Summary
نحن نصف بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري وتمايزها في سلالة العضلات الهيكلية.
Abstract
يعتمد استكشاف الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية الوسيطة على سهولة العزلة والفعالية نحو التمايز وموثوقية ومتانة المصدر. نصف هنا بروتوكولا تدريجيا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة عن أنسجة الحبل السري البشري (uMSCs) ، وتنميطها المناعي ، وانتشار هذه الثقافات عبر عدة ممرات. في هذا الإجراء ، تكون صلاحية uMSCs عالية لأنه لا يوجد هضم إنزيمي. علاوة على ذلك ، فإن إزالة الأوعية الدموية ، بما في ذلك شرايين الحبل السري والوريد ، تضمن عدم وجود تلوث للخلايا ذات الأصل البطاني. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تكون uMSCs عند العزل CD45−CD34− ، مما يشير إلى عدم وجود خلايا من سلالة المكونة للدم. الأهم من ذلك ، أنها تعبر عن علامات السطح الرئيسية ، CD105 ، CD90 ، و CD73. عند إنشاء الثقافات ، تصف هذه الورقة طريقة فعالة للحث على التمايز في هذه uMSCs في سلالة العضلات الهيكلية. يكشف تحليل مفصل للتقدم العضلي في uMSCs المتمايزة أن uMSCs تعبر عن Pax7 ، وهي علامة للأسلاف العضلية المنشأ في المراحل الأولية من التمايز ، تليها التعبير عن MyoD و Myf5 ، وأخيرا ، علامة تمايز طرفية ، سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC).
Introduction
يعود الفضل إلى الحبل السري البشري في امتلاك خزان قوي من الخلايا الجذعية الوسيطة ، والتي يتم استكشافها حاليا للعلاجات التجديدية بسبب معدلات انتشارها وتمايزها القوية ، وخصائصها المناعية ، وقدرتها على توليد الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث1. يتكون نسيج الحبل السري من مقصورات متعددة مثل دم الحبل السري، وبطانة الوريد السري الفرعية، وهلام وارتون (WJ)، والذي يشمل في حد ذاته ثلاث مناطق غير واضحة - المنطقة المحيطة بالأوعية الدموية، والمنطقة بين الأوعية الدموية، والسلى الفرعي أو بطانة الحبل السري (CL)2. في حين يمكن عزل uMSCs عن كل هذه المناطق المختلفة والتعبير على نطاق واسع عن علامات MSC الرئيسية ، لا يوجد وضوح حول ما إذا كانت هذه المقصورات تحتوي على نفس عدد السكان من uMSCs أو تعرض اختلافات في قدرات التمايز الخاصة بها3. وبالتالي ، تتطلب بروتوكولات عزل uMSCs دقة أكبر في أسلوبها ومنطقة عزلتها ، والتوصيف القوي لإمكانات التمايز ، وأخيرا ، تحليل مقارن من مقصورات مختلفة من الحبل.
في هذا السياق ، أظهرت دراسات قليلة اختلافات في إمكانات uMSC التكاثرية والتفاضلية بين أجزاء مختلفة من الحبل. ومن بين هذه الوسائل، كشفت التحليلات المقارنة بين uMSCs المعزولة من منطقتي CL و WJ عن إمكانات تكاثرية أكبر في uMSCsالمشتقة من CL 3,4. وفي دراسة منفصلة، كان أداء uMSCs المشتقة من WJ أفضل في مقايسات الانتشار مقارنة بالخلايا المحيطة بالأوعية الدموية (HUCPV)5. عند فحص الاختلافات بين uMSCs المشتقة من دم الحبل السري و uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل السري الخالية من تلوث الأوعية الدموية ، تم الإبلاغ عن التعبير التفاضلي لعلامات MSC الرئيسية بين المقصورتين ، بالإضافة إلى زيادة معدلات الانتشار في uMSCs المشتقة من أنسجة الحبلالسري 6.
