Summary
Vi beskriver en protokol for isolering af mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv og deres differentiering i skeletmuskelslægten.
Abstract
Udforskning af det terapeutiske potentiale af mesenkymale stamceller er betinget af den lette isolering, styrke mod differentiering og kildens pålidelighed og robusthed. Vi beskriver her en trinvis protokol til isolering af mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv (UMSC'er), deres immunophenotyping og formering af sådanne kulturer over flere passager. I denne procedure er levedygtigheden af uMSC'erne høj, fordi der ikke er nogen enzymatisk fordøjelse. Endvidere sikrer fjernelsen af blodkar, herunder navlestrengsarterierne og venen, at der ikke er nogen forurening af celler af endoteloprindelse. Ved anvendelse af flowcytometri er uMSC'er ved isolering CD45-CD34-, hvilket indikerer et fravær af celler fra den hæmatopoietiske afstamning. Det er vigtigt, at de udtrykker vigtige overflademarkører, CD105, CD90 og CD73. Ved etablering af kulturer beskriver dette papir en effektiv metode til at inducere differentiering i disse uMSC'er i skeletmuskelslægten. En detaljeret analyse af myogen progression i differentierede uMSC'er afslører, at uMSC'er udtrykker Pax7, en markør for myogene forfædre i de indledende stadier af differentiering, efterfulgt af ekspressionen af MyoD og Myf5, og endelig en terminal differentieringsmarkør, myosin tung kæde (MyHC).
Introduction
Den menneskelige navlestreng er blevet krediteret for at have et robust reservoir af mesenkymale stamceller, som i øjeblikket undersøges til regenerative terapier på grund af deres robuste proliferations- og differentieringshastigheder, immunmodulerende egenskaber og evne til at generere celler fra alle de tre kimlag1. Navlestrengsvævet består af flere rum såsom navlesnorsblodet, navlestrengsunderendotelet og Whartons gelé (WJ), som i sig selv omfatter tre utydelige regioner - den perivaskulære zone, den intervaskulære zone og underamnionen eller ledningsforingen (CL)2. Mens uMSC'er kan isoleres fra alle disse forskellige regioner og bredt udtrykke vigtige MSC-markører, er der ingen klarhed over, om disse rum indeholder den samme population af uMSC'er eller viser forskelle i deres differentieringsstyrker3. Derfor kræver protokoller til isolering af uMSC'er en større præcision i deres isolationstilstand og -region, den robuste karakterisering af differentieringspotentialer og endelig en sammenlignende analyse fra forskellige rum i ledningen.
I denne sammenhæng har få undersøgelser vist forskelle i uMSC proliferative og differentiative potentialer mellem forskellige dele af ledningen. Af disse afslørede sammenlignende analyser mellem uMSC'er isoleret fra CL- og WJ-regionerne et større proliferativt potentiale i CL-afledte uMSC'er 3,4. I en separat undersøgelse klarede WJ-afledte uMSC'er sig bedre i proliferationsassays sammenlignet med perivaskulære celler (HUCPV)5. Ved undersøgelse af forskelle mellem navlestrengsblodafledte uMSC'er og navlestrengsvævsafledte uMSC'er uden vaskulær kontaminering blev der rapporteret differentiel ekspression af vigtige MSC-markører mellem de to rum samt øgede proliferationshastigheder i navlestrengsvævsafledte uMSC'er6.
Af de mange undersøgelser, der undersøgte differentieringspotentialerne for uMSC'er primært i væv af mesoderm-slægten, såsom osteoogene, adipogene og kondrogogene afstamninger, har meget få givet detaljerede protokoller for myogen differentiering og efterfølgende karakterisering samt sammenlignende analyser mellem forskellige ledningsrum. I denne sammenhæng har vi udviklet en robust muskeldifferentieringsprotokol og observeret, at navlestrengsvævsafledte uMSC'er viser overlegne myogene differentieringsevner sammenlignet med navlestrengsblod6. Her er en trinvis protokol detaljeret til isolering af uMSC'er fra hele ledningsvævet uden celler forbundet med vaskulaturen, deres karakterisering og deres differentiering i den myogene afstamning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af navlesnorvæv i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), Institutional Ethics Committee, Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana og Institutional Biosafety Committee, THSTI. Humane ledningsvævsprøver blev høstet fra terminsleverancer på fødselstidspunktet. Informeret skriftligt samtykke blev indhentet fra forsøgspersoner . Alle metoder blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler.
