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Biology

कोएंजाइम क्यू अतिरिक्त की सेटिंग में माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण पोर की खुली संभावना का आकलन

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63646
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

Summary

यह विधि वाइल्डटाइप नियंत्रण की तुलना में कार्डियोमायोसाइट्स माइटोकॉन्ड्रियल कोएंजाइम क्यू सामग्री में वृद्धि के साथ नवजात नाजुक एक्स सिंड्रोम चूहों में ताकना खोलने के लिए वोल्टेज थ्रेशोल्ड निर्धारित करने के लिए कम-चालकता प्रोटॉन रिसाव के लिए माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्र के योगदान का शोषण करती है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्र (एमपीटीपी) एक वोल्टेज-गेटेड, गैर-चयनात्मक, आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आईएमएम) मेगा-चैनल है जो स्वास्थ्य और बीमारी में महत्वपूर्ण है। एमपीटीपी कम चालकता खोलने के दौरान आईएमएम में प्रोटॉन के रिसाव की मध्यस्थता करता है और विशेष रूप से साइक्लोस्पोरिन ए (सीएसए) द्वारा बाधित होता है। कोएंजाइम क्यू (सीओक्यू) एमपीटीपी का एक नियामक है, और कोक्यू सामग्री में ऊतक-विशिष्ट अंतर पाए गए हैं और नाजुक एक्स सिंड्रोम (एफएक्सएस, एफएमआर 1 नॉकआउट) के नवजात माउस मॉडल में फोरब्रेन और हृदय माइटोकॉन्ड्रिया में एमपीटीपी की खुली संभावना है। हमने इस उत्परिवर्ती तनाव में एमपीटीपी खोलने के लिए वोल्टेज थ्रेशोल्ड निर्धारित करने के लिए एक तकनीक विकसित की, जो प्रोटॉन रिसाव चैनल के रूप में एमपीटीपी की भूमिका का शोषण करती है।

ऐसा करने के लिए, ऑक्सीजन की खपत और झिल्ली क्षमता (Π) को रिसाव श्वसन के दौरान पोलरोग्राफी और टेट्राफेनिलफॉस्फोनियम (टीपीपी +) आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड का उपयोग करके पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में एक साथ मापा गया था। एमपीटीपी खोलने के लिए दहलीज विशिष्ट झिल्ली क्षमता पर प्रोटॉन रिसाव के सीएसए-मध्यस्थता निषेध की शुरुआत से निर्धारित की गई थी। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, एमपीटीपी के वोल्टेज गेटिंग में अंतर को सीओक्यू अतिरिक्त के संदर्भ में ठीक से परिभाषित किया गया था। यह उपन्यास तकनीक एमपीटीपी के कम चालकता उद्घाटन के शारीरिक और रोग संबंधी विनियमन की समझ को बढ़ाने के लिए भविष्य की जांच की अनुमति देगी।

Introduction

एमपीटीपी पारगम्यता संक्रमण (पीटी) की मध्यस्थता करता है, जिससे आईएमएम छोटे अणुओं के लिए अचानक पारगम्य हो जाता है और 1,2 को विलेय करता है। यह हड़ताली घटना आईएमएम की विशेषता अपारगम्यता से एक अलग प्रस्थान है, जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन3 के लिए आवश्यक इलेक्ट्रोकेमिकल ढाल स्थापित करने के लिए मौलिक है। पीटी, अन्य माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन तंत्र के विपरीत, एक उच्च-चालकता, निरर्थक और गैर-चयनात्मक प्रक्रिया है, जो 1.5 केडीए 4,5 तक अणुओं की एक श्रृंखला के पारित होने की अनुमति देता है। एमपीटीपी आईएमएम के भीतर एक वोल्टेज-गेटेड चैनल है जिसका उद्घाटन Π, एटीपी उत्पादन, कैल्शियम होमियोस्टेसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन और सेल व्यवहार्यता4 को बदल देता है।

वैकृत चरम पर, एमपीटीपी के अनियंत्रित और लंबे समय तक उच्च चालकता उद्घाटन इलेक्ट्रोकेमिकल ढाल, मैट्रिक्स सूजन, मैट्रिक्स पाइरिडिन न्यूक्लियोटाइड्स की कमी, बाहरी झिल्ली टूटना, इंटरमेम्ब्रेन प्रोटीन (साइटोक्रोम सी सहित) की रिहाई, और अंततः, सेल मृत्यु 4,6 के पतन की ओर जाता है। इस तरह के पैथोलॉजिकल एमपीटीपी उद्घाटन को कार्डियक इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट, दिल की विफलता, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट, विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों और मधुमेह 1,7 में फंसाया गया है। हालांकि, कम चालकता एमपीटीपी उद्घाटन प्रकृति में शारीरिक है और, उच्च-चालकता खोलने के विपरीत, गहरा विध्रुवण या माइटोकॉन्ड्रियल सूजन4 का कारण नहीं बनता है।

