Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Оценка открытой вероятности поры перехода митохондриальной проницаемости в условиях избытка коэнзима Q

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63646
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

Summary

Этот метод использует вклад поры перехода митохондриальной проницаемости в утечку протонов с низкой проводимостью для определения порога напряжения для открытия пор у неонатальных хрупких мышей с синдромом X с повышенным содержанием митохондриального коэнзима Q кардиомиоцитов по сравнению с контролем дикого типа.

Abstract

Переходная пора митохондриальной проницаемости (mPTP) представляет собой мегаканал с напряжением, неселективный мегаканал внутренней митохондриальной мембраны (ИММ), важный для здоровья и болезней. mPTP опосредует утечку протонов через ИММ во время открытия с низкой проводимостью и специфически ингибируется циклоспорином А (CsA). Коэнзим Q (CoQ) является регулятором mPTP, и были обнаружены тканеспецифические различия в содержании CoQ и открытой вероятности mPTP в митохондриях переднего мозга и сердца у новорожденной мышиной модели синдрома хрупкого X (FXS, нокаут Fmr1 ). Мы разработали методику определения порога напряжения для открытия mPTP в этом мутантном штамме, используя роль mPTP в качестве канала утечки протонов.

Для этого потребление кислорода и мембранный потенциал (ΔΨ) одновременно измеряли в изолированных митохондриях с использованием полярографии и ионселективного электрода тетрафенилфосфония (TPP+) во время утечного дыхания. Порог вскрытия mPTP определяли по началу CsA-опосредованного ингибирования утечки протонов при специфических мембранных потенциалах. Используя этот подход, различия в напряжении затвора mPTP были точно определены в контексте превышения CoQ. Этот новый метод позволит в будущем проводить исследования для улучшения понимания физиологической и патологической регуляции низкопроводящего открытия mPTP.

Introduction

mPTP опосредует переход проницаемости (PT), в результате чего IMM становится резко проницаемым для малых молекул ирастворяет 1,2. Это поразительное явление является явным отходом от характерной непроницаемости ИММ, которая имеет основополагающее значение для установления электрохимического градиента, необходимого для окислительного фосфорилирования3. ПТ, в отличие от других митохондриальных транспортных механизмов, представляет собой высокопроводящий, неспецифический и неселективный процесс, позволяющий проходить в диапазоне молекул до 1,5 кДа 4,5. mPTP представляет собой канал с напряжением внутри IMM, открытие которого изменяет ΔΨ, выработку АТФ, гомеостаз кальция, выработку активных форм кислорода (АФК) и жизнеспособность клеток4.

В патологическом крайнем случае неконтролируемое и длительное высокопроводящее открытие mPTP приводит к коллапсу электрохимического градиента, набуханию матрицы, истощению матриксных пиридиновых нуклеотидов, разрыву наружной мембраны, высвобождению межмембранных белков (включая цитохром c) и, в конечном счете, гибели клеток 4,6. Такое патологическое открытие mPTP было связано с сердечной ишемией-реперфузионным повреждением, сердечной недостаточностью, черепно-мозговой травмой, различными нейродегенеративными заболеваниями и диабетом 1,7. Однако открытие mPTP с низкой проводимостью носит физиологический характер и, в отличие от открытия с высокой проводимостью, не приводит к глубокой деполяризации или митохондриальному отеку4.

Низкопроводящее открытие поры ограничивает проницаемость до ~300 Да, позволяет проходить протонам независимо от синтеза АТФ и является потенциальным источником физиологической утечки протонов5. Физиологическое открытие mPTP вызывает контролируемое снижение ΔΨ, увеличивает поток электронов через дыхательную транспортную цепь и приводит к короткому всплеску или вспышке супероксида, способствуя передаче сигналов АФК8. Регуляция такого переходного открытия mPTP важна для гомеостаза кальция и нормального клеточного развития и созревания 4,9,10,11. Транзиторное открытие пор в развивающихся нейронах, например, запускает дифференцировку, в то время как закрытие mPTP индуцирует созревание в незрелых кардиомиоцитах 4,5.