1. Isolering af MSC'er fra ledningsvæv
- På leveringstidspunktet skæres mindst 5 cm ledning, helst tættere på moderkagen, og steriliseres ledningen ved at pode den ydre overflade med 70% ethanol. Ledningsvævet overføres sekventielt fra et 50 ml opsamlingsrør indeholdende fosfatbufferet saltvand (PBS) til et andet indeholdende det samme. Transport opsamlingsrøret med forsøgspersonens navn på is til laboratoriet inden for 1 time.
BEMÆRK: For en større undersøgelse kan det være nyttigt at stregkode prøverne for at muliggøre deres sporing gennem hele undersøgelsen. Det er vigtigt, at alt personale, der håndterer humant væv, tilbydes det fulde regime af hepatitis B-vaccinen. - I laboratoriet skal du tænde UV i 25 minutter i BSL-2-emhætten for at sterilisere autoklaverede instrumenter og pipetter inden brug.
- Ledningsvævsstykket overføres fra opsamlingsrøret til en 10 cm2 vævskulturbehandlet skål indeholdende PBS beriget med 5 g/l glucose, 50 μg/ml gentamicin, 2,5 μg/ml amphotericin B, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin (skematisk i figur 1).
- Brug en skalpel til at skære ledningsvævet lodret langs dets længdeakse for at opnå to halvcylindriske stykker. På grund af snorens torsion og den slimede overflade skal du fastgøre vævet med et par tang, der holdes i den anden hånd.
- På dette tidspunkt skal du observere navlestrengsarterierne og venen og fjerne blodkarrene ved at bruge en skalpel til at skrabe dem af i en retning fra overfladen. Ledningsvævet skylles igen i PBS for at fjerne alt resterende blod, der er forbundet med vævet. Sørg for, at skrabningen er skånsom for at bevare integriteten af celler i WJ, der omgiver karrene.
- Hak hver halvdel af ledningsvævet i 0,5 cm3 størrelse fragmenter og læg fragmenterne med den luminale overflade nedad på fadet. Skålen inkuberes kortvarigt i 10 minutter i et befugtet kammer på 37 °C indeholdende 5 % CO2.
- Efter inkubation oversvømmes skålen indeholdende ledningsvævstykkerne med 20 ml medium indeholdende MEM Alpha Modification uden L-glutamin, ribo- og deoxyribonukleosider, 15% føtalt bovint serum (ikke varmeinaktiveret) og 50 μg / ml gentamycin. Tilsæt vækstmediet forsigtigt langs siderne for at forhindre, at vævseksplolanterne løsnes fra deres orientering. Tilsæt overskydende medium for at tegne sig for en brøkdel, der vil blive gennemblødt af vævseksplosatorerne under inkubation.
- Efter 3 dages inkubation tilsættes frisk medium til kulturerne. Sørg for, at kulturerne er beskyttet mod stød og bevægelse af explants, mens du håndterer opvasken.
- Efter 1 uge fjernes vævsfragmenterne individuelt ved hjælp af sterile pincet og kasseres med passende biofarlige poser til bortskaffelse. Bevar det eksisterende medium og tilsæt 10 ml frisk vækstmedium. Udskift vækstmediet hver 4. dag, indtil de enkelte kolonier når en sammenløb på 70%.
BEMÆRK: Det er sandsynligt, at cellerne ikke vil blive ensartet fordelt i hele skålen, da der vil være individuelle proliferative kolonier, der skal overvåges for sammenløb med tiden. Generelt genererer en 10 cm2 skål inden for en måned nok celler til at blive opdelt i en separat skål. - Høst de klæbende celler ved hjælp af trypsin / EDTA-opløsning (1x 0,25% trypsin og 0,02% EDTA i Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Cellesuspensionen centrifugeres ved 470 × g i 5 min ved 25 °C, og cellepillen genaktiveres i vækstmedium.
2. Immunophenotyping og formering af uMSCS
- Fortsæt til immunophenotyping, når de vedhængende celler har nået 50% -60% sammenløb og er godt spredt. Udfør ikke MSC-markøranalyse på fuldt sammenflydende kulturer, da dette har tendens til at forårsage nedregulering af vigtige MSC-markører.
- Efter trypsinisering fordeles en cellesuspension på 1 × 106 celler / ml i FACS-rør (1 × 105 celler / rør) og plet med passende fluoroforbundne antistoffer (alle 1:50 fortynding) i kombination: ufarvet; CD105 + CD90; CD105 + CD73; Cd105; Cd90; Cd73; CD34 + CD45 (almindelig fluorofor); isotypekontroller for hver fluorofor. Registrer et samlet antal hændelser på mindst 10.000 på flowcytometeret til yderligere analyse.
BEMÆRK: Da cellerne analyseres for hver overflademarkør separat, er gating på celleundersæt ikke påkrævet. - Ud over ovenstående markører bekræftes tilstedeværelsen af positive og negative overflademarkører i uMSC-linjer oprettet fra individuelle ledningsvævsprøver (tabel 1).
- Analyser de mærkede celler ved hjælp af flowcytometri, og bestem procentdelen af CD105 + CD90 + og CD105 + CD73 + celler. Analyser CD105+ og CD34−CD45− celler separat.
3. Differentiering af uMSC'er i skeletmuskulatur
- Belagt vævskulturplader med 0,01% kollagen og 20 μg/ml laminin i PBS. Coat disse plader i mindst 4 timer ved stuetemperatur.
- Plade-uMSC'er med en tæthed på 10.000 celler /cm2 i vækstmedium.
- Når cellerne er 70% sammenflydende, aspireres vækstmediet og skylles kulturerne 2x med PBS. Der tilsættes myogent differentieringsmedium (M1) bestående af DMEM + 5 % hesteserum + 0,1 μM dexamethason + 50 μM hydrocortison til uMSC'erne. Til bestemmelse af kinetikken af myogen progression tilsættes M1-medium hver anden dag til kulturerne.
- For at bestemme kinetikken af myogen progression skal du analysere uMSC'er for Pax7, MyoD, Myogenin og MyHC-ekspression efter henholdsvis 2 dage, 4-5 dage, 6-7 dage og 10-14 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesen med isolering af uMSC'er fra ledningsvæv er >95%, i modsætning til de dårlige succesrater fra fuldsnorsblod. Efter vellykket isolering af uMSC'er afslører FACS-analyse, at alle cellerne er CD34−CD45−CD105+CD90+. I komparativ analyse viser uMSC'er isoleret fra navlestrengsblod imidlertid heterogene populationer, hvor en andel af cellerne viser CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%). Derudover er dobbeltpositiv CD105 + CD90 + færre i antal (~ 5%) (supplerende figur S1). Dette resulterer i reducerede niveauer af myogen differentiering blandt uMSC'er fra navlestrengsblod, da både CD105- og CD90-ekspression er nødvendige for induktion af myogenese. uMSC'er viser også udtrykket for de markører, der er anført i tabel 1. Hvis der er forurening af de navlestrengsblodafledte uMSC'er, vil der også være en tilstedeværelse af CD34 + CD45 + celler . Dette resulterer i falske celletal til plettering for myogen differentiering. En indikation af, at >90% af cellerne er dobbelt positive for CD105- og CD90-ekspression, er, at uMSC'erne ikke har forpligtet sig til nogen mesodermal afstamning og fortsat forbliver multipotente, da både CD105- og CD90-ekspression nedreguleres ved differentiering. Det er bydende nødvendigt at bruge flere markører til bekræftelse af uMSC-fænotyper, da der ikke er nogen enkelt endelig uMSC-markør. I denne analyse evaluerede vi tilstedeværelsen af alle de markører, der er anført i tabel 1 for hver af de uMSC-linjer, der er etableret i laboratoriet. Derudover bestemte vi den dobbeltpositive status for CD105 og CD90 (figur 2A) samt cd105 og CD73 (figur 2B), hvilket sikrer, at uMSC'erne udtrykker flere nøglemarkører. Dette er nødvendigt for at undgå forurening af enkeltpositive celler, der er til stede i antal på mindre end 0, 05%.
Figur 1: Skematisk viser trinvis isolering og karakterisering af uMSC'er fra ledningsvæv. Forkortelse: uMSC 'er = mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: MSC-markøranalyse i uMSC'er afledt af ledningsvæv. (A) UMSC'er viser ekspressionen af CD105 og CD90 og udtrykker ikke hæmatopoietiske markører, CD34 og CD45. Repræsentative FACS-plots af tre uMSC-linjer (UCT15, UCT18 og UCT26) vises (N = 16). Øverste række af paneler viser celler i alle tre uMSC-linjer i Q2-kvadranten positiv for CD105- og CD90-ekspression. Nederste række af paneler viser celler i Q1-kvadranten positiv for CD105-ekspression og negativ for CD34- og CD45-ekspression. (B) uMSC'er viser udtrykket MSC-markør, CD73 (N = 16). Forkortelse: uMSC 'er = mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
| uMSC positive markører | uMSC negative markører |
| Cd105 | Cd34 |
| Cd90 | Cd45 |
| Cd73 | Cd106 |
| Cd29 | HLA DR |
| Cd44 | Cd31 |
| HLA ABC | Cd14 |
| Cd49e | Cd49e |
| Cd54 | |
| Cd13 |
Tabel 1: Liste over positive og negative markører for uMSC'er. Forkortelse: uMSC 'er = mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv.
For differentiering af uMSC'er i den myogene afstamning udtrykker uMSC'er typisk Pax7, en markør for forløberceller inden for de første 2 dage efter tilsætning af M1, efterfulgt af MyoD inden for de første 4 dage efter M1-tilsætning (figur 3). Ved 6 dages differentiering udtrykker celler Myogeninprotein efterfulgt af ekspressionen af Myosin tung kæde (MyHC) mellem 10 dage og 14 dage efter induktion af differentiering. Vi karakteriserede mere detaljeret kinetikken af myogen ekspression ved hjælp af RNA-sekventering, flowcytometri, immunocytokemi, RT-PCR og western blot-analyse for at dokumentere den trinvise ekspression af myogene markører, hvilket bekræfter robustheden af denne protokol. Helgenom transkriptomisk sekventering mellem udifferentierede uMSC'er og uMSC'er, der blev differentieret til skeletmuskulatur, afslørede opreguleringen af 907 gener som reaktion på induktionen af myogen differentiering (figur 4).
Figur 3: Differentiering af uMSC'er i skeletmuskulatur. uMSC'er blev dyrket i M1-medium i 2 dage, 4 dage, 7 dage og 10 dage og vurderet for (A) Pax7 efter 2 dage, (B) MyoD efter 4 dage, (C) Myogeninekspression fra forskellige uMSC-linjer, betegnet med T8, T12, T14 og T25 efter 7 dage og (D) MyHC efter 10 dage. Skalastænger = (B, D) 50 μm. Forkortelser: uMSC 'er = mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv; GAPDH = glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; MyoD = myoblast bestemmelse protein 1; MyHC = myosin tung kæde; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; Mb = myoblast; MT = myotube. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sammenlignende transkriptomisk profilering af uMSC'er afledt af navlestrengsblod og navlestrengsvæv differentieret i skeletmuskulatur. Varmekort over normaliserede tællinger af 907 gener mellem kontrol-uMSC'er og uMSC'er differentieret til skeletmuskulatur i 7 dage fra navlestrengsblod og navlestrengsvæv. Venn-diagram (til venstre) viser et større antal myogene gener opreguleret i navlestrengsafledte uMSC'er sammenlignet med navlestrengsblodafledte uMSC'er. Tabellen nedenfor viser de almindelige myogene gener, der er opreguleret i både navlestrengsvæv og navlestrengsblod. Denne figur er fra Mishra et al.6. Forkortelser: 1, 2 = biologiske replikater; CB1,2 = myogene celler afledt af uMSC'er af navlestrengsblod CT1, 2 = myogene celler afledt af uMSC'er af ledningsvæv; coB1,2 = kontrol af udifferentierede uMSC'er fra navlestrengsblod coT1, 2 = kontroller udifferentierede UMSC'er fra ledningsvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Med henblik på at foretage en sammenlignende analyse sammenlignede vi uMSC'er isoleret fra navlestrengsblod og navlestrengsvæv. RNA-sekventeringsdata afslørede, at der var flere myogene gener opreguleret i uMSC'er fra navlestrengsvævsafledte myogene celler end fra dem, der stammer fra navlestrengsblod (figur 4). Rna-sekventeringsdata, der bruges til at understøtte denne undersøgelse, uploades til NCBI (SRA-tiltrædelse er GSE147114). Kort fortalt identificerede vævsspecifik transkriptomisk analyse ved hjælp af PANTHER GO-slim-databasen cytoskeletale proteiner forbundet med actinbinding og sarkomsamling (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) transportører forbundet med kontraktil funktion (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), vedligeholdelse af muskelmasse ( FBXO32, TRIM16L, GHR), calciumsignalering (FKBP5) og enzymatisk funktion (COX7A1, PDK4) (figur 4). Alt i alt viser disse data, at uMSC'er afledt af ledningsvæv repræsenterer et rum, der viser robust myogent potentiale.
På grund af individuel variation mellem uMSC-linjer, der kan opstå som følge af effektivitet isoleret set, heterogenitet inden for uMSC-rummet, moderens alder og moderens sundhedsstatus, herunder hendes næringsstofniveauer, kan der være forskelle i spredningshastigheder og myogene potentialer mellem etablerede uMSC-linjer. På trods af forskelle i ekspressionens kinetik opretholdes den overordnede tendens til at øge myogeniciteten med det trinvise udtryk for myogene markører.
Supplerende figur S1: MSC-markøranalyse i navlestrengsblodafledte uMSC'er. uMSC'er viser udtrykket cd105 og hæmatopoietiske markører, CD34 og CD45. Analyse af CD105+ populationen viser, at kun en lille del af disse celler co-udtrykker CD90 (N = 5). Forkortelse: uMSC 'er = mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin
Et kritisk trin i denne protokol er indsamling af væv under aseptiske forhold, fra leveringstidspunktet til vedligeholdelse af sterile kulturer, i hele formeringsvarigheden. Under ledningsopsamling er det vigtigt, at ledningen ikke rører nogen ikke-steriliseret overflade og podes eksternt med 70% ethanol inden opsamling i rør indeholdende PBS suppleret med antibiotika. Det er vigtigt at begrænse tiden mellem ledningsopsamling og behandling af vævet til uMSC-isolering. Hvis der er behov for at transportere væv fra indsamlingsstedet til laboratoriet, skal man sørge for at vedligeholde vævet i antibiotikaholdige buffere og opbevare det på is.
Ændringer og fejlfinding af metoden
Den vigtigste ændring i denne protokol for at inducere myogen differentiering af uMSC'er er belægningen af retter med 0,01% type 1 kollagen og 20 μg / ml laminin. Vi observerede, at myogen progression i uMSC'er i nærværelse af M1-medium forbedres, når vedhæftningsbetingelserne også moduleres. Hvorvidt brugen af andre overlegne, omend dyre, matricer som Matrigel kan forbedre denne protokol yderligere, skal testes. Variationer i udbytte mellem individuelle prøver kan resultere i, at nogle væv genererer et lavere celletal. I sådanne tilfælde kan det være at foretrække at samle en større længde af ledningsvæv, der er >5 cm. I denne sammenhæng har få rapporter brugt 10 cm ledningsvæv til at øge udbyttet af uMSC'er. Størstedelen af rapporterne, der beskriver isoleringen af uMSC'er fra ledningsvæv, har gjort brug af ekstracellulære matrixnedbrydende enzymer til øget frigivelse af celler fra ledningstroma 3,5,7,8. Brugen af eksplolante kulturer ved nogle få undersøgelser, herunder denne rapport, har løbende vist øget cellulær levedygtighed og udbytte 6,9,10. Derudover øger fraværet af behovet for at udføre cellesortering for at rense cellepopulationer, som ofte indgår i rensning af UMSC'er fra navlestrengsblod, cellulære tal og integritet.
Begrænsninger af metoden
En vigtig begrænsning af metoden er den tid, der kræves til fuldstændig etablering af uMSC-linjer fra individuelle navlestrengsvævsprøver. Der kræves typisk 3 uger for at generere hver uMSC-linje ved hjælp af denne protokol. Herefter kræves 2 uger for fuldstændig myogen differentiering. Denne forlængede undersøgelsesvarighed kan være besværlig i store kohorter, der undersøger differentieringspotentialerne for uMSC'er fra forskellige deltagere med det formål at indhente oplysninger om det intrauterine miljø eller forudsige afkomsorganmetabolske parametre såsom kropssammensætning. En anden begrænsning er heterogeniteten inden for navlestrengsvævsmatrixen, som kan have iboende fænotypiske forskelle mellem de forskellige uMSC-rum, og som kan være ansvarlig for differentieringspotentialer mellem de forskellige kilder. For eksempel viser uMSC'er fra WJ lavere osteogent potentiale sammenlignet med CL-afledte uMSC'er11. Derfor beskriver denne metode ikke forskellene mellem forskellige rum i selve ledningsvævet.
Metodens betydning i forhold til eksisterende metoder
Ved hjælp af denne protokol er vi i stand til at opnå et celletal på 1 × 104 til 1 × 106 uMSC'er fra individuelle navlestrengsvævsprøver. Disse uMSC-linjer kan pålideligt bruges til assays i mindst 6-8 passager. På trods af omfanget af variation i cellulære fænotyper, der er typiske for menneskelige populationer, var den gennemsnitlige fordoblingstid for uMSC'er observeret i vores kohorte på 15 kvinder fra Nordindien mindre end 2 dage6. En analyse af deres proliferative hastigheder ved anvendelse af inkorporering af 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) viste, at mindst 80% af cellerne havde gennemgået S-fasen i et spænd på 6 h6. Derudover viser uMSC'er fra ledningsvæv også lave ældningshastigheder, hvilket indikerer robustheden af denne isolationsmetode6. Vi har tidligere sammenlignet graden af myogen induktion i uMSC'er ved hjælp af denne protokol med den, der blev brugt til at inducere myogenese i humane og murinpleuripotentielle stamceller 6,12. Vi fandt ud af, at denne protokol er en mere potent inducer af myogen differentiering end eksisterende protokoller.
Betydningen af metoden og applikationerne
Succesfulde cellulære og regenerative terapier er afhængige af cellulær levedygtighed og udbytte, hvilket kræver et stort antal celler fra tidlige passager. Således tilbyder denne metode et bekvemt alternativ til kliniske applikationer. Den robuste myogene differentieringsprotokol, der er angivet i denne rapport, og den dybtgående molekylære karakterisering af myogen progression ved hjælp af denne protokol i vores arbejde supplerer bestræbelserne på at rekapitulere føtal myogenese og kan bruges som en model til at efterligne det intrauterin miljø og afspejle postnatal metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Mr. Ojas Tikoo for deres hjælp med filmoptagelse og videoproduktion. Vi anerkender også den hjælp, der er modtaget fra GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India) personale, sygeplejersker og seniorforskningsofficerer på Gurugram Civil Hospital og Dr. Pallavi Kshetrapal til hjælp med logistik. Dette arbejde blev støttet af tilskud tildelt Suchitra Gopinath fra Institut for Bioteknologi, Indien (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