छिद्र का कम चालकता उद्घाटन पारगम्यता को ~ 300 डीए तक सीमित करता है, एटीपी संश्लेषण से स्वतंत्र प्रोटॉन के पारित होने की अनुमति देता है, और शारीरिक प्रोटॉन रिसाव5 का एक संभावित स्रोत है। फिजियोलॉजिकल एमपीटीपी खोलने से Π में नियंत्रित गिरावट आती है, श्वसन परिवहन श्रृंखला के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह बढ़ता है, और इसके परिणामस्वरूप सुपरऑक्साइड का एक छोटा विस्फोट या फ्लैश होता है, जो आरओएस सिग्नलिंग 8 में योगदान देताहै। इस तरह के क्षणिक एमपीटीपी खोलने का विनियमन कैल्शियम होमियोस्टेसिस और सामान्य सेलुलर विकास और परिपक्वता 4,9,10,11 के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, विकासशील न्यूरॉन्स में क्षणिक छिद्र खोलने से भेदभाव होता है, जबकि एमपीटीपी के बंद होने से अपरिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स 4,5 में परिपक्वता होती है।

यद्यपि स्वास्थ्य और बीमारी में एमपीटीपी का कार्यात्मक महत्व अच्छी तरह से स्थापित है, इसकी सटीक आणविक पहचान पर बहस बनी हुई है। एमपीटीपी की आणविक संरचना और कार्य पर प्रगति की व्यापक रूप से कहीं और12 समीक्षा की गई है। संक्षेप में, वर्तमान में, एमपीटीपी के उच्च और निम्न-चालकता राज्यों को अलग-अलग संस्थाओं12 द्वारा मध्यस्थता करने की परिकल्पना की गई है। एफ 0 एटीपी सिंथेस (एटीपी सिंथेस) और एडेनिन न्यूक्लियोटाइड ट्रांसपोर्टर (एएनटी) क्रमशः उच्च और निम्न-चालकता मोड के लिए हैं।

एमपीटीपी के छिद्र बनाने वाले घटक की सटीक पहचान के बारे में आम सहमति की कमी के बावजूद, कुछ प्रमुख विशेषताओं को विस्तृत किया गया है। एमपीटीपी की एक अच्छी तरह से स्थापित विशेषता यह है कि इसे इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट द्वारा विनियमित किया जाता है जैसे कि आईएमएम के विध्रुवण से छिद्र खुलने की ओर जाता है13। पहले के काम से पता चला है कि विसिनल थिओल समूहों की रेडॉक्स स्थिति एमपीटीपी के वोल्टेज गेटिंग को बदल देती है, जैसे कि ऑक्सीकरण अपेक्षाकृत उच्च ππs पर छिद्र खोलता है, और थिओल समूह में कमी के परिणामस्वरूप बंद एमपीटीपी संभावना14 होती है। हालांकि, प्रोटीनमय वोल्टेज सेंसर की पहचान अज्ञात है।

विभिन्न छोटे अणु जो छिद्र की खुली संभावना को संशोधित करते हैं, उनकी पहचान की गई है। उदाहरण के लिए, एमपीटीपी को कैल्शियम, अकार्बनिक फॉस्फेट, फैटी एसिड और आरओएस के साथ खोलने के लिए उत्तेजित किया जा सकता है और एडेनिन न्यूक्लियोटाइड्स (विशेष रूप से एडीपी), मैग्नीशियम, प्रोटॉन और सीएसए 5,12 द्वारा बाधित किया जा सकता है। इनमें से कुछ विनियामकों की कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट किया गया है। माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम एटीपी सिंथेस15 के β-सबयूनिट को बाध्य करके कम से कम भाग में एमपीटीपी खोलने को ट्रिगर करता है। आरओएस एडीपी के लिए अपनी आत्मीयता को कम करके और साइक्लोफिलिन डी (सीवाईपीडी) के लिए अपनी आत्मीयता को बढ़ाकर एमपीटीपी को सक्रिय कर सकता है, जो सबसे अच्छा अध्ययन किया गया प्रोटीनियस एमपीटीपी एक्टिवेटर16 है। अकार्बनिक फॉस्फेट और फैटी एसिड द्वारा एमपीटीपी के सक्रियण का तंत्र कम स्पष्ट है। अंतर्जात अवरोधकों के लिए, एडीपी को एएनटी या एटीपी सिंथेस पर बाध्यकारी द्वारा एमपीटीपी को बाधित करने के लिए सोचा जाता है, जबकि मैग्नीशियम अपनी बाध्यकारी साइट15,17,18,19 से कैल्शियम को विस्थापित करके अपने निरोधात्मक प्रभाव को लागू करता है।

कम पीएच एटीपी सिंथेस 12,20,21 के नियामक ओलिगोमाइसिन संवेदनशीलता-प्रदान प्रोटीन (ओएससीपी) सबयूनिट के हिस्टिडाइन112 को प्रोटॉन करके एमपीटीपी खोलने को रोकता है। एमपीटीपी, सीएसए का प्रोटोटाइपिकल फार्माकोलॉजिकल अवरोधक, सीवाईपीडी को बाध्य करके और ओएससीपी22,23 के साथ इसके सहयोग को रोककर कार्य करता है। पिछले काम से यह भी पता चला है कि विभिन्न प्रकार के कोक्यू एनालॉग एमपीटीपी के साथ बातचीत करते हैं, इसे बाधित करते हैं या इसे सक्रिय करते हैं24। हाल के काम में, हमें नवजात एफएक्सएस माउस पिल्ले25 के अग्रमस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया में सीओक्यू की कमी के कारण पैथोलॉजिकल रूप से खुले एमपीटीपी, अत्यधिक प्रोटॉन रिसाव और अक्षम ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के सबूत मिले।