من بين العديد من الدراسات التي تدرس إمكانات التمايز ل uMSCs في المقام الأول في أنسجة سلالة الأديم المتوسط مثل السلالات العظمية والشحمية والغضروفية ، قدم عدد قليل جدا بروتوكولات مفصلة للتمايز العضلي والتوصيف اللاحق ، بالإضافة إلى تحليلات مقارنة بين مقصورات الحبل المختلفة. في هذا السياق ، قمنا بتطوير بروتوكول قوي لتمايز العضلات ولاحظنا أن uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل السري تظهر قدرات تمايز عضلي المنشأ متفوقة مقارنة بدم الحبل السري6. هنا ، يتم تفصيل بروتوكول تدريجي لعزل uMSCs عن أنسجة الحبل السري بأكملها الخالية من الخلايا المرتبطة بالأوعية الدموية ، وتوصيفها ، وتمايزها في السلالة العضلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على استخدام أنسجة الحبل السري في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لأبحاث الخلايا الجذعية (IC-SCR) ، ولجنة الأخلاقيات المؤسسية ، ومعهد العلوم والتكنولوجيا الصحية الانتقالية (IEC-THSTI) ، ولجنة الأخلاقيات المؤسسية للمستشفى المدني ، جوروجرام ، هاريانا ، واللجنة المؤسسية للسلامة البيولوجية ، THSTI. تم حصاد عينات أنسجة الحبل السري البشري من الولادات الأجل في وقت الولادة. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من الأشخاص . تم تنفيذ جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.
1. عزل MSCs من أنسجة الحبل السري
- في وقت التسليم ، اقطع ما لا يقل عن 5 سم من الحبل ، ويفضل أن يكون أقرب إلى المشيمة ، وقم بتعقيم الحبل عن طريق مسح السطح الخارجي بنسبة 70٪ من الإيثانول. انقل قطعة أنسجة الحبل السري بالتتابع من أنبوب تجميع سعة 50 مل يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى أنبوب آخر يحتوي على نفس الشيء. انقل أنبوب التجميع الذي يحمل اسم الشخص على الجليد إلى المختبر في غضون 1 ساعة.
ملاحظة: بالنسبة لدراسة أكبر، قد يكون من المفيد ترميز العينات بالباركود لتمكين تتبعها طوال فترة الدراسة. الأهم من ذلك ، يجب أن يعرض على جميع الموظفين الذين يتعاملون مع الأنسجة البشرية النظام الكامل للقاح التهاب الكبد B. - في المختبر، قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 25 دقيقة في غطاء محرك السيارة BSL-2 لتعقيم الأدوات والماصات المعقمة قبل الاستخدام.
- انقل قطعة أنسجة الحبل السري من أنبوب التجميع إلى طبق معالج بزراعة الأنسجة بحجم 10 سم 2 يحتوي على PBS غني بجلوكوز 5 جم / لتر ، وجنتاميسين 50 ميكروغرام / مل ، و2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B ، و 100 U / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (مخطط في الشكل 1).
- باستخدام مشرط ، قم بتقطيع أنسجة الحبل عموديا على طول محورها الطولي للحصول على قطعتين نصف أسطوانيتين. بسبب التواء الحبل والسطح المخاطي ، قم بتثبيت الأنسجة بزوج من الملقط في اليد الأخرى.
- عند هذه النقطة، راقب الشرايين والوريد السري وأزل الأوعية الدموية باستخدام مشرط لكشطها في اتجاه واحد من السطح. شطف أنسجة الحبل السري مرة أخرى في PBS لإزالة جميع الدم المتبقي المرتبط بالأنسجة. تأكد من أن الكشط لطيف للحفاظ على سلامة الخلايا في WJ المحيطة بالأوعية.
- افرم كل نصف من أنسجة الحبل السري إلى شظايا بحجم 0.5 سم3 سم وضع الشظايا مع السطح المضيء المواجه لأسفل على الطبق. احتضن الطبق لفترة وجيزة لمدة 10 دقائق في غرفة رطبة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2.