Хотя функциональное значение mPTP в здоровье и болезнях хорошо известно, его точная молекулярная идентичность остается спорной. Прогресс в области молекулярной структуры и функции mPTP был всесторонне рассмотрен в другом месте12. Вкратце, в настоящее время предполагается, что состояния mPTP с высокой и низкой проводимостью опосредованы различными сущностями12. Ведущими кандидатами являются F1/F0 АТФ-синтаза (АТФ-синтаза) и транспортер адениннуклеотидов (ANT) для режимов высокой и низкой проводимости соответственно12.

Несмотря на отсутствие консенсуса относительно точной идентичности порообразующего компонента mPTP, некоторые ключевые характеристики были детализированы. Хорошо известной особенностью mPTP является то, что он регулируется электрохимическим градиентом таким образом, что деполяризация ИММ приводит к открытию пор13. Предыдущая работа показала, что окислительно-восстановительное состояние вицинальных тиольных групп изменяет напряжение мПТП, так что окисление открывает поры при относительно более высоких ΔΨs, а восстановление тиольной группы приводит к закрытой вероятности mPTP14. Однако идентичность белкового датчика напряжения неизвестна.

Были идентифицированы различные малые молекулы, которые модулируют открытую вероятность поры. Например, mPTP может быть стимулирован к открытию кальцием, неорганическими фосфатами, жирными кислотами и АФК и может ингибироваться адениннуклеотидами (особенно АДФ), магнием, протонами и CsA 5,12. Выяснены механизмы действия некоторых из этих регуляторов. Митохондриальный кальций вызывает открытие mPTP, по меньшей мере, частично путем связывания с β субъединицей АТФ-синтазы15. АФК может активировать mPTP, уменьшая его сродство к АДФ и усиливая его сродство к циклофилину D (CypD), наиболее изученному белковому активатору mPTP16. Механизм активации mPTP неорганическими фосфатами и жирными кислотами менее ясен. Что касается эндогенных ингибиторов, считается, что АДФ ингибирует mPTP путем связывания в ANT или АТФ-синтазе, в то время как магний оказывает свое ингибирующее действие, вытесняя кальций из его сайта связывания 15,17,18,19.

Низкий рН ингибирует открытие mPTP путем протонирования гистидина 112 регуляторной субъединицы белка, придающего чувствительность к олигомицину (OSCP) АТФ-синтазы 12,20,21. Прототип фармакологического ингибитора mPTP, CsA, действует путем связывания CypD и предотвращения его ассоциации с OSCP22,23. Предыдущая работа также показала, что различные аналоги CoQ взаимодействуют с mPTP, ингибируя его или активируя его24. В недавней работе мы обнаружили доказательства патологически открытого mPTP, чрезмерной утечки протонов и неэффективного окислительного фосфорилирования из-за дефицита CoQ в митохондриях переднего мозга новорожденных щенков мышей FXS25.

Закрытие пор экзогенным CoQ блокировало патологическую утечку протонов и индуцировало морфологическую зрелость дендритных шипов25. Интересно, что у тех же животных кардиомиоциты FXS имели чрезмерные уровни CoQ и закрытую вероятность mPTP по сравнению с контрольной группой дикого типа26. Хотя причина этих тканеспецифических различий в уровнях CoQ неизвестна, результаты подчеркивают концепцию, что эндогенный CoQ, вероятно, является ключевым регулятором mPTP. Тем не менее, существует большой пробел в наших знаниях, потому что механизм CoQ-опосредованного ингибирования mPTP остается неизвестным.

Регуляция mPTP является критическим фактором, определяющим клеточную сигнализацию и выживаемость4. Таким образом, обнаружение открытия mPTP в митохондриях является ключевым при рассмотрении конкретных патофизиологических механизмов. Как правило, порог для открытия пор с высокой проводимостью определяется с использованием кальция для запуска перехода проницаемости. Такая кальциевая нагрузка приводит к коллапсу мембранного потенциала, быстрому разъединению окислительного фосфорилирования и митохондриальному набуханию27,28. Мы стремились разработать метод обнаружения открытия mPTP in situ с низкой проводимостью, не вызывая его как такового.

