Summary
כאן אנו מתארים שיטת ניטור לא פולשנית הכוללת לוציפראז וביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בקווים שונים של תאי סרטן השד. פרוטוקול זה מספק טכניקה לניטור היווצרות גידולים והתיישבות גרורתית בזמן אמת בעכברים.
Abstract
סרטן השד הוא ממאירות הטרוגנית תכופה והגורם השני המוביל לתמותה אצל נשים, בעיקר עקב גרורות איברים מרוחקות. מספר מודלים של בעלי חיים נוצרו, כולל מודלים של עכברים אורתוטופיים הנמצאים בשימוש נרחב, שבהם מוזרקים תאים סרטניים לתוך כרית השומן של החלב. עם זאת, מודלים אלה אינם יכולים לסייע במעקב אחר קינטיקה של גדילת גידולים והתיישבות גרורתית. כלים חדשניים לניטור תאים סרטניים בזמן אמת בעכברים יקדמו באופן משמעותי את ההבנה של הביולוגיה של הגידול.
כאן נוצרו קווי תאי סרטן השד המבטאים ביציבות לוציפראז וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). באופן ספציפי, טכניקה זו מכילה שני שלבים רציפים היזומים על ידי מדידת פעילות הלוציפראז במבחנה ולאחר מכן השתלת התאים הסרטניים לתוך כריות שומן יונקים של עכברי כשל חיסוני משולב (NOD-SCID) שאינם סוכרתיים חמורים. לאחר ההזרקה, הן צמיחת הגידול והן ההתיישבות הגרורתית מנוטרות בזמן אמת על ידי מערכת ההדמיה הביו-לומינסנציה הלא פולשנית. לאחר מכן, הכימות של גרורות המבטאות GFP בריאות ייבדק על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאמת את תוצאות הביולומינסנציה שנצפו. מערכת מתוחכמת זו המשלבת לוציפראז וכלי גילוי מבוססי פלואורסצנציה מעריכה גרורות סרטניות in vivo, שיש לה פוטנציאל גדול לשימוש בטיפולים בסרטן השד ובניהול מחלות.
Introduction
סרטן השד הוא סוגים שכיחים של סרטן ברחבי העולם, עם כ -250,000 מקרים חדשים מאובחנים מדי שנה בארצות הברית1. למרות ההיארעות הגבוהה שלה, קבוצה חדשה של תרופות נגד סרטן שיפרה באופן משמעותי את התוצאות של חולות סרטן השד2. עם זאת, טיפולים אלה עדיין אינם מספיקים, שכן חולים רבים חווים הישנות מחלות והתפשטות גרורתית לאיברים חיוניים2, שהיא הגורם העיקרי לתחלואה ולתמותה של המטופלים. לכן, אחד האתגרים המרכזיים בחקר סרטן השד הוא זיהוי המנגנונים המולקולריים המווסתים את היווצרותן של גרורות דיסטליות כדי לפתח אמצעים חדשים לעיכוב התפתחותן.
גרורות סרטניות הן תהליך דינמי שבו תאים מתנתקים מהגידול הראשוני ופולשים לרקמות שכנות דרך זרימת הדם. לפיכך, מודלים של בעלי חיים שבהם התאים עוברים מפל גרורתי דומה יכולים להקל על זיהוי המנגנונים השולטים בתהליך זה 3,4. בנוסף, מודלים אלה של in vivo חיוניים לפיתוח חומרים טיפוליים לסרטן השד 5,6. עם זאת, מודלים אורתוטופיים אלה אינם יכולים להצביע על קינטיקה של גדילת הגידול בפועל מכיוון שההשפעה נקבעת רק עם סיום הלימודים. לכן, הקמנו כלי מבוסס לוציפראז כדי לזהות התפתחות גידולים והתיישבות גרורתית בזמן אמת. בנוסף, תאים אלה מבטאים GFP כדי לזהות את המושבות הגרורות. גישה זו היא פשוטה יחסית ואינה כרוכה בהליכים פולשניים3. לפיכך, שילוב של לוציפראז וזיהוי פלואורסצנציה הוא אסטרטגיה מועילה לקידום המחקרים הפרה-קליניים של טיפולים בסרטן השד וניהול מחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בעכברים בוצעו במסגרת הפרוטוקול המוסדי לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה העברית MD-21-16429-5. בנוסף, האוניברסיטה העברית מוסמכת על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AAALAC).
