Summary
ヒト臍帯組織から間葉系幹細胞を単離し、骨格筋系統に分化させるためのプロトコルについて説明する。
Abstract
間葉系幹細胞の治療可能性を探ることは、単離の容易さ、分化に対する効力、および供給源の信頼性と堅牢性にかかっています。ここでは、ヒト臍帯組織(uMSC)から間葉系幹細胞を単離するための段階的なプロトコール、それらの免疫表現型決定、およびいくつかの継代にわたるそのような培養物の増殖について記述する。この手順では、酵素消化がないためuMSCsの生存率は高い。さらに、臍帯動脈および静脈を含む血管の除去は、内皮起源の細胞の汚染がないことを確実にする。フローサイトメトリーを用いて、単離時のuMSCはCD45−CD34−であり、造血系統からの細胞の不在を示す。重要なことに、それらは重要な表面マーカー、CD105、CD90、およびCD73を表現します。培養物の樹立に際し、本稿では、これらのuMSCを骨格筋系統に分化誘導する効率的な方法を記載する。分化したuMSCにおける筋原性進行の詳細な分析により、uMSCは分化の初期段階において筋原性前駆細胞のマーカーであるPax7を発現し、続いてMyoDおよびMyf5の発現、そして最後に終末分化マーカーであるミオシン重鎖(MyHC)を発現することが明らかになった。
Introduction
ヒト臍帯は、間葉系幹細胞の堅牢な貯蔵庫を有すると信じられており、それらは、その堅牢な増殖および分化速度、免疫調節特性、および3つの胚葉すべてから細胞を生成する能力のために、現在再生療法のために探求されている1。臍帯組織は、臍帯血、臍帯静脈下内皮、ウォートンゼリー(WJ)などの複数の区画からなり、それ自体が血管周囲ゾーン、血管間ゾーン、および羊膜下またはコードライニング(CL)2の3つの不明瞭な領域を包含する。uMSCはこれらすべての異なる領域から単離され、主要なMSCマーカーを広く発現することができるが、これらのコンパートメントが同じ集団のuMSCを含むのか、それともそれらの分化能に違いを示すのかについては明確ではない3。したがって、uMSCの単離のためのプロトコルは、その分離のモードおよび領域におけるより高い精度、分化電位の堅牢な特性評価、および最後に、コードの異なる区画からの比較分析を必要とする。
この文脈において、コードの異なる部分間のuMSC増殖性および分化電位の違いを実証した研究はほとんどない。これらのうち、CL領域およびWJ領域から単離されたuMSC間の比較分析は、CL由来uMSCs3,4においてより大きな増殖能を明らかにした。別の研究では、WJ由来のuMSCは、血管周囲細胞(HUCPV)と比較して増殖アッセイにおいてより優れた性能を発揮しました5。臍帯血由来uMSCと血管汚染を欠く臍帯組織由来uMSCの違いを調べる際に、2つのコンパートメント間で主要なMSCマーカーの差異発現が報告され、臍帯組織由来uMSCsの増殖速度が増加した6。
骨形成、脂肪原性、軟骨形成性系統などの中胚葉系譜の組織へのuMSCの分化能を調べたいくつかの研究のうち、筋原性分化およびその後の特徴付けのための詳細なプロトコル、ならびに様々なコードコンパートメント間の比較分析を提供した研究はほとんどない。この文脈で、我々は堅牢な筋肉分化プロトコルを開発し、臍帯組織由来uMSCsが臍帯血と比較して優れた筋原性分化能力を示すことを観察した6。ここでは、血管系に関連する細胞を欠いている臍帯組織全体からのuMSCの単離、それらの特徴付け、および筋原性系統への分化について、段階的なプロトコールが詳述されている。
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Protocol
この研究における臍帯組織の使用は、幹細胞研究のための機関委員会(IC-SCR)、機関倫理委員会、トランスレーショナルヘルス科学技術研究所(IEC-THSTI)、市民病院、グルグラム、ハリヤーナ州の機関倫理委員会、および施設バイオセーフティ委員会THSTIによって承認されました。ヒト臍帯組織サンプルは、出生時の期間分娩から採取した。インフォームド書面による同意が被験者から得られた。全ての方法は、関連するガイドライン及び規制に従って実施した。
1. 臍帯組織からのMSCの単離
- 送達時には、少なくとも5cmのコードを、好ましくは胎盤の近くに切断し、外表面を70%エタノールで拭いてコードを滅菌する。コード組織片を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む1つの50mL収集チューブから、それを含む別の収集チューブに順次移す。氷上の被験者の名前を冠した収集チューブを1時間以内に実験室に輸送する。
注: 大規模な試験では、サンプルをバーコード化して、試験全体を通して追跡できるようにすると便利な場合があります。重要なことに、ヒト組織を扱うすべての人員は、B型肝炎ワクチンの完全なレジメンを提供されるべきである。 - ラボでは、使用前にオートクレーブ処理された器具とピペットを滅菌するために、BSL-2フードでUVを25分間オンにします。
- コード組織片を収集チューブから、5 g/L グルコース、50 μg/mL ゲンタマイシン、2.5 μg/mL アンホテリシン B、100 U/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンで濃縮した PBS を含む 10 cm 2 組織培養処理ディッシュに移します (図 1 の模式 図)。
- メスを使用して、コード組織をその長手方向軸に沿って垂直にスライスし、2つの半円筒形片を得る。コードねじれと粘液状表面のために、もう一方の手で保持された一対の鉗子で組織をピン留めする。
- この時点で、臍帯動脈と静脈を観察し、メスを使って表面から一方向に掻き取って血管を取り除きます。臍帯組織をもう一度PBSですすぎ、組織に関連するすべての残留血液を除去します。容器を囲むWJ内の細胞の完全性を維持するために、掻き取りが穏やかであることを確認してください。
- 臍帯組織の各半分を0.5cm3サイズの断片に細かく刻み、管腔面を下に向けて皿の上に置きます。ディッシュを5%CO2を含む37°Cの加湿チャンバー内で10分間短時間インキュベートする。
- インキュベーション後、コード組織片を含むディッシュに、L-グルタミン、リボおよびデオキシリボヌクレオシドを含まないMEM Alpha修飾を含む20mLの培地、15%ウシ胎児血清(熱失活していない)、および50μg/mLゲンタマイシンを浸水させる。成長培地を側面に沿って穏やかに追加して、組織外植体がそれらの向きから外れるのを防ぎます。インキュベーション中に組織外植体によって吸収される画分を説明するために、過剰な培地を加える。
- 3日間の培養後、培養物に新鮮な培地を加える。皿を取り扱っている間、培養物が外植体の衝撃や動きから保護されていることを確認してください。
- 1週間後、滅菌鉗子を使用して組織断片を個別に除去し、廃棄のために適切なバイオハザードバッグを使用して廃棄する。既存の培地を保持し、10mLの新鮮な増殖培地を加える。個々のコロニーが70%の合流点に達するまで、4日ごとに増殖培地を交換する。
注:細胞は、時間の経過とともに合流するために監視する必要がある個々の増殖性コロニーが存在するため、ディッシュ全体に均一に分布しない可能性が高い。一般に、1ヶ月以内に、10cm2の皿は、別の皿に分割されるのに十分な細胞を生成する。 - トリプシン/EDTA溶液(ハンクス平衡塩溶液[HBSS]中の1x 0.25%トリプシンおよび0.02%EDTA)を使用して接着細胞を採取する。細胞懸濁液を470 × g で25°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを増殖培地に再懸濁した。
2. uMSCSの免疫表現型決定と伝播
- 接着細胞が50%〜60%の合流点に達し、十分に広がっていたら、イムノフェノタイピングに進みます。完全にコンフルエントな培養物ではMSCマーカー分析を実行しないでください。これは、主要なMSCマーカーのダウンレギュレーションを引き起こす傾向があるためです。
- トリプシン処理後、1×106 細胞/mLの細胞懸濁液をFACSチューブ(1×105 細胞/チューブ)に分配し、適切なフルオロフォア結合抗体(すべて1:50希釈)で染色する:染色なし;CD105 + CD90;CD105 + CD73;CD105;CD90;CD73;CD34 + CD45(一般的な蛍光色素分子);各蛍光色素分子のアイソタイプ制御。フローサイトメーターに少なくとも10,000のイベントの総数を記録し、さらに分析します。
注: 細胞は表面マーカーごとに個別に分析されるため、細胞サブセットのゲーティングは必要ありません。 - 上記のマーカーに加えて、個々の臍帯組織サンプルから作成されたuMSCラインにおける陽性および陰性表面マーカーの存在を確認する(表1)。
- 標識細胞をフローサイトメトリーで分析し、CD105+CD90+ およびCD105+CD73+ 細胞の割合を決定します。CD105+ 細胞とCD34-CD45-細胞を 別々に分析する。
3. uMSCの骨格筋への分化
- 組織培養プレートに0.01%コラーゲンと20μg/mLラミニンをPBSでコーティングする。これらのプレートを室温で最低4時間コーティングします。
- 増殖培地中でuMSCを10,000細胞/cm2 の密度でプレートする。
- 細胞が70%コンフルエントになったら、増殖培地を吸引し、培養物をPBSで2xすすいでください。DMEM+5%ウマ血清+0.1μMデキサメタゾン+50μMヒドロコルチゾンを含む筋原性分化培地(M1)をuMSCsに加える。筋原性進行の動態の決定のために、M1培地を1日おきに培養物に添加する。
- 筋原性進行の動態を決定するために、それぞれ2日、4〜5日、6〜7日、および10〜14日におけるPax7、MyoD、ミオゲニン、およびMyHC発現のuMSCを分析する。
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Representative Results
臍帯組織からのuMSCの単離の成功は、全臍帯血からの成功率の低さとは異なり、>95%である。uMSCの単離に成功すると、FACS分析により、すべての細胞がCD34−CD45−CD105+CD90+であることが明らかになった。しかしながら、比較解析において、臍帯血から単離されたuMSCは不均一な集団を示し、ここで細胞の割合はCD34+CD45+CD105+(〜15%)を示す。さらに、ダブルポジティブCD105+CD90+は数が少なく(〜5%)(補足図S1)。これは、CD105およびCD90発現の両方が筋形成の誘導に必要であるため、臍帯血からのuMSC間の筋原性分化のレベルを低下させる。uMSCはまた、表1に列挙されたマーカーの発現を表示する。臍帯血由来uMSCの汚染がある場合、CD34 + CD45 +細胞の存在もあります。これは、筋原性分化のためのプレーティングのための偽細胞数をもたらす。細胞の>90%がCD105およびCD90発現に対して二重陽性であることを示す指標は、uMSCがいかなる中胚葉系にもコミットしておらず、CD105およびCD90の両方の発現が分化時にダウンレギュレートされるため、多能性を維持し続けることである。単一の決定的なuMSCマーカーがないため、uMSC表現型の確認に複数のマーカーを使用することが不可欠です。この解析では、実験室で確立されたuMSCラインのそれぞれについて表1に列挙した全てのマーカーの存在を評価した。さらに、CD105およびCD90(図2A)、ならびにCD105およびCD73(図2B)の二重陽性状態を決定し、uMSCが複数のキーマーカーを発現することを確認した。これは、0.05%未満の数で存在する単一陽性細胞を汚染することを避けるために必要である。
図1:臍帯組織からのuMSCの段階的な単離および特性評価を示す回路図。 略語:uMSCs=ヒト臍帯組織由来の間葉系幹細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)uMSCはCD105およびCD90の発現を示し、造血マーカーCD34およびCD45を発現しない。3つのuMSCライン(UCT15、UCT18、およびUCT26)の代表的なFACSプロットが示されている(N=16)。パネルの上段は、CD105およびCD90発現について陽性のQ2象限における3つのuMSCラインすべてにおける細胞を示す。パネルの下段は、CD105発現について陽性およびCD34およびCD45発現について陰性であるQ1象限の細胞を示す。(b)uMSCsは、MSCマーカーCD73(N=16)の発現を示す。略語:uMSCs=ヒト臍帯組織由来の間葉系幹細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| uMSC 陽性マーカー | uMSC ネガティブマーカー |
| CD105 · | CD34 · |
| CD90 | CD45 · |
| CD73 · | CD106 · |
| CD29 · | HLA DR |
| CD44 · | CD31 · |
| HLA ABC | CD14 · |
| CD49e | CD49e |
| CD54 · | |
| CD13 · |
表 1: uMSC の陽性マーカーと陰性マーカーのリスト 略語:uMSCs=ヒト臍帯組織由来の間葉系幹細胞。
uMSCを筋原性系統に分化させるために、uMSCsは典型的には、M1添加の最初の2日以内に前駆細胞のマーカーであるPax7を発現し、続いてM1添加の最初の4日以内にMyoDを発現する(図3)。分化の6日目に、細胞はミオゲニンタンパク質を発現し、続いて分化誘導の10日目から14日目の間にミオシン重鎖(MyHC)を発現する。我々は、RNAシーケンシング、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、RT-PCR、およびウェスタンブロット分析を用いて筋原性発現の動態をより詳細に特徴付け、筋原性マーカーの段階的発現を文書化し、このプロトコルの堅牢性を確認した。骨格筋に分化した未分化uMSCとuMSCとの全ゲノムトランスクリプトームシーケンシングにより、筋原性分化誘導に応答して907遺伝子がアップレギュレーションされたことが明らかになりました(図4)。
uMSCsをM1培地で2日、4日、7日、および10日間培養し、(A)2日後のPax7、(B)4日後のMyoD、(C)7日後のT8、T12、T14、およびT25、および(D)10日後のMyHCで表記される異なるuMSC株からのミオゲニン発現について評価した。スケールバー = (B, D) 50 μm。略語:uMSCs=ヒト臍帯組織由来の間葉系幹細胞;GAPDH = グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ;MyoD=筋芽細胞決定タンパク質1;MyHC = ミオシン重鎖;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;Mb = 筋芽細胞;MT = 筋管。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:骨格筋に分化した臍帯血および臍帯組織に由来するuMSCの比較トランスクリプトームプロファイリング。 臍帯血および臍帯組織から骨格筋に分化した対照uMSCおよびuMSCとの間の907遺伝子の正規化カウントのヒートマップ。ベン図(左)は、臍帯血由来uMSCと比較して、臍帯組織由来uMSCにおいてアップレギュレートされた多数の筋原性遺伝子を示す。以下の表は、臍帯組織および臍帯血の両方においてアップレギュレートされた一般的な筋原性遺伝子を示す。この図はミシュラらのものです。略語: 1, 2 = 生物学的複製;CB1,2 = 臍帯血のuMSCに由来する筋原性細胞;CT1、2=臍帯組織のuMSCsに由来する筋原性細胞;coB1,2 = 臍帯血からの未分化uMSCの対照;coT1, 2 = 臍帯組織からの未分化uMSCsの対照。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
比較解析を行う目的で、臍帯血と臍帯組織から単離されたuMSCを比較した。RNAシーケンシングデータは、臍帯血由来のものよりも、臍帯組織由来の筋原性細胞由来のuMSCにおいて、アップレギュレートされた筋原性遺伝子が多いことを明らかにした(図4)。この研究を支援するために使用されたRNAシーケンシングデータはNCBIにアップロードされます(SRAアクセッションはGSE147114です)。簡単に説明すると、PANTHER GO-slimデータベースを用いた組織特異的トランスクリプトーム解析により、アクチン結合および筋節集合に関連する細胞骨格タンパク質(TPM2、LDB3、PDLIM3、FHL1、NEXN、MYOM1)が収縮機能に関連するトランスポーター(RTN2、SLC19A2、ACHEおよびSCN1B、SLC19A2、JPH2、KCNJ12、ANKRD1)、筋肉量維持( FBXO32、TRIM16L、GHR)、カルシウムシグナル伝達(FKBP5)、および酵素機能(COX7A1、PDK4)(図4)。全体として、これらのデータは、臍帯組織由来uMSCが堅牢な筋原性電位を示すコンパートメントを表すことを実証する。
孤立した効率、uMSCコンパートメント内の不均一性、母親の年齢、および母親の健康状態(栄養レベルを含む)から生じる可能性のあるuMSCライン間の個人差により、確立されたuMSCライン間で増殖速度および筋原性の可能性に差がある可能性がある。しかしながら、発現の動態の違いにもかかわらず、筋原性マーカーの段階的な発現に伴って筋原性が増加するという全体的な傾向は維持されている。
補足図S1:臍帯血由来uMSCsにおけるMSCマーカー分析。uMSCsは、CD105および造血マーカー、CD34およびCD45の発現を示す。CD105+ 集団の分析は、これらの細胞のごく一部のみがCD90を共発現することを示している(N = 5)。略語:uMSCs=ヒト臍帯組織由来の間葉系幹細胞。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
重要なステップ
このプロトコルの重要なステップは、送達時から無菌培養物の維持まで、増殖の全期間にわたって、無菌条件下での組織の収集である。コード収集中は、コードが滅菌されていない表面に触れず、抗生物質を添加したPBSを含むチューブに収集する前に70%エタノールで外部から拭き取ることが不可欠です。uMSC単離のために、コード収集と組織の処理との間の時間を制限することが重要です。組織を収集部位から実験室に輸送する必要がある場合は、抗生物質含有緩衝液で組織を維持し、氷上に保存するように注意する必要があります。
メソッドの変更とトラブルシューティング
uMSCの筋原性分化を誘導するためのこのプロトコルの重要な修正は、0.01%タイプ1コラーゲンおよび20μg/mLラミニンによるディッシュのコーティングである。我々は、接着条件も調節されると、M1培地の存在下でuMSCsにおける筋原性進行が増強されることを観察した。高価ではあるが、Matrigelのような他の優れた行列の使用が、このプロトコルをさらに改善する可能性があるかどうかをテストする必要がある。個々のサンプル間の収量の変動により、一部の組織では細胞数が少なくなる可能性があります。そのような場合、>5cmのより長い臍帯組織を採取することが好ましいかもしれない。この文脈では、uMSCの収量を増加させるために10cmの臍帯組織を使用した報告はほとんどない。臍帯組織からのuMSCの単離を記載した報告の大部分は、臍帯間質からの細胞の放出の増加のために細胞外マトリックス分解酵素を利用している3、5、7、8。この報告を含むいくつかの研究による外植培養物の使用は、細胞生存率および収量6,9,10の増加を継続的に実証している。さらに、臍帯血からuMSCを精製する際にしばしば含まれる細胞集団を精製するために細胞ソーティングを行う必要がないため、細胞数および完全性が増加する。
方法の制限事項
この方法の主な制限は、個々のコード組織サンプルからのuMSCラインの完全な確立に必要な時間である。通常、このプロトコルを使用して各 uMSC 回線を生成するには、3 週間かかります。これに続いて、完全な筋原性分化のために2週間が必要である。この調査期間の延長は、子宮内環境に関する情報を取得したり、体組成などの子孫の臓器代謝パラメータを予測する目的で、異なる参加者からのuMSCの分化能を調べる大規模なコホートでは面倒です。第2の限界は、臍帯組織マトリックス内の不均一性であり、これは様々なuMSCコンパートメント間に固有の表現型の違いを有する可能性があり、異なる供給源間の分化可能性の原因となり得る。例えば、WJ由来のuMSCは、CL由来のuMSCs11と比較して骨形成能が低い。したがって、この方法は、臍帯組織自体内の異なる区画間に内在する相違を記述していない。
既存法に対する本方法の意義
このプロトコルを使用して、個々のコード組織サンプルから1×104〜106uMSCの細胞数×得ることができます。これらのuMSCラインは、少なくとも6〜8継代のアッセイに確実に使用できます。ヒト集団に典型的な細胞表現型の変動の程度にもかかわらず、北インド出身の15人の女性のコホートで観察されたuMSCの平均倍加時間は2日未満であった6。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)の取り込みを用いた増殖速度の分析は、細胞の少なくとも80%が6時間6のスパンでS期を通過したことを示した。さらに、臍帯組織由来のuMSCも低い老化速度を示し、この単離方法の堅牢性を示す6。我々は以前、このプロトコールを用いたuMSCにおける筋形成誘導の程度を、ヒトおよびマウスの多能性幹細胞における筋形成を誘導するために使用されたものと比較した6,12。我々は、このプロトコルが既存のプロトコルよりも筋原性分化のより強力な誘導因子であることを見出した。
方法とアプリケーションの重要性
細胞および再生療法の成功は、細胞の生存率および収量に依存し、早期継代から多数の細胞を必要とする。したがって、この方法は、臨床応用のための便利な代替手段を提供する。本報告で提供されている堅牢な筋原性分化プロトコルと、我々の研究におけるこのプロトコルを用いた筋原性進行の詳細な分子特性評価は、胎児の筋形成を反復する努力を補完し、子宮内環境を模倣し、出生後の代謝を反映するモデルとして使用することができる。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
Acknowledgments
撮影とビデオ制作に協力してくれたOjas Tikoo氏に感謝します。我々はまた、GARBH-Ini(Advanced Research and Birth Outcome-DBT India)のスタッフ、看護師、上級研究官、及びPallavi Kshetrapal博士から物流に関する支援を受けたことを認識する。この研究は、インドのバイオテクノロジー省からSuchitra Gopinathに授与された助成金によって支援されました(BT/09/IYBA/2015;BT/PR29599/PFN/20/1393/2018)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
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