Этот подход использует роль mPTP в качестве канала утечки протонов. Для этого были использованы ионселективные электроды Типа Кларка и TPP+ для одновременного измерения потребления кислорода и мембранного потенциала, соответственно, в изолированных митохондриях во время утечного дыхания29. Порог вскрытия mPTP определяли по началу CsA-опосредованного ингибирования утечки протонов при специфических мембранных потенциалах. Используя этот подход, были точно определены различия в напряжении платы mPTP в контексте превышения CoQ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Для всех описанных методов было получено одобрение Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Колумбийского университета. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) и контрольные (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) мыши, используемые в качестве модельных систем для этого исследования, были коммерчески приобретены (см. Таблицу материалов). От пяти до одиннадцати животных использовались в каждой экспериментальной группе. Послеродовые мыши 10-го дня (P10) использовались для моделирования временной точки в младенчестве человека.

1. Изоляция митохондрий от сердца мыши

  1. Подготовьте буферы для экспериментов с митохондриальной изоляцией и дыханием, как описано в таблице 1. Хранить при температуре 4 °C, если это сделано заранее.
    1. Приготовьте 15% градиентную среду плотности: разбавьте коммерческую градиентную среду плотности до 80% объема/объема (v/v) разбавителем градиента плотности. Далее разбавляют 80% градиентную среду плотности 15% v/v путем добавления буфера изоляции митохондрий (MI)/бычьего сывороточного альбумина (BSA).
  2. Изолируйте митохондрии из свежей, не замороженной ткани для этих экспериментов и используйте в день приготовления, обычно в течение пяти часов26. Проведите все этапы изоляции на льду.
    1. Обезглавить мышь и иссечь сердце. Немедленно вымойте 1-2 раза в чашке Петри с ледяным MI/BSA. Отрежьте предсердие и измельчите ткань.
    2. Переложите измельченную сердечную ткань на гомогенизатор из стекла и стекла, содержащий 1 мл MI/BSA. Гомогенизировать более рыхлым (А) пестиком (10 ударов), затем более плотным (В) пестиком (10 ударов).
    3. Центрифугировать гомогенат при 1 100 × г в течение 2 мин при 4 °C для удаления ядерного и клеточного мусора.
    4. Возьмите супернатант осторожно, не прикасаясь к какой-либо пушистой грануле, и аккуратно нанесите его поверх 700 мкл среды 15% градиента плотности в центрифужной трубке. Центрифуга при 18 500 × г в течение 15 мин при 4 °C.
    5. Повторно суспендируют гранулу в 1 мл сахарозного буфера (SB)/BSA и центрифугируют при 10 000 × г в течение 10 мин при 4°С.
    6. Полностью удалите и выбросьте супернатант. Повторно суспендировать гранулы в SB/BSA до конечного объема 55 мкл.
    7. Количественная оценка содержания митохондриального белка с использованием стандартного анализа, такого как анализ белка бицинхониновой кислоты (BCA).

