Luciferasi-V5 o plasmide FUW GFP.
- Dopo aver miscelato accuratamente questi plasmidi con il mezzo, aggiungere 5 μL del reagente di trasfezione, mescolare delicatamente e incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Dopo l'incubazione, aggiungere la miscela a goccia alle cellule HEK293T.
- Dopo 24 ore, sostituire il mezzo di crescita con 2 ml di DMEM (30% FBS). Il giorno seguente (48 ore dopo la trasfezione), raccogliere il mezzo contenente i virus ("pLX304 Luciferase-V5 o i virus FUW GFP").
NOTA: l'uso del 30% di FBS migliora l'efficienza di produzione del virus. - Per evitare residui di cellule HEK293T, far passare il mezzo contenente virus attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm o una centrifuga a 150 × g per 5 minuti e raccogliere il surnatante.
NOTA: per la conservazione a lungo termine, mantenere le aliquote di lavoro del virus a -80 °C.
3. Stabilire cellule che esprimono stabilmente GFP e luciferasi ("cellule GFP + Luc+")
- Il giorno prima di infettare le cellule, seme 8 × 105 cellule per pozzetto in una piastra a sei pozzetti.
- Dopo l'incubazione notturna, sostituire il terreno di crescita con un mezzo fresco contenente 8 μg/mL di polibrene. Aggiungere 200 μL di virus FUW GFP a goccia alle cellule.
- Opzionale: per migliorare l'efficienza del virus, centrifugare la piastra a 560 × g per 30 minuti (37 °C) (infezione da spin).
- Incubare le cellule per 48 ore e verificare l'espressione della GFP mediante microscopia a fluorescenza.
- Ordinare le cellule che esprimono GFP mediante lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) (GFP+) (Figura 1A).
- Infettare le cellule selezionate GFP con i virus blasti pLX304 Luciferasi-V5 come descritto nel passaggio 3.2.
- Trattare le cellule con blasticidina (10 μg/mL) 30 h post-infezione per arricchire le cellule che esprimono blasti pLX304 Luciferasi-V5 (cellule GFP+, Luc+). Quindi, ogni due giorni, sostituire con mezzo fresco contenente blasticidina. Inoltre, come controllo, trattare le cellule naïve con lo stesso mezzo contenente blasticidina.
NOTA: Una chiara differenza tra le cellule infette e quelle di controllo deve essere osservata dopo alcuni giorni di trattamento con blasticidina. Questo effetto è dipendente dalla linea cellulare e di solito richiede ~ 8-10 giorni. Uno scarso tasso di sopravvivenza indicherà una bassa resa di produzione virale. In tal caso, produrre un nuovo lotto di virus in quanto la bassa efficienza potrebbe influire sugli esperimenti futuri.
4. Convalida dell'attività della luciferasi in vitro
- Coltiva le celle MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 GFP+ Luc+ in una piastra da 15 cm con una confluenza dell'80%. Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione, come descritto nei passaggi 2.1-2.2.
- Seminare un numero crescente di cellule in ogni pozzetto (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 104) in una piastra nera a 96 pozzetti.
NOTA: le piastre nere a 96 pozzetti sono più adatte per misurare i livelli di luciferasi poiché le piastre bianche o trasparenti produrranno segnali di autoluminescenza. Come controllo, utilizzare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) da sola in un unico pozzetto per garantire che non vi sia autoluminescenza da PBS. - Riempire tutti i pozzetti con 100 μL di DMEM e incubare per 16-24 ore.
- Preparare la soluzione di luciferina in PBS ad una concentrazione di 1,5 mg/mL dallo stock di 30 mg/mL. Aliquotare lo stock di soluzione di luciferina e conservare a -20 °C.
- Lavare delicatamente le cellule con PBS, aggiungere 100 μL di soluzione di luciferina in ciascun pozzetto e attendere 2 minuti. Infine, misurare l'attività della luciferasi in tutte le cellule del cancro al seno utilizzando la bioluminescenza.
NOTA: L'esame in vitro dell'espressione di GFP e luciferasi prima degli esperimenti sugli animali è cruciale. Inoltre, i pozzetti vuoti vengono utilizzati per sottrarre lo sfondo.
5. Iniezione di topi con cellule GFP + Luc +
- Trasferire 5 × 106 (MCF-7 e MDA-MB-468) o 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ celle in 200 μL o 100 μL PBS, rispettivamente.
- Prima dell'iniezione, pulire il cappuccio biologico sterile con una soluzione disinfettante al 5% (vedere la tabella dei materiali). Quindi, anestetizzare i topi con aria filtrata (0,2 μm) contenente il 4% di isoflurano ad una portata d'aria di 1 L / min per 2-3 min.
NOTA: È essenziale confermare una corretta anestesia; pizzica la punta del mouse e cerca qualsiasi risposta. - Posizionare un cono sopra la testa del mouse anestetizzata in posizione supina. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Pulire l'area addominale del topo, sopra la ghiandola mammaria, con etanolo usando un batuffolo di cotone e sollevarela 4a ghiandola mammaria con una pinza.
- Inserire l'ago 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) sotto il cuscinetto di grasso e iniettare lentamente 100 μL della sospensione cellulare.
NOTA: un rigonfiamento rotondo apparirà sotto la pelle. Inoltre, un'iniezione impropria può portare a deviazione nel tasso di crescita del tumore o assenza di tumore nello stesso gruppo sperimentale. - Dopo la procedura di iniezione, estrarre i topi dal cappuccio e trasferirli in una nuova gabbia. Monitorare i topi fino a quando non ritornano alla coscienza.
NOTA: Assicurarsi che tutti gli aghi e le siringhe utilizzati siano scartati nella scatola dei taglienti.
6. Misurazione dei livelli di luciferasi nei topi GFP+ Luc+
- Prima del rilevamento della bioluminescenza, trattenere il topo cosciente tenendo il collo con la mano sinistra. Quindi, inclinare la mano a sinistra, con conseguente puntamento del mouse verso l'alto con la parte inferiore del corpo in posizione supina.
- Iniettare 100 μL di luciferina (30 mg/mL) per via intraperitoneale (p.i.) nella superficie addominale del topo nel quadrante addominale inferiore sinistro utilizzando una siringa da 1,0 mL con ago di dimensioni 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm).
NOTA: La punta dell'ago non deve essere inserita a più di 3-5 mm dalla parete addominale, in quanto potrebbe penetrare negli organi viscerali. Inoltre, si raccomanda di eseguire l'iniezione di i.p. senza anestesia poiché la distribuzione della luciferina nel corpo dei topi anestetizzati è più lenta rispetto ai topi coscienti. Pertanto, il monitoraggio dei livelli di luciferasi nei topi coscienti è una procedura più veloce. - Tenere il mouse per 7 minuti senza anestesia seguita da 3 minuti all'interno della camera di anestesia prima di misurare la cinetica del tumore.
NOTA: Il tempo di incubazione varia tra i diversi esperimenti, le linee cellulari e da specie a specie. Pertanto, si consiglia di calibrare il tempo di incubazione prima di iniziare gli esperimenti. - Anestetizzare i topi come descritto nei passaggi 5.2-5.3.
- Aprire il software (Table of Materials) durante l'incubazione, inizializzare il sistema di imaging e fare clic sul pulsante Inizializza .
NOTA: tenere presente che la fotocamera impiegherà ~ 10 minuti per raffreddarsi e raggiungere -90 ° C. Inoltre, come controllo di fondo, misurare i livelli di luciferasi in topi naïve (cioè topi GFP + iniettati con cellule che non esprimono il gene luciferasi). - Mantenere la configurazione in esposizione automatica utilizzando le seguenti impostazioni: tempo di esposizione automatica, 60 s; Binning Medium, F/Stop 1; Filtro di eccitazione bloccato; Filtro di emissione aperto. Al termine dell'inizializzazione , selezionare Creazione guidata immagini | Bioluminescenza e quindi fare clic su Avanti | Apri filtro | selezionare Mouse nel soggetto dell'immagine.
- In Field View, selezionare lo stage C (10 cm) e l'altezza del soggetto: 1,50 cm.
- Fare clic su Impostazione immagine fase su C e, prima di fare clic sul pulsante Acquisisci, assicurarsi che il mouse sia posizionato sullo stage nella posizione supina corretta.
- Chiudi la porta, fai clic sul pulsante Acquisisci e attendi che sullo schermo venga visualizzata un'immagine.
NOTA: con l'opzione Auto-Exposure , un segnale forte richiede 5-20 s a seconda del segnale; un segnale debole impiegherà circa 60 s. - Ripeti questo passaggio per gli altri mouse.
- Per rilevare le metastasi polmonari, coprire il segnale forte del tumore primario utilizzando carta di cartone nero spessa ed esporre solo il lato ventrale dei polmoni verso la fotocamera. Cattura l'immagine utilizzando gli stessi parametri descritti sopra.
7. Acquisizione di immagini ex vivo mediante bioluminescenza e fluorescenza
- Eutanasizzare i topi usando l'inalazione di anidride carbonica (CO2) nell'essiccatore e sezionare i topi usando forbici e pinze autoclavate.
- Perfondere i topi usando soluzione salina allo 0,9%, prelevare gli organi e risciacquare con 1x PBS per eliminare le macchie di sangue dall'organo.
- Trasferire l'organo risciacquato in una capsula di Petri e posizionarlo nello stadio della macchina a bioluminescenza. Applicare la stessa impostazione di bioluminescenza descritta nei passaggi 6.2-6.6.
NOTA: A causa della diminuzione del segnale luciferasi, questo passaggio è limitante nel tempo. Quindi, dopo l'eutanasia dei topi, visualizzare immediatamente l'organo per bioluminescenza. - Per le immagini GFP, applicare la stessa impostazione descritta nel passaggio 6.3, utilizzando il filtro GFP a fluorescenza anziché la bioluminescenza.
- Scatta immagini polmonari usando uno stereomicroscopio per esaminare la presenza di colonie GFP + .
8. Analisi dei dati di bioluminescenza
- Fare doppio clic sul software e selezionare Apri dal menu File .
- Apri tutti i file e riduci a icona. Assicurarsi che tutte le unità siano Radiance (Fotoni). Inoltre, fare clic su Applica a tutti per mantenere gli stessi parametri per tutte le immagini.
- Dal menu Visualizza , selezionare la tavolozza degli strumenti, che aprirà una nuova finestra.
- Dalla finestra Tavolozza degli strumenti , seleziona la scheda Strumenti ROI e in Tipo scegli il ROI medio di Bkg.
- Dagli strumenti ROI, selezionare Cerchio e disegnare un piccolo cerchio sull'area toracica del mouse.
- Fare doppio clic sul cerchio, selezionare l'opzione Usa come BKG per i ROI futuri dalla scheda ROI in background e fare clic su Fine.
9. Misurazione del flusso totale
- Dalla finestra Tavolozza degli strumenti , selezionare la scheda Strumenti ROI e in Tipo scegliere Misurazione del ROI.
- Dagli strumenti ROI, selezionare Cerchio e disegnare un grande cerchio sul tumore primario del mouse.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse su Copia ROI e fare clic con il pulsante destro del mouse su Incolla ROI in ogni singolo file di ciascun mouse.
- Fai clic su Misura ROI nella scheda Strumenti ROI , che aprirà una nuova finestra denominata Misurazioni ROI. Da questa scheda, mantenere i tipi di misurazioni come Radianza (fotoni) e Attributi immagine come tutti i valori popolati.
- Esportare il file in formato File di misurazione (*.txt) o Csv (*.csv).
- Apri i dati esportati in un foglio di calcolo e prendi il flusso totale (p / s) e i valori per le settimane.
NOTA: questo passaggio può essere utilizzato per misurare diversi gruppi. Ad esempio, i topi trattati con un veicolo rispetto a quelli trattati con un farmaco. - Generate un grafico XY, in cui il tempo viene presentato lungo l'asse X e il flusso totale (p/s) lungo l'asse Y. Per ogni settimana, prendi il parametro Total Flux (p / s) per ciascun gruppo di campioni e determina eventuali differenze significative utilizzando il t-test dello studente non parametrico.
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Representative Results
Abbiamo generato linee cellulari di cancro al seno (MDA-MB-231, MCF-7 e MDA-MB-468) che esprimono vettori GFP e luciferasi. In particolare, questo è stato ottenuto da un'infezione sequenziale. In primo luogo, le linee cellulari del cancro al seno sono state infettate da un vettore di lentivirus che esprime GFP fluorescente. Le cellule GFP-positive (GFP+) sono state selezionate 2 giorni dopo l'infezione (Figura 1A,B) e infettate dal vettore pLX304 Luciferasi-V5. Quindi, la blasticidina è stata utilizzata per selezionare la luciferasi per generare le cellule indicate (GFP +, Luc +). Per convalidare l'attività della luciferasi in vitro, abbiamo dimostrato un aumento dipendente dal numero cellulare dei livelli di attività della luciferasi (Figura 1C). Inoltre, è stata trovata una correlazione lineare tra l'attività della luciferasi e il numero di cellule (Figura 1D).
Per confermare il rilevamento della luciferasi nei topi, tutte e tre le linee cellulari di cancro al seno GFP +, Luc + sono state iniettate nel cuscinetto di grasso mammario di topi femmina NOD / SCID. Quindi, i topi sono stati sottoposti a lettura di bioluminescenza ogni due settimane per determinare la cinetica di crescita del tumore. Abbiamo scoperto che la cinetica di crescita del tumore varia tra le linee cellulari; è più veloce nel più aggressivo MDA-MB-231 e più lento nelle linee cellulari meno aggressive MCF-7 e MDA-MB-468 (Figura 2).
Successivamente, sono state ottenute le letture di fluorescenza dei tumori isolati generati dalla linea cellulare MDA-MB-231. In particolare, 6 settimane dopo l'iniezione, i tumori sono stati raccolti dai topi per confermare la fluorescenza GFP; i tumori sono stati trovati per mantenere la loro espressione GFP (Figura 3A). L'obiettivo successivo era determinare se la formazione di colonie metastatiche potesse essere valutata in tempo reale nel polmone di un topo vivente utilizzando la macchina a bioluminescenza; letture positive di bioluminescenza sono state ottenute dal polmone dell'intero topo (Figura 3B). Per verificare che si trattasse di colonie metastatiche positive, il polmone è stato raccolto e le colonie metastatiche sono state osservate per GFP e bioluminescenza (Figura 3C).
Figura 1: Validazione dell'espressione GFP e dell'attività della luciferasi nelle cellule. (A) Le cellule GFP sono state ordinate per FACS. Immagini rappresentative di celle MDA-MB-231 non GFP e GFP+. (B) Le cellule MDA-MB-231, MCF-7 e MDA-MB-468 sono state infettate dal virus che esprime GFP, seguito dallo smistamento FACS. Un'immagine di ogni linea cellulare è rappresentata in campo luminoso (a sinistra) e GFP (a destra). Le cellule sono state catturate sotto un microscopio Nikon Eclipse 80i con ingrandimento 10x. Barre di scala = 100 μm. (C) La bioluminescenza dovuta all'attività della luciferasi in ciascuna cellula è stata determinata da un luminometro. Un numero crescente di cellule (come in A) sono state seminate in una piastra nera a 96 pozzetti. La barra dei colori rappresenta l'intensità della luminescenza. (D) Un grafico XY che dimostra l'attività luciferasi delle cellule MDA-MB-231 (misurata in C). Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; SSC-A = area del picco sparso lateralmente; GFP+ = GFP-positivo; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La cinetica della crescita tumorale è stata determinata dalla macchina a bioluminescenza. La cinetica di crescita tumorale in vivo è stata determinata settimanalmente nei topi NOD-SCID e le immagini rappresentative sono state acquisite utilizzando la bioluminescenza per (A) MDA-MB-231, (B) MCF-7, (C) MDA-MB-468. La barra dei colori rappresenta l'intensità della luminescenza. (D) La quantificazione dell'attività di luminescenza è presentata come flusso totale. (E) topi MDA-MB-231; lettura individuale rappresentata come una trama. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Diversi approcci per convalidare la formazione del tumore e le metastasi polmonari. (A) I topi sono stati perfusi e i tumori generati dalle cellule MDA-MB-231 sono stati raccolti. I livelli di GFP nei tumori sono stati misurati dalla macchina a bioluminescenza. (B) Metastasi polmonari in topi interi, come dimostrato dalla bioluminescenza. (C) Per confermare la presenza di metastasi, i polmoni sono stati raccolti e osservati sotto SMZ18 Nikon Stereomicroscope (brightfield e GFP). Campioni bioluminescenti-Luc-campioni sono stati prelevati immediatamente dopo l'eutanasia dei topi. La barra dei colori rappresenta l'intensità della luminescenza. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; Luc = luciferasi; BLI = imaging a bioluminescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli esperimenti su animali sono obbligatori per la ricerca sul cancro 7,8,9, e in effetti molti protocolli sono stati sviluppati 3,6,10,11,12,13,14. Tuttavia, la maggior parte di questi studi ha determinato l'effetto biologico solo alla fine degli esperimenti, e quindi l'impatto sulla cinetica della crescita tumorale o sulla colonizzazione delle metastasi rimane indeterminato. Qui, forniamo un approccio di doppia bioluminescenza non invasivo inoculando cellule che esprimono GFP e luciferasi nel cuscinetto di grasso mammario. Utilizzando questo potente strumento, lo sviluppo del tumore e le metastasi possono essere monitorati nei topi in tempo reale14. Tuttavia, questa tecnica contiene alcuni passaggi critici, che richiedono maggiore cautela. Ad esempio, uno dei passaggi critici per il successo di questo esperimento è verificare l'efficienza dell'infezione monitorando i livelli di espressione di luciferasi e GFP nelle cellule prima dell'iniezione del topo. Pertanto, i dosaggi di blastidina15 e il protocollo di produzione lentivirale16 dovrebbero essere ottimizzati per ogni linea cellulare per aumentare l'efficienza sperimentale.
Alcuni problemi tecnici possono influenzare il segnale di bioluminescenza nell'esperimento in vivo . Questi problemi includono il movimento del topo durante la lettura della bioluminescenza, che può interferire con la qualità dell'immagine e quindi influenzare le curve cinetiche del tumore. Pertanto, gli animali devono essere completamente anestetizzati dopo l'iniezione del substrato e durante l'intera procedura. Inoltre, posizionare più animali nella macchina contemporaneamente può portare a incoerenza nella lettura della luminescenza poiché i topi con un segnale elevato possono mascherare quelli di minore intensità. Pertanto, le letture di luminescenza devono essere prese singolarmente per ciascun mouse.
Quando si esegue la lettura della bioluminescenza in vitro , è fondamentale sostituire il terreno di coltura con PBS, poiché il mezzo contiene siero e altri integratori che possono interferire con il segnale. Inoltre, è necessario eliminare la lettura in background misurando il segnale di luminescenza di un campione che contiene solo PBS (senza celle).
Questo protocollo descrive una tecnica non invasiva per misurare la crescita delle cellule del cancro al seno e le metastasi. In particolare, questo documento descrive l'iniezione di linee cellulari di cancro al seno, esprimendo sia GFP che luciferasi nel cuscinetto di grasso mammario del topo. Questa combinazione fornisce un metodo rapido e affidabile per misurare la colonizzazione metastatica in vivo ed ex vivo.
Nonostante i chiari vantaggi di questo metodo, ha alcune limitazioni. Il vincolo primario è la necessità di una macchina a bioluminescenza, in quanto si tratta di una macchina relativamente costosa e quindi non sempre disponibile. Inoltre, ogni lettura richiede molto tempo e quindi la macchina può essere in overbooking e non disponibile. Un'altra limitazione si riferisce al protocollo stesso. Per rilevare il segnale di bioluminescenza nei campioni ex vivo , si raccomanda di eutanasizzare i topi ed esaminare immediatamente il campione. Questo passaggio è una fase che limita il tempo e non è fattibile per una vasta serie di esperimenti.
In conclusione, questo strumento di bioluminescenza non invasivo è altamente sensibile al rilevamento dello sviluppo tumorale e delle metastasi nei topi. Questo protocollo non è limitato al cancro al seno e potrebbe essere applicato ad altri carcinomi come il cancro del polmone e del pancreas. Inoltre, poiché non è invasivo, può essere applicato per misurare l'efficacia dei farmaci antitumorali12 e i loro effetti sulla cinetica di crescita tumorale in tempo reale.
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Disclosures
Tutti gli autori hanno rivelato di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del laboratorio Y.D.S. Vorremmo ringraziare il Wohl Institute for Translational Medicine presso l'Hadassah Medical Center, Gerusalemme, per aver fornito la struttura di imaging per piccoli animali. Questo studio è stato supportato dal Research Career Development Award dell'Israel Cancer Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P.
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M.
- Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