- بعد الحضانة ، قم بإغراق الطبق الذي يحتوي على قطع أنسجة الحبل السري ب 20 مل من الوسط الذي يحتوي على تعديل MEM Alpha بدون L-glutamine و ribo- و deoxyribonucleosides ، و 15٪ مصل بقري جنيني (غير معطل حراريا) ، و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين. أضف وسط النمو بلطف على طول الجانبين لمنع إزالة الأنسجة من اتجاهها. أضف الوسط الزائد لحساب جزء سيتم امتصاصه بواسطة الأنسجة أثناء الحضانة.
- بعد 3 أيام من الحضانة ، أضف وسيطا طازجا إلى الثقافات. تأكد من حماية الثقافات من الصدمات وحركة النباتات أثناء التعامل مع الأطباق.
- بعد 1 أسبوع ، قم بإزالة شظايا الأنسجة بشكل فردي باستخدام ملقط معقم وتخلص منها باستخدام أكياس المخاطر البيولوجية المناسبة للتخلص منها. احتفظ بالوسط الموجود وأضف 10 مل من وسط النمو الطازج. استبدل وسيط النمو كل 4 أيام حتى تصل المستعمرات الفردية إلى التقاء 70٪.
ملاحظة: من المحتمل ألا يتم توزيع الخلايا بشكل موحد في جميع أنحاء الطبق ، حيث ستكون هناك مستعمرات تكاثرية فردية تحتاج إلى مراقبة الالتقاء مع مرور الوقت. بشكل عام ، في غضون شهر ، يولد طبق 10 سم2 خلايا كافية ليتم تقسيمها إلى طبق منفصل. - حصاد الخلايا الملتصقة باستخدام محلول التربسين / EDTA (1x 0.25٪ التربسين و 0.02٪ EDTA في محلول الملح المتوازن Hanks [HBSS]). الطرد المركزي تعليق الخلية في 470 × غرام لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية وإعادة تعليق بيليه الخلية في وسط النمو.
2. التنميط المناعي وانتشار uMSCS
- انتقل إلى التنميط المناعي بمجرد أن تصل الخلايا الملتصقة إلى التقاء 50٪ -60٪ وتنتشر بشكل جيد. لا تقم بإجراء تحليل علامة MSC على الثقافات المتقاربة بالكامل ، لأن هذا يميل إلى التسبب في انخفاض تنظيم علامات MSC الرئيسية.
- بعد التربسين ، قم بتوزيع تعليق خلوي من 1 × 106 خلايا / مل في أنابيب FACS (1 × 105 خلايا / أنبوب) ووصمة عار بالأجسام المضادة المناسبة المرتبطة بالفلوروفور (كل تخفيف 1:50) في تركيبة : غير ملطخة ؛ CD105 + CD90 ؛ CD105 + CD73 ؛ CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (الفلوروفور الشائع) ؛ ضوابط النمط المتماثل لكل فلوروفور. سجل عددا إجماليا من الأحداث لا يقل عن 10000 على مقياس التدفق الخلوي لمزيد من التحليل.
ملاحظة: نظرا لأنه يتم تحليل الخلايا لكل علامة سطح على حدة، فإن البوابات على المجموعات الفرعية للخلايا غير مطلوبة. - بالإضافة إلى العلامات المذكورة أعلاه ، تأكد من وجود علامات سطح إيجابية وسلبية في خطوط uMSC التي تم إنشاؤها من عينات أنسجة الحبل السري الفردية (الجدول 1).
- تحليل الخلايا المصنفة بواسطة قياس التدفق الخلوي وتحديد النسبة المئوية لخلايا CD105 + CD90 + و CD105 + CD73 +. تحليل خلايا CD105+ وCD34−CD45− بشكل منفصل.
3. تمايز uMSCs إلى العضلات الهيكلية
- قم بتغطية ألواح زراعة الأنسجة ب 0.01٪ من الكولاجين و 20 ميكروغرام / مل من اللامينين في PBS. قم بتغطية هذه اللوحات لمدة لا تقل عن 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
- لوحة uMSCs بكثافة 10000 خلية / سم2 في وسط النمو.
- عندما تكون الخلايا ملتقية بنسبة 70٪ ، قم بشفط وسط النمو وشطف الثقافات 2x باستخدام PBS. أضف وسط التمايز العضلي المنشأ (M1) الذي يتكون من DMEM + مصل الحصان 5٪ + 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون + 50 ميكرومتر هيدروكورتيزون إلى uMSCs. لتحديد حركية التقدم العضلي ، أضف وسط M1 كل يوم إلى الثقافات.
- لتحديد حركية التقدم العضلي ، قم بتحليل uMSCs ل Pax7 و MyoD و Myogenin وتعبير MyHC في يومين و 4-5 أيام و 6-7 أيام و 10-14 يوما ، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نجاح عزل uMSCs من أنسجة الحبل السري هو >95 ٪ ، على عكس معدلات النجاح الضعيفة من دم الحبل السري الكامل. عند العزل الناجح ل uMSCs ، يكشف تحليل FACS أن جميع الخلايا هي CD34−CD45−CD105+CD90+. ومع ذلك ، في التحليل المقارن ، تظهر uMSCs المعزولة من دم الحبل السري مجموعات غير متجانسة ، حيث تظهر نسبة من الخلايا CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15٪). بالإضافة إلى ذلك ، فإن CD105 + CD90 + ذات الموجب المزدوج أقل عددا (~ 5٪) (الشكل التكميلي S1). هذا يؤدي إلى انخفاض مستويات التمايز العضلي بين uMSCs من دم الحبل السري ، حيث أن كل من تعبير CD105 و CD90 مطلوبان لتحريض تكوين العضلات. تعرض uMSCs أيضا تعبير العلامات المدرجة في الجدول 1. إذا كان هناك تلوث في uMSCs المشتقة من دم الحبل السري ، فسيكون هناك أيضا وجود لخلايا CD34 + CD45 +. هذا يؤدي إلى تعداد الخلايا الكاذبة للطلاء للتمايز العضلي. هناك مؤشر على أن >90٪ من الخلايا إيجابية مزدوجة لتعبير CD105 و CD90 هو أن uMSCs لم تلتزم بأي سلالة من الجلد المتوسط وتستمر في البقاء متعددة القدرات ، حيث يتم تنظيم كل من تعبير CD105 و CD90 عند التمايز. من الضروري استخدام علامات متعددة لتأكيد الأنماط الظاهرية uMSC ، حيث لا توجد علامة uMSC نهائية واحدة. في هذا التحليل ، قمنا بتقييم وجود جميع العلامات المدرجة في الجدول 1 لكل خط من خطوط uMSC المنشأة في المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، حددنا الحالة الإيجابية المزدوجة ل CD105 و CD90 (الشكل 2A) ، وكذلك CD105 و CD73 (الشكل 2B) ، مما يضمن أن uMSCs تعبر عن علامات رئيسية متعددة. هذا ضروري لتجنب تلويث الخلايا الموجبة المفردة الموجودة بأعداد أقل من 0.05٪.
الشكل 1: مخطط يوضح العزل التدريجي وتوصيف uMSCs من أنسجة الحبل السري. اختصار: uMSCs = الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل علامة MSC في uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل . (A) تعرض uMSCs التعبير عن CD105 و CD90 ولا تعبر عن علامات المكونة للدم ، CD34 و CD45. يتم عرض مخططات FACS التمثيلية لثلاثة خطوط uMSC (UCT15 و UCT18 و UCT26) (N = 16). يعرض الصف العلوي من اللوحات الخلايا الموجودة في جميع أسطر uMSC الثلاثة في الربع Q2 موجبا لتعبير CD105 وCD90. يعرض الصف السفلي من اللوحات الخلايا في الربع Q1 موجبا لتعبير CD105 وسالبا لتعبير CD34 وCD45. (B) تعرض uMSCs تعبير علامة MSC ، CD73 (N = 16). اختصار: uMSCs = الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| علامات uMSC الإيجابية | علامات uMSC السلبية |
| CD105 | CD34 |
| CD90 | CD45 |
| CD73 | CD106 |
| CD29 | هلا دكتور |
| CD44 | CD31 |
| هلا إيه بي سي | CD14 |
| CD49e | CD49e |
| CD54 | |
| CD13 |
الجدول 1: قائمة العلامات الإيجابية والسلبية ل uMSCs. اختصار: uMSCs = الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري.