2. Потребление митохондриального кислорода (O2) и ΔΨ

  1. Сборка и калибровка кислородных электродов
    1. Установите и откалибруйте кислородный электрод (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
      1. Поместите каплю 50% раствора электролита хлорида калия (KCl) поверх купола электродного диска.
      2. Поместите небольшой кусочек ~2см2 сигаретной бумаги, покрытый немного большим куском предоставленной политетрафторэтиленовой (PTFE) мембраны над каплей электролита.
      3. Используя прилагаемый инструмент аппликатора, нажмите на уплотнительное кольцо небольшого электродного диска над куполом электрода.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что нет пузырьков воздуха и что мембрана гладкая.
    2. Залейте резервуар раствором электролита.
    3. Поместите большее уплотнительное кольцо в углубление вокруг электродного диска.
    4. Установите диск в электродную камеру и подключите его к блоку управления.
    5. Добавьте 2 мл насыщенной воздухом деионизированной воды в реакционную камеру и магнит с ptfe-покрытием в камеру.
    6. Подключите камеру к задней части блока управления.
    7. Установите температуру на 37 °C и скорость перемешивания на 100.
    8. Подождите 10 минут, чтобы температура системы уравновешивалась перед началом калибровки.
    9. На вкладке Калибровка выберите Калибровка жидкой фазы , чтобы выполнить калибровку жидкой фазы. Убедитесь, что температура установлена на уровне 37 °C, скорость перемешивания равна 100, а давление установлено на атмосферное давление (101,32 кПа).
    10. Нажмите OK и дождитесь выхода сигнала на плато.
    11. Когда плато будет достигнуто, нажмите OK.
    12. Установите нольO2 в камере, добавив небольшое количество (~20 мг) дитионита натрия.
    13. Нажмите OK и дождитесь выхода сигнала на плато.
    14. Когда плато будет достигнуто, нажмите кнопку Сохранить , чтобы принять калибровку.
  2. TPP+-селективная электродная сборка
    1. Заполните селективный электродный наконечник TPP+ раствором TPP 10 мМ, используя прилагаемый шприц и гибкую иглу, заботясь о том, чтобы избежать пузырьков воздуха.
    2. Смонтируйте TPP+-селективный электродный аппарат, включая электрод сравнения и держатель электрода, (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Вкратце, ослабьте крышку держателя электрода и вставьте внутренний опорный электрод в наконечник TPP+. Затяните колпачок, чтобы закрепить наконечник. Подключите прилагаемый кабель к держателю электрода и вспомогательному порту блока управления.
    4. Вставьте TPP+-селективный электрод и электроды сравнения в адаптированный плунжерный узел для ионоселективных электродов. Подключите опорный электрод к опорному порту блока управления.
    5. Вставьте электроды TPP+ и электроды сравнения в адаптированный плунжерный узел для ионселективных электродов.
  3. Подготовка реакционной камеры
    1. Добавьте реакционную смесь в реакционную камеру: 10 мМ сукцината (субстрат комплекса II), 5 мкМ ротенона (ингибитор комплекса I), 80 нг мл−1 нигерицина (для коллапса градиента рН через ИММ), 2,5 мкг мл-1 олигомицина (для индуцирования дыхания в состоянии 4) и буфера дыхания (RB)/BSA реакционного буфера до конечного объема 1 мл. Позаботьтесь о том, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в камеру.
    2. Закройте камеру адаптированным плунжерным узлом с TPP+-селективным и опорным электродом на месте. Выберите GO , чтобы начать запись. Как только камера закрыта, вводят дополнительные реагенты непосредственно в реакционный раствор с помощью отдельных микрошприцев, модифицированных пластиковой трубкой, для регулировки длины иглы.
  4. Калибровка TPP+
    1. Как только будет получен сигнал стабильного напряжения, откалибруйте TPP+-селективный электрод, добавив 1 мкМ приращения раствора ТЭС 0,1 мМ к конечной концентрации 3 мкМ. Обратите внимание, что с каждым добавлением происходит логарифмическое снижение сигнала напряжения TPP+ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибруйте TPP+-селективный электрод в начале каждого эксперимента.
  5. Сбор данных
    1. Позвольте следам O2 и TPP+ стабилизироваться и добавьте 100 мкг свежеприготовленных митохондрий кардиомиоцитов в реакционную камеру до конечной концентрации 0,1 мг мл-1 через порт добавления реагента в плунжерном сборе. Наблюдайте за снижением уровней O2 в камере, когда митохондрии становятся энергичными и потребляют O2 , и резкое увеличение сигнала напряжения TPP+ , поскольку митохондрии генерируют мембранный потенциал и поглощают TPP+ из раствора.
    2. Добавьте 2,5 мкг мл-1 олигомицина, чтобы вызвать состояние дыхания 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ:Коэффициенты потребления O 2 теперь будут представлять скорость дыхания утечки протонов. Олигомицин может быть добавлен в реакционную камеру до TPP+ в качестве альтернативы.
  6. Оценка открытой вероятности mPTP
    1. Обратите внимание, что ΔΨ снижается с течением времени во время утечек дыхания. Как только желаемый ΔΨ достигнут, добавьте 1 мкМ CsA (ингибитор mPTP) в реакционную камеру для оценки открытой вероятности mPTP при этом конкретном ΔΨ.
    2. Измерение влияния CsA на потреблениеO2 и ΔΨ до и после добавления CsA
    3. Определите зависимость напряжения открытия mPTP путем изменения ΔΨ, при котором CsA добавляется в последовательных экспериментах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Показаны типичные кривые потребленияO2 и ΔΨ, полученные в этих экспериментах (рисунок 1A,B). Логарифмическое снижение сигнала напряжения при калибровке TPP+ показано в начале каждого эксперимента. Отсутствие этой логарифмической картины может указывать на проблему с селективным электродом TPP+. Митохондрии обычно генерируют ΔΨ сразу после добавления к дыхательному буферу. ΔΨ можно интерпретировать из изменений напряжения TPP+ на основе уравнения Нернста (логарифмическое отношение [TPP+ внутри митохондриальной матрицы] к [внешнему TPP+])30. Обратите внимание, что физиологический ΔΨ приближается к уровню TPP+ 2 мкМ стандартной кривой. Таким образом, пороговые значения напряжения были определены относительно стандарта TPP+ 2 мкМ (обозначаемого как сигнал напряжения Δ mV TPP+).