बहिर्जात सीओक्यू के साथ छिद्र के बंद होने से वैकृत प्रोटॉन रिसाव और डेंड्रिटिक स्पाइन25 की प्रेरित आकारिकी परिपक्वता को अवरुद्ध कर दिया गया। दिलचस्प बात यह है कि एक ही जानवरों में, एफएक्सएस कार्डियोमायोसाइट्स में वाइल्डटाइप नियंत्रण26 की तुलना में अत्यधिक सीओक्यू स्तर और बंद एमपीटीपी संभावना थी। यद्यपि सीओक्यू स्तरों में इन ऊतक-विशिष्ट मतभेदों का कारण अज्ञात है, निष्कर्ष इस अवधारणा को रेखांकित करते हैं कि अंतर्जात सीओक्यू संभवतः एमपीटीपी का एक प्रमुख नियामक है। हालांकि, हमारे ज्ञान में एक बड़ा अंतर है क्योंकि एमपीटीपी के सीओक्यू-मध्यस्थता निषेध का तंत्र अज्ञात रहता है।

एमपीटीपी का विनियमन सेल सिग्नलिंग और अस्तित्व4 का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है। इस प्रकार, विशिष्ट पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र पर विचार करते समय माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर एमपीटीपी खोलने का पता लगाना महत्वपूर्ण है। आमतौर पर, पारगम्यता संक्रमण को ट्रिगर करने के लिए कैल्शियम का उपयोग करके उच्च-चालकता छिद्र खोलने के लिए दहलीज निर्धारित की जाती है। इस तरह के कैल्शियम लोडिंग झिल्ली क्षमता के पतन, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के तेजी से अनकपलिंग, और माइटोकॉन्ड्रियल सूजन27,28 की ओर जाता है। हमने सीटू में कम-चालकता एमपीटीपी खोलने का पता लगाने के लिए एक विधि विकसित करने की मांग की, इसे प्रति से प्रेरित किए बिना।

दृष्टिकोण एक प्रोटॉन रिसाव चैनल के रूप में एमपीटीपी की भूमिका का शोषण करता है। ऐसा करने के लिए, क्लार्क-टाइप और टीपीपी + आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड को रिसाव श्वसन29 के दौरान पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में क्रमशः ऑक्सीजन की खपत और झिल्ली क्षमता को एक साथ मापने के लिए नियोजित किया गया था। एमपीटीपी खोलने के लिए दहलीज विशिष्ट झिल्ली क्षमता पर प्रोटॉन रिसाव के सीएसए-मध्यस्थता निषेध की शुरुआत से निर्धारित की गई थी। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, सीओक्यू अतिरिक्त के संदर्भ में एमपीटीपी के वोल्टेज गेटिंग में अंतर को ठीक से परिभाषित किया गया था।

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Protocol

कोलंबिया विश्वविद्यालय मेडिकल सेंटर अनुमोदन की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति वर्णित सभी तरीकों के लिए प्राप्त की गई थी। एफएक्सएस (एफएमआर 1 केओ) (एफवीबी .12 9 पी 2-पीडीई 6 बी + टायरसी-सीएच एफएमआर 1टीएम 1 सीजीआर / जे) और नियंत्रण (एफवीबी) (एफवीबी .12 9 पी 2-पीडीई 6 बी + टायरसी-सीएच / एंटजे) चूहों को व्यावसायिक रूप से अधिग्रहित किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में पांच से ग्यारह जानवरों का उपयोग किया गया था। प्रसवोत्तर दिन 10 (पी 10) चूहों का उपयोग मानव शैशवावस्था में एक समय बिंदु के लिए मॉडल करने के लिए किया गया था।

1. माउस दिल से माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव

  1. तालिका 1 में वर्णित के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव और श्वसन प्रयोगों के लिए बफर तैयार करें। यदि अग्रिम में बनाया गया है तो 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    1. 15% घनत्व ढाल मध्यम तैयार करें: घनत्व ढाल मंदक के साथ वाणिज्यिक घनत्व ढाल माध्यम को 80% मात्रा / इसके अलावा माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव बफर (एमआई) / गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) जोड़कर 80% घनत्व ढाल मध्यम 15% वी / वी को पतला करें।
  2. इन प्रयोगों के लिए ताजा, जमे हुए ऊतक से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करें और तैयारी के दिन उपयोग करें, आमतौर पर पांच घंटे26 के भीतर। बर्फ पर सभी अलगाव चरणों को पूरा करें।
    1. माउस को नष्ट करें और दिल को एक्साइज करें। बीएसए के साथ पेट्री डिश में तुरंत 1-2 बार धोलें। एट्रियम को काट लें और ऊतक को कीमा दें।
    2. बीएसए के 1 एमएल युक्त ग्लास-ग्लास होमोजेनाइज़र में कीमा बनाया हुआ दिल के ऊतकों को स्थानांतरित करें। एक ढीले (ए) मूसल (10 स्ट्रोक) के साथ होमोजेनाइज करें, फिर एक तंग (बी) मूसल (10 स्ट्रोक)।
    3. परमाणु और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,100 × ग्राम पर होमोजेनेट को अपकेंद्रित्र करें।
    4. किसी भी शराबी गोली को छूने के बिना धीरे से सतह पर तैरनेवाला ले लो, और ध्यान से एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में 15% घनत्व ढाल माध्यम के 700 μL के शीर्ष पर परत। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 18,500 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    5. बीएसए के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।
    6. सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से हटा दें और त्यागें। बीएसए में गोली को 55 μL की अंतिम मात्रा में पुन: निलंबित करें।
    7. एक मानक परख जैसे कि बिसिंकोनिनिक एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन सामग्री की मात्रा निर्धारित करें।

2. माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन (ओ2) की खपत और Π Π

  1. ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड असेंबली और अंशांकन
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड ( सामग्री की तालिका देखें) को सेट अप और कैलिब्रेट करें।
      1. इलेक्ट्रोड डिस्क के गुंबद के शीर्ष पर 50% पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल) इलेक्ट्रोलाइट समाधान की एक बूंद रखें।
      2. इलेक्ट्रोलाइट ड्रॉप पर प्रदान किए गए पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) झिल्ली के थोड़ा बड़े टुकड़े के साथ कवर किया गया एक छोटा टुकड़ा ~2 सेमी 2 सिगरेट पेपर स्पेसर रखें।
      3. प्रदान किए गए आवेदक उपकरण का उपयोग करके, इलेक्ट्रोड के गुंबद पर छोटे इलेक्ट्रोड डिस्क ओ-रिंग को धक्का दें।
        नोट: सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं और झिल्ली चिकनी है।
    2. इलेक्ट्रोलाइट समाधान के साथ जलाशय को अच्छी तरह से ऊपर उठाएं।
    3. इलेक्ट्रोड डिस्क के चारों ओर अवकाश में बड़े ओ-रिंग को अच्छी तरह से रखें।
    4. इलेक्ट्रोड कक्ष में डिस्क स्थापित करें और इसे नियंत्रण इकाई से कनेक्ट करें।
    5. प्रतिक्रिया कक्ष में हवा संतृप्त विआयनीकृत पानी के 2 एमएल जोड़ें और कक्ष में पीटीएफई-लेपित चुंबक जोड़ें।
    6. नियंत्रण इकाई के पीछे से कक्ष कनेक्ट करें।
    7. तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस और सरगर्मी की गति को 100 तक सेट करें।
    8. अंशांकन शुरू करने से पहले सिस्टम तापमान को संतुलित करने के लिए 10 मिनट की अनुमति दें।
    9. अंशांकन टैब के तहत, तरल चरण अंशांकन करने के लिए तरल चरण अंशांकन का चयन करें। पुष्टि करें कि तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट है, सरगर्मी की गति 100 है, और दबाव वायुमंडलीय दबाव (101.32 केपीए) पर सेट है।
    10. ठीक दबाएं और पठार के लिए संकेत की प्रतीक्षा करें।
    11. जब कोई पठार पहुंच जाता है, तो ठीक दबाएं।
    12. सोडियम डिथियोनाइट की एक छोटी राशि (~20 मिलीग्राम) जोड़कर कक्ष में शून्य ओ 2 स्थापित करें।
    13. ठीक दबाएं और पठार के लिए संकेत की प्रतीक्षा करें।
    14. जब कोई पठार पहुंच जाता है, तो अंशांकन स्वीकार करने के लिए सहेजें दबाएँ ।
  2. टीपीपी +- चयनात्मक इलेक्ट्रोड असेंबली
    1. प्रदान की गई सिरिंज और लचीली सुई का उपयोग करके 10 एमएम टीपीपी समाधान के साथ टीपीपी + - चयनात्मक इलेक्ट्रोड टिप भरें, हवा के बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखें।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार संदर्भ इलेक्ट्रोड और इलेक्ट्रोड धारक सहित टीपीपी + चयनात्मक इलेक्ट्रोड तंत्र को इकट्ठा करें, ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. संक्षेप में, इलेक्ट्रोड धारक टोपी को ढीला करें और आंतरिक संदर्भ इलेक्ट्रोड को टीपीपी + टिप में डालें। टिप को सुरक्षित करने के लिए टोपी को कस लें। प्रदान की गई केबल को इलेक्ट्रोड धारक और नियंत्रण बॉक्स के सहायक बंदरगाह से कनेक्ट करें।
    4. आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड के लिए अनुकूलित प्लंजर असेंबली में टीपीपी + चयनात्मक इलेक्ट्रोड और संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें। संदर्भ इलेक्ट्रोड को नियंत्रण बॉक्स के संदर्भ पोर्ट से कनेक्ट करें।
    5. आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड के लिए अनुकूलित प्लंजर असेंबली में टीपीपी + चयनात्मक और संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें।
  3. प्रतिक्रिया कक्ष की तैयारी
    1. प्रतिक्रिया कक्ष में प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें: 10 एमएम सक्सिनेट (जटिल द्वितीय सब्सट्रेट), 5 μM रोटेनोन (जटिल मैं अवरोधक), 80 एनजी एमएल -1 नाइजेरिसिन (आईएमएम में पीएच ढाल को ध्वस्त करने के लिए), 2.5 μg एमएल -1 ओलिगोमाइसिन (राज्य 4 श्वसन को प्रेरित करने के लिए), और श्वसन बफर (आरबी) / चैम्बर में हवा के बुलबुले पेश करने से बचने के लिए ध्यान रखें।
    2. टीपीपी + चयनात्मक और जगह में संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ अनुकूलित सवार विधानसभा के साथ कक्ष बंद करें। रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए जाओ का चयन करें। एक बार कक्ष बंद हो जाने के बाद, सुई की लंबाई को समायोजित करने के लिए प्लास्टिक टयूबिंग के साथ संशोधित अलग-अलग माइक्रोसिरिंज का उपयोग करके सीधे प्रतिक्रिया समाधान में अतिरिक्त अभिकर्मकों को पेश करें।
  4. टीपीपी + अंशांकन
    1. एक बार एक स्थिर वोल्टेज सिग्नल प्राप्त होने के बाद, 0.1 एमएम टीपीपी समाधान के 1 π एम वेतन वृद्धि को 3 μM की अंतिम एकाग्रता में जोड़कर TPP +-चयनात्मक इलेक्ट्रोड को कैलिब्रेट करें। ध्यान दें कि प्रत्येक जोड़ के साथ टीपीपी + वोल्टेज सिग्नल में लॉगरिदमिक गिरावट है।
      नोट: प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में टीपीपी + चयनात्मक इलेक्ट्रोड कैलिब्रेट करें।
  5. डेटा अधिग्रहण
    1. ओ2 और टीपीपी + निशान को स्थिर करने की अनुमति दें, और प्लंजर असेंबली में अभिकर्मक जोड़ बंदरगाह के माध्यम से 0.1 मिलीग्राम एमएल -1 की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रतिक्रिया कक्ष में ताजा तैयार कार्डियोमायोसाइट्स माइटोकॉन्ड्रिया के 100 μg जोड़ें। कक्ष में ओ2 के स्तर में कमी का निरीक्षण करें क्योंकि माइटोकॉन्ड्रिया सक्रिय हो जाता है और ओ2 का उपभोग करता है और टीपीपी + वोल्टेज सिग्नल में अचानक वृद्धि करता है क्योंकि माइटोकॉन्ड्रिया एक झिल्ली क्षमता उत्पन्न करता है और समाधान से टीपीपी + लेता है।
    2. राज्य 4 श्वसन को प्रेरित करने के लिए 2.5 μg एमएल -1 ओलिगोमाइसिन जोड़ें।
      नोट: हे2 खपत दर अब प्रोटॉन रिसाव श्वसन की दर का प्रतिनिधित्व करेगी। ओलिगोमाइसिन को एक विकल्प के रूप में टीपीपी + से पहले प्रतिक्रिया कक्ष में जोड़ा जा सकता है।
  6. एमपीटीपी की खुली संभावना का आकलन करना
    1. ध्यान दें कि रिसाव श्वसन के दौरान समय के साथ Π में गिरावट आती है। एक बार वांछित Π Π तक पहुँच जाने के बाद, उस विशिष्ट पर एमपीटीपी की खुली संभावना का आकलन करने के लिए प्रतिक्रिया कक्ष में 1 μM सीएसए (एमपीटीपी अवरोधक) जोड़ें।
    2. सीएसए जोड़ने से पहले और बाद में O2 खपत और Π पर सीएसए के प्रभाव को मापें
    3. एमपीटीपी खोलने की वोल्टेज निर्भरता को Π Π को अलग करके निर्धारित करें जिस पर सीएसए को क्रमिक प्रयोगों में जोड़ा जाता है।