من أجل تمايز uMSCs إلى السلالة العضلية ، تعبر uMSCs عادة عن Pax7 ، وهي علامة لخلايا السلائف خلال أول يومين من إضافة M1 ، تليها MyoD خلال الأيام الأربعة الأولى من إضافة M1 (الشكل 3). في 6 أيام من التمايز ، تعبر الخلايا عن بروتين الميوجينين ، يليه التعبير عن سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) بين 10 أيام و 14 يوما من تحريض التمايز. لقد ميزنا بمزيد من التفصيل حركية التعبير العضلي باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي ، وقياس التدفق الخلوي ، والكيمياء المناعية ، و RT-PCR ، وتحليل اللطخة الغربية لتوثيق التعبير المرحلي للعلامات العضلية المنشأ ، مما يؤكد متانة هذا البروتوكول. كشف التسلسل النسخي للجينوم الكامل بين uMSCs غير المتمايزة و uMSCs التي تم تمييزها إلى عضلات هيكلية عن تنظيم 907 جينات استجابة لتحريض التمايز العضلي المنشأ (الشكل 4).
الشكل 3: تمايز uMSCs إلى عضلات هيكلية . تم استزراع uMSCs في وسط M1 لمدة يومين و 4 أيام و 7 أيام و 10 أيام وتم تقييمها ل (A) Pax7 بعد يومين ، (B) MyoD بعد 4 أيام ، (C) تعبير Myogenin من خطوط uMSC مختلفة ، يشار إليها ب T8 و T12 و T14 و T25 بعد 7 أيام ، و (D) MyHC بعد 10 أيام. أشرطة المقياس = (B، D) 50 ميكرومتر. الاختصارات: uMSCs = الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري. GAPDH = نازعة هيدروجيناز الجلسرالدهيد 3-فوسفات. MyoD = بروتين تحديد اللاستيدات العضلية 1 ؛ MyHC = سلسلة الميوسين الثقيلة. DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; Mb = الأرومة العضلية; MT = أنبوب عضلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التنميط النسخي المقارن ل uMSCs المشتقة من دم الحبل السري وأنسجة الحبل السري المتمايزة إلى عضلات هيكلية. خريطة حرارية للأعداد الطبيعية من 907 جينات بين uMSCs الضابطة و uMSCs المتباينة إلى عضلات هيكلية لمدة 7 أيام من دم الحبل السري وأنسجة الحبل السري. يوضح مخطط فين (يسار) عددا أكبر من الجينات العضلية المنشأ التي تم تنظيمها في uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل السري مقارنة ب uMSCs المشتقة من دم الحبل السري. يوضح الجدول أدناه الجينات العضلية الشائعة التي تم تنظيمها في كل من أنسجة الحبل السري ودم الحبل السري. هذا الرقم مأخوذ من Mishra et al.6. الاختصارات: 1, 2 = النسخ المتماثلة البيولوجية; CB1,2 = الخلايا العضلية المنشأ المشتقة من uMSCs من دم الحبل السري; CT1 ، 2 = الخلايا العضلية المشتقة من uMSCs من أنسجة الحبل السري ؛ coB1,2 = التحكم في uMSCs غير المتمايزة من دم الحبل السري ؛ coT1 ، 2 = التحكم في uMSCs غير المتمايزة من أنسجة الحبل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لأغراض إجراء تحليل مقارن ، قارنا uMSCs المعزولة من دم الحبل السري وأنسجة الحبل السري. كشفت بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أن هناك جينات عضلية المنشأ تم تنظيمها في uMSCs من الخلايا العضلية المشتقة من أنسجة الحبل السري أكثر من تلك المشتقة من دم الحبل السري (الشكل 4). يتم تحميل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المستخدمة لدعم هذه الدراسة إلى NCBI (الانضمام إلى SRA هو GSE147114). باختصار ، حدد التحليل النسخي الخاص بالأنسجة باستخدام قاعدة بيانات PANTHER GO-slim البروتينات الخلوية الهيكلية المرتبطة بربط الأكتين وتجميع الساركومير (TPM2 ، LDB3 ، PDLIM3 ، FHL1 ، NEXN ، MYOM1) المرتبطة بوظيفة الانقباض (RTN2 ، SLC19A2 ، ACHE ، SCN1B ، SLC19A2 ، JPH2 ، KCNJ12 ، ANKRD1) ، صيانة كتلة العضلات ( FBXO32 و TRIM16L و GHRوإشارات الكالسيوم (FKBP5) والوظيفة الأنزيمية (COX7A1 و PDK4) (الشكل 4). إجمالا ، تظهر هذه البيانات أن uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل تمثل حجرة تعرض إمكانات عضلية قوية.