Например, «высокий ΔΨ» был определен как ~Δ0 мВ (на уровне 2 мкМ TPP+), «промежуточный ΔΨ» был установлен на ~Δ5 мВ (ниже 2 мкМ TPP+), а «низкий ΔΨ» был установлен на ~Δ10 мВ (ниже 2 мкМ TPP+) (рисунок 1A,B). В пилотных экспериментах митохондрии при Δ0 мВ демонстрировали 100% закрытую вероятность mPTP, а митохондрии при Δ10 мВ — 100% открытой вероятности; Репрезентативные графики показаны на рисунке 1A,B. Таким образом, порог Δ5 мВ был произвольно выбран в качестве промежуточного ΔΨ. Отметим, что в этих экспериментах при добавлении митохондрий в реакционную камеру митохондрии находятся в состоянии 2 дыхания, где они подвергаются воздействию избыточного субстрата. Митохондрии не стимулируются к вхождению в состояние 3 с АДФ; в результате, как только олигомицин добавляется, они переходят непосредственно в состояние 4 олигомицина (утечка дыхания). В результате заметная разница в потреблении кислорода обычно не наблюдается после добавления олигомицина, что позволяет предположить, что АТФ-синтаза минимально способствует дыханию во время состояния 2 (рисунок 1A,B). Для оценки открытого или закрытого состояния mPTP сравнивают скорость потребленияO2 и мембранный потенциал непосредственно перед и сразу после добавления CsA (рисунок 1C). Снижение скорости потребленияO2 и увеличение и стабилизация ΔΨ в ответ на CsA указывают на закрытие открытого mPTP (блокада поро-опосредованной утечки протона) (рисунок 1C, черные кривые).

Когда mPTP закрыт, не происходит снижения скорости потребления O2 , и ΔΨ не увеличивается и стабилизируется, а продолжает падать (рисунок 1C, красные кривые). Экспериментальные результаты демонстрируют аналогичные закрытые и открытые вероятности mPTP при высоких и низких ΔΨs, соответственно, в контроле FVB и сердечных митохондриях Fmr1 KO (рисунок 1D). Эти результаты согласуются с известными чувствительными к напряжению свойствами mPTP, где поры имеют тенденцию закрываться при высоких ΔΨs и открываться при низких ΔΨs13. Таким образом, используя этот метод, мы достоверно продемонстрировали обычную зависимость напряжения mPTP в обеих деформациях. Интересно, что на промежуточном уровне ΔΨ (порог Δ5 мВ) сердечные митохондрии Fmr1 KO продемонстрировали повышенную вероятность закрытого mPTP по сравнению с контролем FVB (рисунок 1D). Таким образом, сердечные митохондрии Fmr1 KO продемонстрировали сдвиг в затворе таким образом, что пора требовала более низкого ΔΨ для запуска открытия. Это согласуется с предыдущим выводом о том, что Нокауты Fmr1 имеют повышенные уровни CoQ и относительно закрытый mPTP26. Таким образом, метод определил оптимальный порог ΔΨ для разрешения различий в открытии mPTP. Важно отметить, что определение этого порога ΔΨ позволит продолжить исследование, чтобы лучше понять, как CoQ регулирует mPTP и как дефицит CoQ приводит к патологическому открытию пор в FXS.