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Representative Results

इन प्रयोगों में उत्पन्न विशिष्ट हे2 खपत और Π घटता दिखाया गया है (चित्रा 1 ए, बी)। टीपीपी + अंशांकन के साथ वोल्टेज सिग्नल में लॉगरिदमिक गिरावट प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में दिखाया गया है। इस लॉगरिदमिक पैटर्न की अनुपस्थिति टीपीपी + चयनात्मक इलेक्ट्रोड के साथ एक समस्या का सुझाव दे सकती है। माइटोकॉन्ड्रिया आमतौर पर श्वसन बफर के अलावा तुरंत Π Π उत्पन्न करता है। नेर्न्स्ट समीकरण (माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के अंदर [टीपीपी + का लॉगरिदमिक अनुपात] से [बाहरी टीपीपी +]) 30 के आधार पर टीपीपी + वोल्टेज में परिवर्तन से व्याख्या की जा सकती है। ध्यान दें कि शारीरिक Π Π मानक वक्र के 2 μM TPP + स्तर का अनुमान लगाता है। वोल्टेज थ्रेसहोल्ड को इस प्रकार 2 μM TPP + मानक (Π mV TPP + वोल्टेज सिग्नल के रूप में चिह्नित) के सापेक्ष परिभाषित किया गया था।