1. תחזוקת קו סלולרי
הערה: קווי תאי סרטן השד האנושיים (MCF-7, MDA-MB-468 ו- MDA-MB-231) שימשו בפרוטוקול זה.
- תרבית את כל קווי תאי סרטן השד במדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM), בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו-חמצני לחה (5% CO2).
הערה: בדוק את צפיפות התא באופן קבוע; להתפצל ולהתרחב לשימוש עתידי כאשר הם מגיעים למפגש של 70%.
2. הכנת וירוסים
- טפלו בתאי HEK293T עם 1 מ"ל של טריפסין עד שהם מתנתקים.
- הוסף 10 מ"ל של DMEM (10% FBS) כדי לנטרל את פעילות הטריפסין, ולהעביר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 150 × גרם במשך 5 דקות כדי לשקוע את התאים. יש להשליך את ה-supernatant לאחר הצנטריפוגה ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום DMEM טרי.
- קבעו את ריכוז התאים והזרעים 1.2 × 106 תאים/באר בצלחת של שש בארות.
- ביום שלמחרת, יש לחמם מראש את כל הריאגנטים הדרושים, כולל מגיב טרנספקציה, DMEM ללא סרום, פלסמיד מעטפת (VSV-G), פלסמיד אריזת לנטי-וירוס (ΔVPR) ופלסמיד פיצוץ pLX304 לוציפראז-V5 או פלסמיד פיצוץ FUW GFP.
- בצינור צנטריפוגה אוטוקלאב של 1.5 מ"ל, יש לערבב 50 μL של DMEM ללא סרום עם 0.3 מיקרוגרם של פלסמיד VSV-G, 1 מיקרוגרם של ΔVPR ו-1.2 מיקרוגרם של פלסמיד פיצוץ pLX304 לוציפראז-V5 או פלסמיד FUW GFP.
- לאחר ערבוב יסודי של פלסמידים אלה עם המדיום, מוסיפים 5 μL של מגיב הטרנספקציה, מערבבים בעדינות, ומדגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- לאחר הדגירה, מוסיפים את התערובת באופן טיפתי לתאי HEK293T.
- לאחר 24 שעות, החלף את מדיום הצמיחה ב-2 מ"ל של (30% FBS) DMEM. למחרת (48 שעות לאחר הטרנספקציה), לקצור את המדיום המכיל את הנגיפים ("pLX304 לוציפראז-V5 או וירוסי FUW GFP").
הערה: השימוש ב-30% FBS משפר את יעילות ייצור הנגיף. - כדי להימנע משאריות תאי HEK293T, העבירו את המדיום המכיל את הנגיף דרך מסנן או צנטריפוגה של מזרק 0.45 מיקרומטר ב-150 × גרם למשך 5 דקות, ואספו את ה-supernatant.
הערה: לאחסון לטווח ארוך, שמור את המזונות העובדים של הנגיף בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
3. יצירת תאים המבטאים ביציבות GFP ולוציפראז ("תאי GFP + Luc+ ")
- יום לפני ההדבקה של התאים, זרע 8 × 105 תאים לבאר בצלחת של שש בארות.
- לאחר דגירה לילית, החליפו את מדיום הגדילה במדיום טרי המכיל 8 מיקרוגרם/מ"ל של פוליברן. הוסף 200 μL של וירוסי FUW GFP באופן טיפתי לתאים.
- אופציונלי: כדי לשפר את יעילות הנגיף, צנטריפוגה על הצלחת ב-560 × גרם למשך 30 דקות (37 מעלות צלזיוס) (זיהום ספין).
- דגירה של התאים למשך 48 שעות, ואמת את ביטוי ה-GFP על-ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מיין את התאים המבטאים GFP על-ידי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה (FACS) (GFP+) (איור 1A).
- הדביקו את התאים הממוינים ב-GFP בנגיפי הפיצוץ pLX304 Luciferase-V5 כמתואר בשלב 3.2.
- טפלו בתאים עם בלסטיקידין (10 מיקרוגרם/מ"ל) 30 שעות לאחר ההדבקה כדי להעשיר עבור תאים מבטאי פיצוץ pLX304 לוציפראז-V5 (GFP+, תאי Luc+ ). לאחר מכן, כל יומיים, החליפו עם מדיום טרי המכיל בלסטיקידין. בנוסף, כבקרה, טפלו בתאים נאיביים עם אותו מדיום המכיל בלסטיקידין.
הערה: יש להבחין בהבדל ברור בין תאי הביקורת הנגועים לתאי הביקורת לאחר מספר ימים של טיפול בבלסטיקידין. השפעה זו תלוית קו תאים ונמשכת בדרך כלל כ-8-10 ימים. שיעור הישרדות ירוד יצביע על תפוקת ייצור נגיפית נמוכה. אם כן, לייצר קבוצה חדשה של וירוסים מכיוון שיעילות נמוכה עשויה להשפיע על ניסויים עתידיים.
4. אימות פעילות במבחנה לוציפראז
- הגדל את תאי MCF-7, MDA-MB-468 ו-MDA-MB-231 GFP+ Luc+ בצלחת של 15 ס"מ עד 80% מפגש. קציר את התאים על ידי טריפסיניזציה, כמתואר בשלבים 2.1-2.2.
- זרעו מספר גדל והולך של תאים בכל באר (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 104) לתוך צלחת שחורה של 96 בארות.
הערה: לוחות שחורים בני 96 בארות מתאימים יותר למדידת רמות לוציפראז מכיוון שלוחות לבנים או שקופים ייצרו אותות אוטולומינסנציה. כבקרה, השתמשו במלחים עם מאגר פוספט (PBS) בלבד בבאר אחת כדי להבטיח שאין אוטולומינסנציה מ-PBS. - מלאו את כל הבארות ב-100 μL של DMEM ודגרו במשך 16-24 שעות.
- הכינו תמיסת לוציפרין ב-PBS בריכוז של 1.5 מ"ג/מ"ל מהמלאי של 30 מ"ג/מ"ל. Aliquot את המלאי של תמיסת לוציפרין ולאחסן ב -20 °C (76 °F).
- לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS בעדינות, להוסיף 100 μL של תמיסת לוציפרין לתוך כל באר, ולחכות 2 דקות. לבסוף, מדוד את פעילות הלוציפראז בכל תאי סרטן השד באמצעות ביולומינסנציה.
הערה: בחינת GFP במבחנה וביטוי לוציפראז לפני ניסויים בבעלי חיים היא חיונית. בנוסף, בארות ריקות משמשות לחיסור הרקע.
5. הזרקת עכברים עם תאי GFP+ Luc+
- העברה של 5 × 106 (MCF-7 ו- MDA-MB-468) או 2 × 106 (MDA-MB-231) תאי GFP+ Luc+ לתוך 200 μL או 100 μL PBS, בהתאמה.
- לפני ההזרקה, נקו את מכסה המנוע הביולוגי הסטרילי עם תמיסת חיטוי של 5% (ראו טבלת החומרים). לאחר מכן, הרימו את העכברים עם אוויר מסונן (0.2 מיקרומטר) המכיל 4% איזופלורן בקצב זרימת אוויר של 1 ליטר לדקה למשך 2-3 דקות.
הערה: חיוני לאשר הרדמה נכונה; צבוט את בוהן העכבר וחפש כל תגובה. - הניחו חרוט על ראש העכבר המרומם בתנוחת שכיבה. יש למרוח משחה וטרינרית על עיניה כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
- נגבו את אזור הבטן של העכבר, מעל בלוטת החלב, עם אתנול באמצעות צמר גפן והרימו את בלוטת החלבהרביעית עם מלקחיים.
- הכנס את המחט 27 G x 3/4 (0.4 x 19 מ"מ) מתחת למשטח השומן והזריק לאט 100 μL של מתלה התא.
הערה: בליטה עגולה תופיע מתחת לעור. בנוסף, זריקה לא נכונה עלולה להוביל לסטייה בקצב הגדילה של הגידול או להיעדר גידול באותה קבוצת ניסוי. - לאחר הליך ההזרקה, מוציאים את העכברים ממכסה המנוע ומעבירים אותם לכלוב חדש. עקוב אחר העכברים עד שהם חוזרים להכרה.
הערה: ודא שכל המחטים והמזרקים המשומשים מושלכים לתיבת החדות.
6. מדידת רמות הלוציפראז בעכברי GFP+ Luc+
- לפני זיהוי הביו-לומינסנציה, לרסן את העכבר המודע על ידי החזקת צווארו ביד שמאל. לאחר מכן, הטה את היד שמאלה, וכתוצאה מכך פני העכבר כלפי מעלה עם פלג הגוף התחתון בתנוחת שכיבה.
- הזריקו 100 μL של לוציפרין (30 מ"ג/מ"ל) באופן תוך-צפקי (כלומר) למשטח הבטן של העכבר ברביע הבטן השמאלי התחתון באמצעות מזרק 1.0 מ"ל עם גודל מחט 27 G x 3/4 (0.4 x 19 מ"מ).
הערה: אין להחדיר את קצה המחט יותר מ-3-5 מ"מ מדופן הבטן, שכן היא עלולה לחדור לאיברים הקרביים. בנוסף, מומלץ לבצע הזרקת i.p. ללא הרדמה שכן התפלגות לוציפרין בגוף של עכברים מורדמים איטית יותר מאשר בעכברים מודעים. לפיכך, ניטור רמות לוציפראז בעכברים מודעים הוא הליך מהיר יותר. - שמור את העכבר במשך 7 דקות ללא הרדמה ואחריו 3 דקות בתוך תא ההרדמה לפני מדידת הקינטיקה של הגידול.
הערה: זמן הדגירה משתנה בין הניסויים השונים, קווי התאים ומינים למינים. לכן, מומלץ לכייל את זמן הדגירה לפני תחילת הניסויים. - הרדמה את העכברים כמתואר בשלבים 5.2-5.3.
- פתח את התוכנה (טבלת חומרים) במהלך הדגירה, אתחל את מערכת ההדמיה ולחץ על לחצן אתחול .
הערה: שים לב שהמצלמה תיקח ~ 10 דקות להתקרר ולהגיע ל - 90 מעלות צלזיוס. בנוסף, כבקרת רקע, מדוד את רמות הלוציפראז בעכברים נאיביים (כלומר, עכברי GFP+ שהוזרקו להם תאים שאינם מבטאים את הגן לוציפראז). - שמור על ההגדרה בחשיפה אוטומטית באמצעות ההגדרות הבאות: זמן חשיפה אוטומטי, 60 שניות; בנינג מדיום, F/תחנה 1; מסנן עירור חסום; מסנן פליטה פתוח. כאשר האתחול מסתיים, בחר אשף ההדמיה | Bioluminescence ולאחר מכן לחץ על הבא | פתח את | המסנן בחר עכבר בנושא התמונה.
- בתצוגת שדה, בחר שלב C (10 ס"מ) וגובה נושא: 1.50 ס"מ.
- לחץ על שלב הגדרת התמונה ל - C, ולפני לחיצה על לחצן רכישה , ודא שהעכבר ממוקם על הבמה במצב שכיבה תקין.
- סגור את הדלת, לחץ על לחצן רכוש והמתן עד שתופיע תמונה על המסך.
הערה: עם אפשרות החשיפה האוטומטית , אות חזק לוקח 5-20 שניות בהתאם לאות; אות חלש ייקח בערך 60 שניות. - חזור על שלב זה עבור העכברים האחרים.
- כדי לזהות גרורות בריאות, יש לכסות את האות החזק של הגידול הראשוני באמצעות נייר קרטון שחור עבה ולחשוף רק את הצד הגחוני של הריאות לכיוון המצלמה. צלם את התמונה באמצעות אותם פרמטרים שתוארו לעיל.
7. רכישת תמונת ex vivo באמצעות ביולומינסנציה ופלואורסצנציה
- המתים את העכברים באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני (CO2) במייבש הייבוש ונתחו את העכברים באמצעות מספריים ומלקחיים אוטו-קלוביים.
- מחדירים את העכברים באמצעות 0.9% מלח, קוצרים את האיברים ושוטפים עם 1x PBS כדי למנוע כתמי דם מהאיבר.
- מעבירים את האיבר השטופ לצלחת פטרי ומכניסים אותו לשלב של מכונת הביולומינסנציה. החל את אותה הגדרת ביולומינסנציה כמתואר בשלבים 6.2-6.6.
הערה: בשל הירידה באות לוציפראז, שלב זה מגביל את הזמן. לכן, לאחר המתת עכברים, מיד לדמיין את האיבר על ידי bioluminescence. - עבור תמונות GFP, החל את אותה הגדרה כמתואר בשלב 6.3, באמצעות מסנן GFP פלואורסצנטי במקום Bioluminescence.
- צלם תמונות ריאה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו כדי לבחון את נוכחותן של מושבות GFP+ .
8. ניתוח נתוני ביולומינסנציה
- לחץ פעמיים על התוכנה ובחר פתח מתפריט קובץ .
- פתח את כל הקבצים ומזער אותם. ודא שכל היחידות הן זוהר (פוטונים). בנוסף, לחץ על החל על הכל כדי לשמור על אותם פרמטרים עבור כל התמונות.
- מתפריט תצוגה , בחר את לוח הכלים, אשר יפתח חלון חדש.
- מחלון לוח הכלים , בחר את הכרטיסיה כלי ROI ובסוג, בחר את ההחזר על ההשקעה הממוצעת של BKG.
- מתוך כלי ההחזר על ההשקעה, בחר עיגול וצייר עיגול קטן על אזור בית החזה של העכבר.
- לחץ פעמיים על העיגול, בחר באפשרות השתמש כ- BKG עבור ROIs עתידיים מהכרטיסיה החזר על ההשקעה ברקע ולחץ על סיום.
9. מדידת השטף הכולל
- מהחלון לוח כלים , בחר את הכרטיסיה כלי ROI וב - Type, בחר את מדידת ההחזר על ההשקעה.
- מתוך כלי ההחזר על ההשקעה, בחר עיגול וצייר עיגול גדול על הגידול הראשוני של העכבר.
- לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני העתק ROI ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הדבקת החזר ההשקעה בכל קובץ בודד של כל עכבר.
- לחץ על מדידת ROIs מהכרטיסייה ROI Tools, אשר תפתח חלון חדש בשם ROI Measurements. מכרטיסיה זו, שמור את סוגי המדידות כ-Radiance (פוטונים) ואת תכונות התמונה ככול הערכים המאוכלסים.
- ייצא את הקובץ כתבנית קובץ מדידות (*.txt) או Csv (*.csv).
- פתח את הנתונים המיוצאים בגיליון אלקטרוני וקח את ה - Total Flux (p/s) ואת הערכים במשך השבועות.
הערה: ניתן להשתמש בשלב זה למדידת קבוצות שונות. לדוגמה, עכברים שטופלו ברכב לעומת אלה שטופלו בתרופה. - צור עלילת XY, שבה הזמן מוצג לאורך ציר ה-X והשטף הכולל (p/s) לאורך ציר ה-Y. עבור כל שבוע, קח את הפרמטר Total Flux (p/s) עבור כל קבוצת מדגם וקבע את כל ההבדלים המשמעותיים באמצעות מבחן ה- t של התלמיד שאינו פרמטרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יצרנו קווי תאים של סרטן השד (MDA-MB-231, MCF-7 ו-MDA-MB-468) המבטאים וקטורים של GFP ולוציפראז. באופן ספציפי, זה הושג על ידי זיהום רציף. ראשית, קווי תאי סרטן השד היו נגועים בווקטור לנטי-וירוס המבטא GFP פלואורסצנטי. התאים החיוביים ל-GFP (GFP+) מוינו יומיים לאחר ההדבקה (איור 1A,B) ונדבקו בווקטור pLX304 לוציפראז-V5. לאחר מכן, בלסטיקידין שימש לבחירת לוציפראז כדי ליצור את התאים המצוינים (GFP+, Luc+). כדי לאמת את פעילות לוציפראז במבחנה, הדגמנו עלייה תלוית מספר תאים ברמות הפעילות של לוציפראז (איור 1C). בנוסף, נמצא מתאם ליניארי בין פעילות הלוציפראז לבין מספר התא (איור 1D).
כדי לאשר את זיהוי הלוציפראז בעכברים, כל שלושת קווי תאי סרטן השד של GFP+, Luc+ הוזרקו לתוך כרית השומן החלבית של נקבת עכברי NOD/SCID. לאחר מכן, העכברים היו נתונים לקריאת ביולומינסנציה כל שבועיים כדי לקבוע את קינטיקה של צמיחת הגידול. מצאנו שקינטיקה של גדילת גידול משתנה בין קווי התאים; הוא מהיר יותר ב-MDA-MB-231 האגרסיבי יותר ואיטי יותר בקווי התאים הפחות אגרסיביים MCF-7 ו-MDA-MB-468 (איור 2).
לאחר מכן, התקבלו קריאות פלואורסצנטיות של הגידולים המבודדים שנוצרו על ידי קו התאים MDA-MB-231. באופן ספציפי, 6 שבועות לאחר ההזרקה, הגידולים נקטפו מהעכברים כדי לאשר את הפלואורסצנציה של GFP; הגידולים נמצאו כמשמרים על ביטוי ה-GFP שלהם (איור 3A). המטרה הבאה הייתה לקבוע אם ניתן להעריך את היווצרות המושבה הגררתית בזמן אמת בריאה של עכבר חי באמצעות מכונת הביו-לומינסנציה; קריאות ביולומינסנציה חיוביות התקבלו מהריאה של העכבר כולו (איור 3B). כדי לוודא שמדובר במושבות גרורתיות חיוביות, הריאה נקטפה, והמושבות הגרורות נצפו עבור GFP וביו-לומינסנציה (איור 3C).
איור 1: אימות של ביטוי GFP ופעילות לוציפראז בתאים. תמונות מייצגות של תאים MDA-MB-231 שאינם GFP ו-GFP+. (B) תאי MDA-MB-231, MCF-7 ו-MDA-MB-468 נדבקו בנגיף המבטא GFP, ולאחר מכן במיון FACS. תמונה של כל קו תא מיוצגת בשדה בהיר (משמאל) וב-GFP (מימין). התאים נלכדו תחת מיקרוסקופ Nikon Eclipse 80i בהגדלה של פי 10. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) הביולומינסנציה עקב פעילות לוציפראז בכל תא נקבעה על ידי לומינומטר. מספר גדל והולך של תאים (כמו ב-A) נזרעו בצלחת שחורה של 96 בארות. סרגל הצבעים מייצג את עוצמת הלומינסנציה. (D) תרשים XY המדגים את פעילות הלוציפראז של תאי מד"א-MB-231 (כפי שנמדד ב-C). קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; SSC-A = שטח של פסגה מפוזרת בצד; GFP+ = GFP-חיובי; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הקינטיקה של גדילת הגידול נקבעה על ידי מכונת הביולומינסנציה. קינטיקה של גדילת גידול In vivo נקבעה מדי שבוע בעכברי NOD-SCID, והתמונות המייצגות צולמו באמצעות ביולומינסנציה עבור (A) MDA-MB-231, (B) MCF-7, (C) MDA-MB-468. סרגל הצבעים מייצג את עוצמת הלומינסנציה. (ד) כימות פעילות הזוהר מוצג כשטף מוחלט. (E) עכברי מד"א-MB-231; קריאה פרטנית המיוצגת כעלילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: גישות שונות לאימות היווצרות גידולים וגרורות ריאה. (A) העכברים נקברו, והגידולים שנוצרו מתאי מד"א-MB-231 נקטפו. רמות ה-GFP בגידולים נמדדו על ידי מכונת הביולומינסנציה. (B) גרורות ריאה בעכברים כולם, כפי שעולה מהביולומינסנציה. (C) כדי לאשר את נוכחותן של גרורות, הריאות נקטפו ונצפו תחת SMZ18 Nikon Stereomicroscope (שדה בהיר ו- GFP). דגימות ביולומינסנט-לוק נלקחו מיד לאחר המתת העכברים. סרגל הצבעים מייצג את עוצמת הלומינסנציה. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; לוק = לוציפראז; BLI = הדמיית ביולומינסנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניסויים בבעלי חיים הם חובה לחקר הסרטן 7,8,9, ואכן פותחו פרוטוקולים רבים 3,6,10,11,12,13,14. עם זאת, רוב המחקרים הללו קבעו את ההשפעה הביולוגית רק בסוף הניסויים, ולכן ההשפעה על קינטיקה של גדילת גידולים או על התיישבות גרורות עדיין לא נקבעה. כאן, אנו מספקים גישה ביולומינסנציה כפולה לא פולשנית על ידי חיסון תאים המבטאים GFP ולוציפראז לתוך כרית השומן של החלב. באמצעות כלי רב עוצמה זה, ניתן לעקוב אחר התפתחות הגידול וגרורות בעכברים בזמן אמת14. עם זאת, טכניקה זו מכילה כמה צעדים קריטיים, הדורשים זהירות יתרה. לדוגמה, אחד השלבים הקריטיים להצלחת הניסוי הזה הוא לאמת את יעילות הזיהום על ידי ניטור רמות הביטוי של לוציפראז ו-GFP בתאים לפני הזרקת העכבר. לפיכך, יש להתאים את מינוני הבלסטיצידין15 ואת פרוטוקול הייצורה-16 של lentiviral עבור כל קו תאים כדי להגביר את היעילות הניסויית.
כמה בעיות טכניות עשויות להשפיע על אות הביו-לומינסנציה בניסוי in vivo . בעיות אלה כוללות את תנועת העכבר במהלך הקריאה הביו-לומינסנציה, מה שעלול להפריע לאיכות התמונה ובכך להשפיע על העקומות הקינטיות של הגידול. לפיכך, בעלי החיים חייבים להיות מורדמים לחלוטין לאחר הזרקת המצע ובמהלך ההליך כולו. בנוסף, הצבת מספר בעלי חיים במכונה בו-זמנית עלולה להוביל לחוסר עקביות בקריאת הזוהר, שכן עכברים עם אות גבוה יכולים להסוות את אלה בעוצמה נמוכה יותר. לכן, יש לקחת את קריאות הזוהר בנפרד עבור כל עכבר.
בעת ביצוע קריאת bioluminescence במבחנה , חיוני להחליף את מדיום התרבית ב- PBS, שכן המדיום מכיל סרום ותוספי מזון אחרים שעלולים להפריע לאות. בנוסף, יש צורך לבטל את קריאת הרקע על ידי מדידת אות הלומינסנציה של דגימה המכילה רק PBS (ללא תאים).
פרוטוקול זה מתאר טכניקה לא פולשנית למדידת גדילת תאי שד וגרורות. באופן ספציפי, מאמר זה מתאר את ההזרקה של קווי תאים של סרטן השד, המבטאים הן GFP והן לוציפראז לתוך כרית השומן של החלב של העכבר. שילוב זה מספק שיטה מהירה ואמינה למדידת התיישבות גרורתית in vivo ו - ex vivo.
למרות היתרונות הברורים של שיטה זו, יש לה כמה מגבלות. האילוץ העיקרי הוא הצורך במכונת ביולומינסנציה, שכן מדובר במכונה יקרה יחסית ולכן לא תמיד זמינה. בנוסף, כל קריאה גוזלת זמן רב, ולכן ניתן להזמין את המכונה יתר על המידה ולא להיות זמינה. מגבלה נוספת מתייחסת לפרוטוקול עצמו. כדי לזהות את אות הביולומינסנציה בדגימות ה-ex vivo , מומלץ להרדים את העכברים ולבחון את הדגימה באופן מיידי. שלב זה הוא שלב מגביל זמן ואינו אפשרי עבור קבוצה גדולה של ניסויים.
לסיכום, כלי ביולומינסנציה לא פולשני זה רגיש מאוד לגילוי התפתחות גידולים וגרורות בעכברים. פרוטוקול זה אינו מוגבל לסרטן השד וניתן ליישם אותו על קרצינומות אחרות כגון סרטן הריאות והלבלב. יתר על כן, מכיוון שהוא אינו פולשני, ניתן ליישם אותו כדי למדוד את היעילות של תרופות נגד סרטן12 ואת השפעתן על קינטיקה של צמיחת גידולים בזמן אמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים חשפו כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לחברי מעבדת Y.D.S. ברצוננו להודות למכון וואהל לרפואה תרגומית במרכז הרפואי הדסה בירושלים על אספקת המתקן להדמיית בעלי חיים קטנים. מחקר זה נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה מחקרית מטעם הקרן לחקר הסרטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P.
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M.
- Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