Figure 1
Рисунок 1: Обнаружение открытой вероятности mPTP с низкой проводимостью. (A, B) Репрезентативные кривые одновременного потребленияO2 (красный, числа - это показатели в нмоль O2 мл-1 мин-1 мг белка-1) с ΔΨ (черный, [TPP+]). Стрелки указывают на добавление TPP+, митохондрий, олигомицина и CsA. Показаны пороговые значения высокого, среднего и низкого напряжения относительно калибровочного уровня TPP+ 2 мкМ. Показано добавление CsA при высоком (A) и низком (B) порогах напряжения. (C) Увеличенный участок кривых потребленияO2 (верхний) и ΔΨ (нижний) в (A) и (B) в точке добавления CsA, иллюстрирующий закрытый mPTP (красный) при высоком ΔΨ (нечувствителен к CsA) и открытый mPTP (черный) при низком ΔΨ (чувствительный к CsA). (D) Сводные графики открытого и закрытого состояния mPTP при высоком, низком и промежуточном ΔΨ показаны для элементов управления FVB (черный) и Fmr1 KO (серый). От пяти до 11 животных оценивались при каждом пороге ΔΨ; Значения p были рассчитаны с использованием хи-квадратного теста, *p < 0,05. Сокращения: ΔΨ = митохондриальный мембранный потенциал; mPTP = переходная пора митохондриальной проницаемости; TPP+ = тетрафенилфосфоний; mito = митохондрии; олиго = олигомицин; CsA = циклоспорин А; ΔΨ = ; НОКАУТ = нокаут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Компонент МИ/БСА* СБ/БСА* Разбавитель градиента плотности РБ/БСА*
Маннитол 225 мМ - - -
Сахароза 75 мМ 250 мМ 1 М 200 мМ
ХЕПЕС 5 мМ 5 мМ 50 мМ 5 мМ
ЭГТА 1 мМ 0.1 мМ 10 мМ -
ККл - - - 25 мМ
KH2PO4 - - - 2 мМ
МгКл2 - - - 5 мМ
рН** 7.4 7.4 - 7.2
БСА*** 0.10% 0.10% - 0.02%
АП5А*** - - - 30 мМ

Таблица 1: Буферы и растворы.
* Фильтр через фильтры 0,2 мкм
** Отрегулируйте pH с 3 М гидроксида калия по мере необходимости.
Обозначает буферные компоненты, которые добавляются непосредственно перед выделением митохондрий.
Сокращения: MI = буфер изоляции митохондрий; SB = буфер сахарозы; RB = буфер дыхания; BSA = не содержащий жирных кислот бычий сывороточный альбумин; HEPES = 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота; EGTA = этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота; KCl = хлористый калий; KH2PO4 = дигидрофосфат калия; MgCl2 = хлорид магния; AP5A = P1,P5-диаденозин-5' пентафосфат пентанатрий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данной работе описан метод оценки открытой вероятности mPTP. В частности, порог напряжения для открытия mPTP с низкой проводимостью определяли путем оценки влияния ингибирования CsA на утечку протонов в диапазоне ΔΨs. Используя этот метод, мы смогли бы идентифицировать различия в напряжении mPTP между мышами FXS и элементами управления FVB в соответствии с их различиями в содержании CoQ, специфичном для ткани. Решающее значение для успеха этой методологии имеет то, что митохондрии недавно выделены перед использованием и имеют хорошее качество. Митохондрии, которые либо повреждены во время изоляции, либо слишком стары, не смогут генерировать соответствующий ΔΨ и, как правило, будут отсоединены. Обратите внимание, что в то время как рН матрицы обычно способствует движущей силе протона, нигерицин используется для коллапса ΔpH через ИММ в этих экспериментах, как ранее описано в стандартных протоколах оценки утечки протонов29. Поэтому в данном случае движущая сила протона эквивалентна ΔΨ, что упрощает экспериментальный подход.

Другим важным соображением является то, что некоторые из ингибиторов, используемых в смеси дыхания (такие как ротенон, олигомицин и CsA), трудно смыть между экспериментами, поскольку они прилипают к пластиковым поверхностям реакционной камеры, включая ионселективные электроды. Камера должна быть регулярно промыта этанолом и суспензией грубо подготовленных замороженных митохондрий, чтобы «вычистить» эти ингибиторы из камеры и снизить вероятность переноса ингибиторов, что может повлиять на воспроизводимость экспериментов.