उदाहरण के लिए, "उच्च Π" को ~ Π0 एमवी (2 μM TPP + स्तर पर) के रूप में परिभाषित किया गया था, एक "मध्यवर्ती Π" को ~ Π5 एमवी (2 μM TPP+से नीचे) पर सेट किया गया था, और "कम Π" ~ Π10 एमवी (2 μM TPP+) (चित्रा 1A, B से नीचे) पर सेट किया गया था। पायलट प्रयोगों में, 0 एमवी पर माइटोकॉन्ड्रिया ने 100% एमपीटीपी बंद संभावना का प्रदर्शन किया और 10 एमवी पर उन लोगों ने 100% खुली संभावना का प्रदर्शन किया; प्रतिनिधि रेखांकन चित्रा 1 ए, बी में दिखाए गए हैं। इस प्रकार Π5 एमवी थ्रेशोल्ड को मनमाने ढंग से एक मध्यवर्ती Π के रूप में चुना गया था। ध्यान दें कि इन प्रयोगों में, प्रतिक्रिया कक्ष में माइटोकॉन्ड्रिया के अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया राज्य 2 श्वसन में हैं जहां वे अतिरिक्त सब्सट्रेट के संपर्क में हैं। माइटोकॉन्ड्रिया को एडीपी के साथ राज्य 3 में प्रवेश करने के लिए उत्तेजित नहीं किया जाता है; नतीजतन, एक बार जब ओलिगोमाइसिन जोड़ा जाता है, तो वे सीधे राज्य 4 ओलिगोमाइसिन (रिसाव श्वसन) में संक्रमण करते हैं। नतीजतन, ऑक्सीजन की खपत में एक सराहनीय अंतर आमतौर पर ओलिगोमाइसिन जोड़ के बाद नहीं देखा जाता है, यह सुझाव देते हुए कि एटीपी सिंथेज़ राज्य 2 (चित्रा 1 ए, बी) के दौरान श्वसन में न्यूनतम योगदान देता है। एमपीटीपी की खुली या बंद स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए, सीएसए जोड़ से ठीक पहले और बाद में ओ2 खपत दर और झिल्ली क्षमता की तुलना की जाती है (चित्रा 1 सी)। ओ2 खपत दर में कमी और सीएसए के जवाब में Π की वृद्धि और स्थिरीकरण एक खुले एमपीटीपी (छिद्र-मध्यस्थता प्रोटॉन रिसाव की नाकाबंदी) (चित्रा 1 सी, काले घटता) के बंद होने का संकेत देता है।

जब एमपीटीपी बंद हो जाता है, तो ओ2 खपत दर में कोई कमी नहीं होती है, और Π में वृद्धि और स्थिरता नहीं होती है लेकिन गिरावट जारी रहती है (चित्रा 1 सी, लाल घटता)। प्रयोगात्मक परिणाम एफवीबी नियंत्रण और एफएमआर 1 केओ कार्डियक माइटोकॉन्ड्रिया (चित्रा 1 डी) में क्रमशः उच्च और निम्न ΠΠs पर समान बंद और खुले एमपीटीपी संभावनाओं का प्रदर्शन करते हैं। ये निष्कर्ष एमपीटीपी के ज्ञात वोल्टेज-संवेदनशील गुणों के अनुरूप हैं, जहां छिद्र उच्च ΠΠs पर बंद हो जाता है और कम ΠΨs13 पर खुला होता है। इस प्रकार, इस विधि का उपयोग करके, हमने दोनों उपभेदों में एमपीटीपी की सामान्य वोल्टेज निर्भरता का मज़बूती से प्रदर्शन किया। दिलचस्प बात यह है कि मध्यवर्ती Π (5 एमवी थ्रेसहोल्ड) पर, एफएमआर 1 केओ कार्डियक माइटोकॉन्ड्रिया ने एफवीबी नियंत्रण (चित्रा 1 डी) की तुलना में बंद एमपीटीपी संभावना में वृद्धि का प्रदर्शन किया। इस प्रकार, एफएमआर 1 केओ कार्डियक माइटोकॉन्ड्रिया ने गेटिंग में एक बदलाव का प्रदर्शन किया जैसे कि छिद्र को ट्रिगर करने के लिए खोलने के लिए कम ΠΠ की आवश्यकता होती है। यह पिछली खोज के अनुरूप है कि एफएमआर 1 केओ में सीओक्यू के स्तर और अपेक्षाकृत बंद एमपीटीपी26 का स्तर बढ़ गया है। इस प्रकार, विधि ने एमपीटीपी खोलने में अंतर को हल करने के लिए एक इष्टतम Π Π थ्रेशोल्ड की पहचान की। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस Π थ्रेशोल्ड को परिभाषित करने से आगे की जांच को बेहतर ढंग से समझने में सक्षम बनाया जा सकेगा कि कोक्यू एमपीटीपी को कैसे नियंत्रित करता है और कैसे सीओक्यू की कमी एफएक्सएस में पैथोलॉजिकल पोर ओपनिंग की ओर ले जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: कम चालकता एमपीटीपी खुली संभावना का पता लगाना( ए, बी) एक साथ ओ2 खपत के प्रतिनिधि घटता (लाल, संख्याएं ओ2 एमएल -1 मिनट -1 मिलीग्राम प्रोटीन -1 के एनएमओएल में दरें हैं) के साथ ( काला, [टीपीपी +])। तीर टीपीपी +, माइटोकॉन्ड्रिया, ओलिगोमाइसिन और सीएसए के अलावा इंगित करते हैं। 2 μM TPP + अंशांकन स्तर के सापेक्ष उच्च, मध्यवर्ती और कम वोल्टेज थ्रेसहोल्ड दिखाए गए हैं। उच्च (ए) और कम (बी) वोल्टेज थ्रेसहोल्ड पर सीएसए के अलावा दिखाया गया है। (सी) सीएसए जोड़ के बिंदु पर (ए) और (बी) में ओ2 खपत (ऊपरी) और Π (निचले) घटता का आवर्धित अनुभाग, उच्च π (सीएसए के प्रति असंवेदनशील) पर बंद एमपीटीपी (लाल) को दर्शाता है और कम Π (सीएसए के प्रति संवेदनशील) पर एमपीटीपी (काला) खोलता है। (डी) एफवीबी नियंत्रण (काला) और एफएमआर 1 केओ (ग्रे) के लिए उच्च, निम्न और मध्यवर्ती पर एमपीटीपी खुली और बंद स्थिति के सारांश रेखांकन दिखाए गए हैं। पांच से 11 जानवरों का मूल्यांकन प्रत्येक Π दहलीज पर किया गया था; पी मूल्यों की गणना ची-स्क्वायर परीक्षण का उपयोग करके की गई थी, * पी < 0.05। संक्षेप: Π = माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता; एमपीटीपी = माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्र; टीपीपी + = टेट्राफेनिलफॉस्फोनियम; मिटो = माइटोकॉन्ड्रिया; ओलिगो = ओलिगोमाइसिन; सीएसए = साइक्लोस्पोरिन ए; ΔΨ = ; केओ = नॉकआउट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घटक एमआई/बीएसए* SB/BSA* घनत्व प्रवणता मंदक आरबी/बीएसए*
मन्नीटोल 225 m M - - -
शर्करा 75 mM 250 mM 1 M 200 mM
HEPES 5 mM 5 mM 50 mM 5 mM
EGTA 1 mM 0.1 mM 10 mM -
केसीएल - - - 25 mM
केएच2पीओ4 - - - 2 mM
एमजीसीएल2 - - - 5 mM
पीएच ** 7.4 7.4 - 7.2
बीएसए *** 0.10% 0.10% - 0.02%
एपी 5 ए *** - - - 30 mM

तालिका 1: बफ़र्स और समाधान।
* 0.2 μm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर
** आवश्यकतानुसार 3 एम पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड के साथ पीएच समायोजित करें।
बफर घटकों को दर्शाता है जो माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव से ठीक पहले जोड़े जाते हैं।
संक्षेप: एमआई = माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव बफर; एसबी = सुक्रोज बफर; आरबी = श्वसन बफर; बीएसए = फैटी एसिड मुक्त गोजातीय सीरम एल्बुमिन; एचईपीईएस = 4- (2-हाइड्रॉक्सीएथिल) -1-पिपेराज़िनेथेनसल्फोनिक एसिड; ईजीटीए = एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (β-एमिनोएथिल ईथर) -एन, एन, एन', एन'-टेट्राएसिटिक एसिड; केसीएल = पोटेशियम क्लोराइड; केएच2पीओ4 = पोटेशियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट; एमजीसीएल2 = मैग्नीशियम क्लोराइड; एपी 5 ए = पी 1, पी 5-डायडेनोसिन -5 'पेंटाफॉस्फेट पेंटासोडियम।

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Discussion

यह पेपर एमपीटीपी की खुली संभावना का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। विशेष रूप से, कम चालकता एमपीटीपी खोलने के लिए वोल्टेज थ्रेशोल्ड को प्रोटॉन रिसाव पर सीएसए अवरोध के प्रभाव का आकलन करके निर्धारित किया गया था। इस तकनीक का उपयोग करके, हम ऊतक-विशिष्ट सीओक्यू सामग्री में उनके मतभेदों के अनुरूप एफएक्सएस चूहों और एफवीबी नियंत्रणों के बीच एमपीटीपी के वोल्टेज गेटिंग में अंतर की पहचान कर सकते हैं। इस पद्धति की सफलता के लिए महत्वपूर्ण यह है कि माइटोकॉन्ड्रिया उपयोग से पहले ताजा पृथक होते हैं और अच्छी गुणवत्ता के होते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया जो या तो अलगाव के दौरान क्षतिग्रस्त हो जाते हैं या बहुत पुराने होते हैं, वे उचित Π Π उत्पन्न करने में असमर्थ होंगे और आमतौर पर असंबद्ध हो जाएंगे। ध्यान दें कि मैट्रिक्स पीएच आमतौर पर प्रोटॉन मकसद बल में योगदान देता है, नाइजरिसिन का उपयोग इन प्रयोगों में आईएमएम में Πपीएच को ध्वस्त करने के लिए किया जाता है, जैसा कि पहले प्रोटॉन रिसाव29 का आकलन करने वाले मानक प्रोटोकॉल में वर्णित है। इसलिए, इस मामले में, प्रोटॉन मकसद बल Π के बराबर है, जो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को सरल बनाता है।

एक और महत्वपूर्ण विचार यह है कि श्वसन मिश्रण (जैसे रोटेनोन, ओलिगोमाइसिन और सीएसए) में उपयोग किए जाने वाले कुछ अवरोधकों को प्रयोगों के बीच दूर करना मुश्किल है क्योंकि वे आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड सहित प्रतिक्रिया कक्ष की प्लास्टिक सतहों का पालन करते हैं। कक्ष को इथेनॉल के साथ नियमित रूप से धोया जाना चाहिए और चैंबर से इन अवरोधकों को "मॉप अप" करने के लिए क्रूडली तैयार फ्रीज-पिघला हुआ माइटोकॉन्ड्रिया का निलंबन और अवरोधक कैरी-ओवर की संभावना को कम करना चाहिए जो प्रयोगों की प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकता है।

चूंकि माइटोकॉन्ड्रिया को उनकी अखंडता को बनाए रखने के लिए ताजा तैयार किया जाना चाहिए, इसलिए यह विधि उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए उत्तरदायी नहीं है। इसके अलावा, प्रत्येक प्रयोग के लिए अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में माइटोकॉन्ड्रिया की आवश्यकता होती है। आमतौर पर, पी 10 जानवरों के लिए, एक एकल प्रयोग करने के लिए एक अंग से पर्याप्त माइटोकॉन्ड्रिया को अलग किया जा सकता है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रिया के एक ही बैच पर विभिन्न स्थितियों का परीक्षण आमतौर पर संभव नहीं है। यदि पुराने जानवरों के साथ प्रयोग किए जाते हैं, तो ऊतकों और अंगों के अपेक्षाकृत बड़े आकार को देखते हुए यह सीमा एक मुद्दे से कम है।

पृथक बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया में एमपीटीपी की खुली संभावना का अध्ययन करने के लिए कई अच्छी तरह से वर्णित तरीके मौजूद हैं। तकनीकें, जैसे माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स सूजन और कैल्शियम लोडिंग या प्रतिधारण क्षमता परख, आवश्यक रूप से उच्च-चालकता पीटी को ट्रिगर करते हैं और इस प्रकार शारीरिक कम-चालकता खोलने के अध्ययन की अनुमति नहीं देते हैं जो इन प्रयोगों28 में रुचि रखते हैं। पैच-क्लैंप तकनीक एमपीटीपी31,32 के उच्च या निम्न-चालकता राज्यों की वोल्टेज निर्भरता का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली और प्रत्यक्ष विधि प्रदान करती है। हालांकि, यह एक श्रमसाध्य तकनीक है, जहां एक समय में केवल एक ही मिटोकॉन्ड्रियन और एक एकल प्रयोगात्मक स्थिति का अध्ययन किया जा सकता है, जो तुलनात्मक अध्ययन को अधिक कठिनबनाता है 32,33।

इसके अलावा, बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली आमतौर पर लाइस्ड होती है, और आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली आमतौर पर पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले पैच-क्लैंप विधियों में टूट जाती है, जिसके परिणामस्वरूप एमपीटीपी नियामक कारकों का नुकसान हो सकता है जो आईएमएम31 के साथ घनिष्ठ रूप से जुड़े नहीं हैं। एमपीटीपी के कम-चालकता उद्घाटन का भी विभिन्न प्रकार की प्रतिदीप्ति तकनीकों का उपयोग करके अध्ययन किया गया है, जो आमतौर पर एक टेट्रामेथिलरोडामाइन एस्टर (Π में परिवर्तन का आकलन करने के लिए) को या तो अकेले या कैल्सीन के साथ संयोजन में नियोजित करता है, जिसका इंट्रामाइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस कोबाल्ट शमन के लिए अतिसंवेदनशील होता है जब एमपीटीपी 8,34 खुला होता है। हालांकि, प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोणों में, जैसा कि Π में परिवर्तन प्रतिदीप्ति में सापेक्ष परिवर्तन के रूप में व्यक्त किए जाते हैं, दृष्टिकोण आमतौर पर 8,34 के सटीक माप की अनुमति नहीं देता है।

यह विधि Π के संबंध में एमपीटीपी के कम-चालकता उद्घाटन का आकलन करने के लिए एक नया वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करती है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, जांचकर्ता शारीरिक और वैकृत एमपीटीपी वोल्टेज गेटिंग के विनियमन का अध्ययन कर सकते हैं। यह तकनीक अंग परिपक्वता में एमपीटीपी की विकासात्मक भूमिका को समझने में मदद करने का वादा भी करती है क्योंकि इसे विभिन्न ऊतकों और विकास के विभिन्न चरणों पर लागू किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण को एफएक्सएस माउस फोरब्रेन ऊतक में एमपीटीपी के वोल्टेज गेटिंग का अध्ययन करने के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है, जिसने पहले सीओक्यू स्तर25 में कमी का प्रदर्शन किया था। इसके अलावा, हम प्रस्ताव करते हैं कि इस तकनीक का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है कि अन्य एजेंट, अंतर्जात या बहिर्जात, एमपीटीपी के वोल्टेज गेटिंग को कैसे प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, यह स्वास्थ्य और बीमारी के लिए एमपीटीपी के योगदान की समझ का विस्तार करने के लिए एक उपयोगी उपकरण साबित होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए ब्याज का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया है: एनआईएच / एनआईजीएमएस टी 32 जीएम 008464 (केकेजी), कोलंबिया विश्वविद्यालय इरविंग मेडिकल सेंटर एनेस्थिसियोलॉजी विभाग (केकेजी), सोसाइटी ऑफ पीडियाट्रिक एनेस्थेसिया यंग इन्वेस्टिगेटर रिसर्च अवार्ड (केकेजी), और एनआईएच / एनआईएच / एनआईएनडीएस आर 01 एनएस 112706 (आरजेएल) के समाज को अवसर प्रोवोस्ट पुरस्कार का लक्ष्य

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific 15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 PP systems 941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. Fisher Scientific 14-170-11B to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free Sigma A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm World Precision Inst. LLC DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips World Precision Inst. LLC KWIK-2  ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA) Sigma 324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk Cole-Parmer EW-07938-30 microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle Cole-Parmer EW-07938-02 microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete PP systems OXYTHERM+R oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma 1374248
Mannitol Sigma M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) Sigma D4022-10MG
Percoll Sigma P1644 medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl) Sigma P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma 5.43841
Sucrose Sigma S0389
TPP+ Electrode Tips (3) World Precision Inst. LLC TIPTPP

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References

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जीवविज्ञान अंक 184
कोएंजाइम क्यू अतिरिक्त की सेटिंग में माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण पोर की खुली संभावना का आकलन
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Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. … More

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. J. Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess. J. Vis. Exp. (184), e63646, doi:10.3791/63646 (2022).

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