نظرا للتباين الفردي بين خطوط uMSC التي قد تنشأ عن الكفاءة في عزلة ، وعدم التجانس داخل حجرة uMSC ، وعمر الأم ، والحالة الصحية للأم ، بما في ذلك مستويات المغذيات لديها ، قد تكون هناك اختلافات في معدلات الانتشار والإمكانات العضلية بين خطوط uMSC الراسخة. ومع ذلك ، على الرغم من الاختلافات في حركية التعبير ، يتم الحفاظ على الاتجاه العام لزيادة myogenicity مع التعبير المرحلي للعلامات myogenic.
الشكل التكميلي S1: تحليل علامة MSC في uMSCs المشتقة من دم الحبل السري. تعرض uMSCs تعبير CD105 وعلامات المكونة للدم ، CD34 و CD45. يظهر تحليل مجموعة CD105+ أن نسبة صغيرة فقط من هذه الخلايا تشارك في التعبير عن CD90 (N = 5). اختصار: uMSCs = الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في جمع الأنسجة في ظل ظروف معقمة ، من وقت التسليم إلى صيانة الثقافات المعقمة ، طوال مدة الانتشار. أثناء جمع الحبل ، من الضروري ألا يلمس الحبل أي سطح غير معقم ويتم مسحه خارجيا بالإيثانول بنسبة 70٪ قبل جمعه في أنابيب تحتوي على PBS مكملة بالمضادات الحيوية. من المهم تحديد الوقت بين جمع الحبل ومعالجة الأنسجة لعزل uMSC. في حالة وجود حاجة لنقل الأنسجة من موقع التجميع إلى المختبر ، يجب توخي الحذر للحفاظ على الأنسجة في المخازن المؤقتة المحتوية على المضادات الحيوية وتخزينها على الجليد.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في الطريقة
التعديل الرئيسي في هذا البروتوكول للحث على التمايز العضلي المنشأ ل uMSCs هو طلاء الأطباق ب 0.01٪ من الكولاجين من النوع 1 و 20 ميكروغرام / مل من اللامينين. لاحظنا أن التقدم العضلي في uMSCs في وجود وسط M1 يتم تعزيزه عندما يتم تعديل ظروف الالتصاق أيضا. يجب اختبار ما إذا كان استخدام مصفوفات أخرى متفوقة ، وإن كانت باهظة الثمن ، مثل Matrigel قد يزيد من تحسين هذا البروتوكول. قد تؤدي الاختلافات في العائد بين العينات الفردية إلى قيام بعض الأنسجة بتوليد عدد أقل من الخلايا. في مثل هذه الحالات ، قد يكون من الأفضل جمع طول أكبر من أنسجة الحبل السري يبلغ >5 سم. في هذا السياق ، استخدمت تقارير قليلة 10 سم من أنسجة الحبل السري لزيادة غلة uMSCs. استخدمت غالبية التقارير التي تصف عزل uMSCs من أنسجة الحبل السري الإنزيمات المتدهورة خارج الخلية لزيادة إطلاق الخلايا من سدى الحبلالسري 3،5،7،8. وقد أظهر استخدام الثقافات الخارجية من قبل عدد قليل من الدراسات ، بما في ذلك هذا التقرير ، باستمرار زيادة الجدوى الخلوية والعائد6،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم الحاجة إلى إجراء فرز الخلايا لتنقية مجموعات الخلايا ، والتي غالبا ما يتم تضمينها في تنقية uMSCs من دم الحبل السري ، يزيد من الأعداد الخلوية والنزاهة.
قيود الطريقة
أحد القيود الرئيسية لهذه الطريقة هو الوقت اللازم للإنشاء الكامل لخطوط uMSC من عينات أنسجة الحبل السري الفردية. عادة ، هناك حاجة إلى 3 أسابيع لإنشاء كل سطر uMSC باستخدام هذا البروتوكول. بعد ذلك ، هناك حاجة إلى 2 أسابيع للتمايز العضلي الكامل. يمكن أن تكون هذه المدة الطويلة للتحقيق مرهقة في مجموعات كبيرة تدرس إمكانات التمايز ل uMSCs من مختلف المشاركين ، بهدف الحصول على معلومات حول الوسط داخل الرحم أو التنبؤ بالمعلمات الأيضية للأعضاء النسلية مثل تكوين الجسم. القيد الثاني هو عدم التجانس داخل مصفوفة أنسجة الحبل السري ، والتي قد تمتلك اختلافات ظاهرية جوهرية بين مقصورات uMSC المختلفة والتي يمكن أن تكون مسؤولة عن إمكانات التمايز بين المصادر المختلفة. على سبيل المثال ، تعرض uMSCs من WJ إمكانات عظمية أقل مقارنة ب uMSCs11 المشتقة من CL. لذلك ، لا تصف هذه الطريقة الاختلافات المتأصلة بين المقصورات المختلفة داخل أنسجة الحبل السري نفسها.
أهمية الطريقة فيما يتعلق بالطرق الحالية
باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا الحصول على عدد خلايا من 1 × 104 إلى 1 × 106 uMSCs من عينات أنسجة الحبل السري الفردية. يمكن استخدام خطوط uMSC هذه بشكل موثوق للمقايسات لما لا يقل عن 6-8 مقاطع. على الرغم من مدى التباين في الأنماط الظاهرية الخلوية النموذجية للسكان البشريين ، فإن متوسط الوقت المضاعف ل uMSCs الذي لوحظ في مجموعتنا المكونة من 15 امرأة من شمال الهند كان أقل من يومين6. أظهر تحليل لمعدلات تكاثرها باستخدام دمج 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) أن 80٪ على الأقل من الخلايا قد مرت بالمرحلة S في فترة 6 ساعاتو 6. بالإضافة إلى ذلك ، تعرض uMSCs من أنسجة الحبل السري أيضا معدلات شيخوخة منخفضة ، مما يشير إلى متانة طريقة العزل هذه6. لقد قارنا سابقا درجة الحث العضلي المنشأ في uMSCs باستخدام هذا البروتوكول مع تلك المستخدمة للحث على تكوين العضلات في الخلايا الجذعية البشرية والفئرانية متعددة الإمكانات 6,12. وجدنا أن هذا البروتوكول هو محفز أكثر فعالية للتمايز العضلي من البروتوكولات الحالية.
أهمية الطريقة والتطبيقات
تعتمد العلاجات الخلوية والتجديدية الناجحة على الجدوى الخلوية والعائد ، مما يتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا من الممرات المبكرة. وبالتالي ، توفر هذه الطريقة بديلا مناسبا للتطبيقات السريرية. إن بروتوكول التمايز العضلي القوي المقدم في هذا التقرير والتوصيف الجزيئي المتعمق للتطور العضلي باستخدام هذا البروتوكول في عملنا يكملان الجهود المبذولة لتلخيص تكوين عضل الجنين ويمكن استخدامه كنموذج لمحاكاة البيئة داخل الرحم ويعكس عملية التمثيل الغذائي بعد الولادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
ونشكر السيد أوخاس تيكو على مساعدته في التصوير وإنتاج الفيديو. كما نعترف بالمساعدة التي تلقيناها من موظفي GARBH-Ini (المجموعة متعددة التخصصات المعنية بالبحوث المتقدمة ونتائج الولادة - DBT India) والممرضات وكبار مسؤولي الأبحاث في مستشفى Gurugram المدني والدكتور Pallavi Kshetrapal للمساعدة في الخدمات اللوجستية. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة إلى سوتشيترا جوبيناث من إدارة التكنولوجيا الحيوية، الهند (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