Поскольку митохондрии должны быть свежеподготовлены для поддержания их целостности, этот метод не поддается высокопроизводительному анализу. Кроме того, для каждого эксперимента требуется относительно большое количество митохондрий. Как правило, для животных P10 из одного органа может быть выделено достаточно митохондрий для проведения одного эксперимента. Поэтому тестирование различных условий на одной и той же партии митохондрий обычно невозможно. Если эксперименты проводятся с пожилыми животными, это ограничение является меньшей проблемой, учитывая относительно больший размер тканей и органов.

Существует ряд хорошо описанных методов для изучения открытой вероятности mPTP в изолированных интактных митохондриях. Методы, такие как набухание митохондриального матрикса и анализы нагрузки кальция или ретенционной способности, обязательно вызывают высокопроводящую ПТ и, таким образом, не позволяют изучать физиологические открытия с низкой проводимостью, что представляет интерес в этих экспериментах28. Патч-зажимная техника обеспечивает мощный и прямой метод исследования зависимости напряжения состояний высокой или низкой проводимости mPTP31,32. Тем не менее, это трудоемкий метод, где одновременно можно изучать только одну митохондрию и одно экспериментальное состояние, что затрудняет сравнительные исследования32,33.

Кроме того, внешняя митохондриальная мембрана обычно лизируется, а внутренняя митохондриальная мембрана обычно разрывается в методах зажима пластырей, используемых для изолированных митохондрий, что может привести к потере регуляторных факторов mPTP, которые не тесно связаны с IMM31. Низкопроводящее открытие mPTP также было изучено с использованием различных методов флуоресценции, обычно использующих эфир тетраметилродамина (для оценки изменений ΔΨ) либо отдельно, либо в сочетании с кальциином, чья интрамитохондриальная флуоресценция восприимчива к закалке кобальта, когда mPTP открыт 8,34. Однако в подходах, основанных на флуоресценции, поскольку изменения в ΔΨ выражаются как относительные изменения флуоресценции, этот подход обычно не позволяет точно измерить ΔΨ 8,34.

Этот метод обеспечивает новый альтернативный подход к оценке низкопроводящего открытия mPTP по отношению к ΔΨ. Используя этот подход, исследователи могут изучать регуляцию физиологического и патологического измерения напряжения mPTP. Этот метод также обещает помочь понять роль mPTP в развитии в созревании органов, поскольку он может быть применен к различным тканям и различным стадиям развития. Этот подход может быть легко применен для изучения напряжения mPTP в ткани переднего мозга мыши FXS, которая ранее демонстрировала снижение уровня CoQ25. Кроме того, мы предполагаем, что этот метод также может быть использован для изучения того, как другие агенты, эндогенные или экзогенные, влияют на напряжение мПТП. Таким образом, он окажется полезным инструментом для расширения понимания вклада mPTP в здоровье и болезни.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается следующими грантами: NIH/ NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Премия Медицинского центра Ирвинга Колумбийского университета Цель возможностей Provost для отделения анестезиологии (K.K.G.), Общество детской анестезии Young Investigator Research Award (K.K.G.) и NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific 15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 PP systems 941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. Fisher Scientific 14-170-11B to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free Sigma A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm World Precision Inst. LLC DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips World Precision Inst. LLC KWIK-2  ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA) Sigma 324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk Cole-Parmer EW-07938-30 microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle Cole-Parmer EW-07938-02 microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete PP systems OXYTHERM+R oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma 1374248
Mannitol Sigma M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) Sigma D4022-10MG
Percoll Sigma P1644 medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl) Sigma P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma 5.43841
Sucrose Sigma S0389
TPP+ Electrode Tips (3) World Precision Inst. LLC TIPTPP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
  2. Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
  3. Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. Molecular Biology of the Cell. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).
  4. Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
  5. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
  6. Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
  7. Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
  8. Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
  9. Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
  10. Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
  11. Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
  12. Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
  13. Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
  14. Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
  15. Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
  16. Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
  17. Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
  18. Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
  19. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  20. Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
  21. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
  22. Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
  23. Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
  24. Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
  25. Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
  26. Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
  27. Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).
  28. Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
  29. Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).
  30. Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).
  31. Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
  32. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
  33. Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
  34. Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).

Tags

Биология выпуск 184
Оценка открытой вероятности поры перехода митохондриальной проницаемости в условиях избытка коэнзима Q
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. … More

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. J. Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess. J. Vis. Exp. (184), e63646, doi:10.3791/63646 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter