Summary
हम मानव गर्भनाल ऊतक से मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और कंकाल की मांसपेशी वंश में उनके भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की चिकित्सीय क्षमता की खोज अलगाव की आसानी, भेदभाव की ओर शक्ति और स्रोत की विश्वसनीयता और मजबूती पर आकस्मिक है। हम यहां मानव गर्भनाल ऊतक (यूएमएससी), उनके इम्यूनोफेनोटाइपिंग और कई मार्गों पर ऐसी संस्कृतियों के प्रसार से मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक चरणबद्ध प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रक्रिया में, यूएमएससी की व्यवहार्यता अधिक है क्योंकि कोई एंजाइमी पाचन नहीं है। इसके अलावा, गर्भनाल धमनियों और नस सहित रक्त वाहिकाओं को हटाने से यह सुनिश्चित होता है कि एंडोथेलियल मूल की कोशिकाओं का कोई संदूषण न हो। प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करते हुए, अलगाव पर यूएमएससी सीडी 45−सीडी 34−, हेमटोपोइएटिक वंश से कोशिकाओं की अनुपस्थिति का संकेत देता है। महत्वपूर्ण रूप से, वे कुंजी सतह मार्कर, सीडी 105, सीडी 90 और सीडी 73 व्यक्त करते हैं। संस्कृतियों की स्थापना पर, यह पत्र कंकाल की मांसपेशी वंश में इन यूएमएससी में भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। विभेदित यूएमएससी में मायोजेनिक प्रगति के एक विस्तृत विश्लेषण से पता चलता है कि यूएमएससी पैक्स 7 को व्यक्त करते हैं, भेदभाव के प्रारंभिक चरणों में मायोजेनिक पूर्वजों के लिए एक मार्कर, इसके बाद मायोडी और मायफ 5 की अभिव्यक्ति, और अंत में, एक टर्मिनल भेदभाव मार्कर, मायोसिन भारी श्रृंखला (एमवाईएचसी)।
Introduction
मानव गर्भनाल को मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का एक मजबूत भंडार रखने का श्रेय दिया गया है, जो वर्तमान में उनके मजबूत प्रसार और भेदभाव दर, इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों और सभी तीन रोगाणु परतों से कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता के कारण पुनर्योजीउपचारों के लिए खोजे जा रहे हैं। गर्भनाल ऊतक में गर्भनाल रक्त, गर्भनाल शिरा सबेंडोथेलियम और व्हार्टन की जेली (डब्ल्यूजे) जैसे कई डिब्बे होते हैं, जो अपने आप में तीन अस्पष्ट क्षेत्रों को शामिल करते हैं- पेरिवास्कुलर ज़ोन, इंटरवैस्कुलर ज़ोन, और सब-एमनियन या कॉर्ड लाइनिंग (सीएल)2। जबकि यूएमएससी को इन सभी अलग-अलग क्षेत्रों से अलग किया जा सकता है और मोटे तौर पर प्रमुख एमएससी मार्करों को व्यक्त किया जा सकता है, इस बात पर कोई स्पष्टता नहीं है कि क्या इन डिब्बों में यूएमएससी की समान आबादी है या उनकी भेदभाव शक्ति में अंतर प्रदर्शित करता है3. इसलिए, यूएमएससी के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल को उनके मोड और अलगाव के क्षेत्र में अधिक परिशुद्धता की आवश्यकता होती है, भेदभाव क्षमता का मजबूत लक्षण वर्णन, और अंत में, कॉर्ड के विभिन्न डिब्बों से तुलनात्मक विश्लेषण।
इस संदर्भ में, कुछ अध्ययनों ने कॉर्ड के विभिन्न हिस्सों के बीच यूएमएससी प्रोलिफेरेटिव और विभेदक क्षमता में अंतर का प्रदर्शन किया है। इनमें से, सीएल और डब्ल्यूजे क्षेत्रों से पृथक यूएमएससी के बीच तुलनात्मक विश्लेषण से सीएल-व्युत्पन्न यूएमएससी 3,4 में अधिक प्रसार क्षमता का पता चला। एक अलग अध्ययन में, डब्ल्यूजे-व्युत्पन्न यूएमएससी ने पेरिवास्कुलर कोशिकाओं (एचयूसीपीवी) 5 की तुलना में प्रसार परख में बेहतर प्रदर्शन किया। संवहनी संदूषण से रहित गर्भनाल रक्त-व्युत्पन्न यूएमएससी और कॉर्ड ऊतक-व्युत्पन्न यूएमएससी के बीच अंतर की जांच करने में, दो डिब्बों के बीच प्रमुख एमएससी मार्करों की अंतर अभिव्यक्ति की सूचना दी गई थी, साथ ही कॉर्ड ऊतक-व्युत्पन्न यूएमएससी6 में प्रसार दर में वृद्धि हुई थी।
मुख्य रूप से ओस्टियोजेनिक, एडिपोजेनिक और चोंड्रोजेनिक वंशावली जैसे मेसोडर्म वंश के ऊतकों में यूएमएससी की भेदभाव क्षमता की जांच करने वाले कई अध्ययनों में से, बहुत कम ने मायोजेनिक भेदभाव और बाद के लक्षण वर्णन के साथ-साथ विभिन्न कॉर्ड डिब्बों के बीच तुलनात्मक विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए हैं। इस संदर्भ में, हमने एक मजबूत मांसपेशी भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित किया है और देखा है कि कॉर्ड ऊतक-व्युत्पन्न यूएमएससी कॉर्ड रक्त6 की तुलना में बेहतर मायोजेनिक भेदभाव क्षमताओं को प्रदर्शित करते हैं। यहां, वास्कुलचर, उनके लक्षण वर्णन और मायोजेनिक वंश में उनके भेदभाव से जुड़ी कोशिकाओं से रहित पूरे कॉर्ड ऊतक से यूएमएससी के अलगाव के लिए एक चरणबद्ध प्रोटोकॉल विस्तृत है।
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Protocol
इस अध्ययन में गर्भनाल ऊतक के उपयोग को स्टेम सेल रिसर्च के लिए संस्थागत समिति (आईसी-एससीआर), संस्थागत आचार समिति, ट्रांसलेशनल हेल्थ साइंस एंड टेक्नोलॉजी इंस्टीट्यूट (आईईसी-टीएचएसटीआई), सिविल अस्पताल, गुरुग्राम, हरियाणा की संस्थागत नैतिकता समिति और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति, टीएचएसटीआई द्वारा अनुमोदित किया गया था। जन्म के समय टर्म डिलीवरी से मानव कॉर्ड ऊतक के नमूने काटे गए थे। विषयों से सूचित लिखित सहमति प्राप्त की गई थी। सभी तरीकों को प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किया गया था।
1. कॉर्ड ऊतक से एमएससी का अलगाव
- प्रसव के समय, कॉर्ड के कम से कम 5 सेमी काट लें, अधिमानतः प्लेसेंटा के करीब, और 70% इथेनॉल के साथ बाहरी सतह को स्वैब करके कॉर्ड को निष्फल करें। फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) युक्त एक 50 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब से कॉर्ड ऊतक के टुकड़े को क्रमिक रूप से दूसरे में स्थानांतरित करें। 1 घंटे के भीतर प्रयोगशाला के लिए बर्फ पर विषय का नाम असर संग्रह ट्यूब परिवहन।
नोट: एक बड़े अध्ययन के लिए, पूरे अध्ययन में उनकी ट्रैकिंग को सक्षम करने के लिए नमूनों को बारकोड करना उपयोगी हो सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि मानव ऊतकों को संभालने वाले सभी कर्मियों को हेपेटाइटिस बी वैक्सीन के पूर्ण आहार की पेशकश की जानी चाहिए। - प्रयोगशाला में, उपयोग करने से पहले आटोक्लेव उपकरणों और पिपेट को निष्फल करने के लिए बीएसएल -2 हुड में 25 मिनट के लिए यूवी पर स्विच करें।
- एल ग्लूकोज, 50 μg /एमएल जेंटामाइसिन,2.5 μg / एमएल एम्फोटेरिसिन बी, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन ( चित्रा 1 में योजनाबद्ध) के साथ समृद्ध पीबीएस युक्त 10 सेमी 2 टिशू कल्चर-इलाज पकवान में कॉर्ड ऊतक टुकड़ा स्थानांतरित करें।
- स्केलपेल का उपयोग करके, दो आधे बेलनाकार टुकड़े प्राप्त करने के लिए कॉर्ड ऊतक को अपने अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ लंबवत स्लाइस करें। कॉर्ड मरोड़ और म्यूकॉइड सतह के कारण, दूसरे हाथ में आयोजित संदंश की एक जोड़ी के साथ ऊतक को पिन करें।
- इस बिंदु पर, नाभि धमनियों और नसों का निरीक्षण करें और सतह से एक दिशा में उन्हें खुरचने के लिए स्केलपेल का उपयोग करके रक्त वाहिकाओं को हटा दें। ऊतक से जुड़े सभी अवशिष्ट रक्त को हटाने के लिए पीबीएस में एक बार फिर कॉर्ड ऊतक कुल्ला। सुनिश्चित करें कि स्क्रैपिंग जहाजों के आसपास डब्ल्यूजे में कोशिकाओं की अखंडता को संरक्षित करने के लिए कोमल है।
- कॉर्ड ऊतक के प्रत्येक आधे हिस्से को 0.5 सेमी3 आकार के टुकड़ों में कीमा बनाएं और पकवान पर नीचे की ओर चमकदार सतह के साथ टुकड़ों को रखें। 5% सीओ2 युक्त एक 37 डिग्री सेल्सियस आर्द्र कक्ष में 10 मिनट के लिए संक्षेप में पकवान सेते हैं।
- इनक्यूबेशन के बाद, एल-ग्लूटामाइन, राइबो- और डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोसाइड्स, 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (गर्मी-निष्क्रिय नहीं), और 50 μg / ऊतक एक्सप्लांट्स को उनके अभिविन्यास से बेदखल होने से रोकने के लिए पक्षों के साथ धीरे-धीरे विकास माध्यम जोड़ें। एक अंश के लिए खाते में अतिरिक्त माध्यम जोड़ें जो इनक्यूबेशन के दौरान ऊतक एक्सप्लांट्स द्वारा भिगोया जाएगा।
- इनक्यूबेशन के 3 दिनों के बाद, संस्कृतियों में ताजा माध्यम जोड़ें। सुनिश्चित करें कि संस्कृतियों को व्यंजनों को संभालते समय एक्सप्लांट्स के झटके और आंदोलन से संरक्षित किया जाता है।
- 1 सप्ताह के बाद, बाँझ संदंश का उपयोग कर व्यक्तिगत रूप से ऊतक टुकड़े निकालें और निपटान के लिए उपयुक्त बायोहाज़र्ड बैग का उपयोग करके त्यागें। मौजूदा माध्यम को बनाए रखें और ताजा विकास माध्यम के 10 एमएल जोड़ें। हर 4 दिनों में विकास माध्यम को बदलें जब तक कि व्यक्तिगत कॉलोनियां 70% के संगम तक न पहुंच जाएं।
नोट: यह संभावना है कि कोशिकाओं को पूरे पकवान में समान रूप से वितरित नहीं किया जाएगा, क्योंकि व्यक्तिगत प्रोलिफेरेटिव कॉलोनियां होंगी जिन्हें समय के साथ संगम के लिए निगरानी करने की आवश्यकता है। आम तौर पर, एक महीने के भीतर, एक 10 सेमी2 डिश एक अलग पकवान में विभाजित होने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। - ईडीटीए समाधान (हैंक्स संतुलित नमक समाधान [एचबीएसएस] में 1x 0.25% ट्रिप्सिन और 0.02% ईडीटीए) का उपयोग करके अनुयायी कोशिकाओं को हार्वेस्ट करें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 470 × ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और विकास माध्यम में सेल गोली को फिर से निलंबित कर दिया।
2. इम्यूनोफेनोटाइपिंग और यूएमएससीएस का प्रसार
- एक बार अनुयायी कोशिकाएं 50% -60% संगम तक पहुंच गई हैं और अच्छी तरह से फैल गई हैं, तो इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए आगे बढ़ें। पूरी तरह से संगम संस्कृतियों पर एमएससी मार्कर विश्लेषण न करें, क्योंकि यह प्रमुख एमएससी मार्करों के डाउनरेगुलेशन का कारण बनता है।
- ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद, एफएसीएस ट्यूबों (1 × 105 कोशिकाओं / ट्यूब) में 1 × 106 कोशिकाओं / एमएल के सेल निलंबन को वितरित करें और संयोजन में उचित फ्लोरोफोर-लिंक्ड एंटीबॉडी (सभी 1: 50 कमजोर पड़ने) के साथ दाग: बिना दाग; सीडी 105 + सीडी 90; सीडी 105 + सीडी 73; सीडी 105; सीडी 90; सीडी 73; सीडी 34 + सीडी 45 (सामान्य फ्लोरोफोर); प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए आइसोटाइप नियंत्रण। आगे के विश्लेषण के लिए प्रवाह साइटोमीटर पर कम से कम 10,000 की घटनाओं की कुल संख्या रिकॉर्ड करें।
नोट: चूंकि कोशिकाओं को प्रत्येक सतह मार्कर के लिए अलग से विश्लेषण किया जाता है, इसलिए सेल सबसेट पर गेटिंग की आवश्यकता नहीं होती है। - उपरोक्त मार्करों के अलावा, व्यक्तिगत कॉर्ड ऊतक नमूनों (तालिका 1) से बनाई गई यूएमएससी लाइनों में सकारात्मक और नकारात्मक सतह मार्करों की उपस्थिति की पुष्टि करें।
- प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा लेबल कोशिकाओं का विश्लेषण करें और सीडी 105 + सीडी 90 + और सीडी 105 + सीडी 73 + कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करें। सीडी 105+ और सीडी 34−सीडी 45− कोशिकाओं का अलग-अलग विश्लेषण करें।
3. कंकाल की मांसपेशियों में यूएमएससी का भेदभाव
- पीबीएस में 0.01% कोलेजन और 20 μg / एमएल लैमिनिन के साथ कोट टिशू कल्चर प्लेटें। कमरे के तापमान पर कम से कम 4 घंटे के लिए इन प्लेटों को कोट करें।
- विकास माध्यम में 10,000 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर प्लेट यूएमएससी।
- जब कोशिकाएं 70% संगम होती हैं, तो विकास माध्यम की आकांक्षा करें और पीबीएस के साथ संस्कृतियों 2x कुल्ला। यूएमएससी में डीएमईएम + 5% घोड़े के सीरम + 0.1 μM डेक्सामेथासोन + 50 μM हाइड्रोकार्टिसोन से युक्त मायोजेनिक भेदभाव माध्यम (एम 1) जोड़ें। मायोजेनिक प्रगति के कैनेटीक्स के निर्धारण के लिए, संस्कृतियों में हर दूसरे दिन एम 1 माध्यम जोड़ें।
- मायोजेनिक प्रगति के कैनेटीक्स को निर्धारित करने के लिए, क्रमशः 2 दिनों, 4-5 दिनों, 6-7 दिनों और 10-14 दिनों में पैक्स 7, मायोडी, मायोजेनिन और माईएचसी अभिव्यक्ति के लिए यूएमएससी का विश्लेषण करें।
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Representative Results
कॉर्ड ऊतक से यूएमएससी के अलगाव की सफलता >95% है, पूरे गर्भनाल रक्त से सफलता की खराब दरों के विपरीत। यूएमएससी के सफल अलगाव पर, एफएसीएस विश्लेषण से पता चलता है कि सभी कोशिकाएं सीडी 34−सीडी 45−सीडी 105 + सीडी 90 + हैं। हालांकि, तुलनात्मक विश्लेषण में, गर्भनाल रक्त से पृथक यूएमएससी विषम आबादी प्रदर्शित करते हैं, जिसमें कोशिकाओं का अनुपात सीडी 34 + सीडी 45 + सीडी 105 + (~ 15%) दिखाता है। इसके अतिरिक्त, डबल-पॉजिटिव सीडी 105 + सीडी 90 + संख्या में कम हैं (~ 5%) (पूरक चित्रा एस 1)। इसके परिणामस्वरूप गर्भनाल रक्त से यूएमएससी के बीच मायोजेनिक भेदभाव के स्तर में कमी आती है, क्योंकि मायोजेनेसिस के प्रेरण के लिए सीडी 105 और सीडी 90 अभिव्यक्ति दोनों की आवश्यकता होती है। यूएमएससी तालिका 1 में सूचीबद्ध मार्करों की अभिव्यक्ति भी प्रदर्शित करते हैं। यदि गर्भनाल रक्त-व्युत्पन्न यूएमएससी का संदूषण होता है, तो सीडी 34 + सीडी 45 + कोशिकाओं की उपस्थिति भी होगी। इसके परिणामस्वरूप मायोजेनिक भेदभाव के लिए चढ़ाना के लिए झूठी सेल गिनती होती है। एक संकेत है कि >90% कोशिकाएं सीडी 105 और सीडी 90 अभिव्यक्ति के लिए डबल पॉजिटिव हैं, यह है कि यूएमएससी ने किसी भी मेसोडर्मल वंश के लिए प्रतिबद्ध नहीं किया है और मल्टीपोटेंट बने हुए हैं, क्योंकि सीडी 105 और सीडी 90 अभिव्यक्ति दोनों भेदभाव पर डाउनरेगुलेट हैं। यूएमएससी फेनोटाइप की पुष्टि के लिए कई मार्करों का उपयोग करना अनिवार्य है, क्योंकि कोई भी निश्चित यूएमएससी मार्कर नहीं है। इस विश्लेषण में, हमने प्रयोगशाला में स्थापित प्रत्येक यूएमएससी लाइनों के लिए तालिका 1 में सूचीबद्ध सभी मार्करों की उपस्थिति का मूल्यांकन किया। इसके अतिरिक्त, हमने सीडी 105 और सीडी 90 (चित्रा 2 ए), साथ ही सीडी 105 और सीडी 73 (चित्रा 2 बी) की डबल-पॉजिटिव स्थिति निर्धारित की, यह सुनिश्चित करते हुए कि यूएमएससी कई प्रमुख मार्करों को व्यक्त करते हैं। यह एकल-सकारात्मक कोशिकाओं को दूषित करने से बचने के लिए आवश्यक है जो 0.05% से कम संख्या में मौजूद हैं।
चित्रा 1: कॉर्ड ऊतक से यूएमएससी के चरणबद्ध अलगाव और लक्षण वर्णन को दिखाते हुए योजनाबद्ध। संक्षिप्त नाम: मानव गर्भनाल ऊतक से यूएमएससी = मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: कॉर्ड ऊतक-व्युत्पन्न यूएमएससी में एमएससी मार्कर विश्लेषण (ए) यूएमएससी सीडी 105 और सीडी 90 की अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं और हेमटोपोइएटिक मार्कर, सीडी 34 और सीडी 45 व्यक्त नहीं करते हैं। तीन यूएमएससी लाइनों (यूसीटी 15, यूसीटी 18 और यूसीटी 26) के प्रतिनिधि एफएसीएस भूखंडों को दिखाया गया है (एन = 16)। पैनलों की शीर्ष पंक्ति सीडी 105 और सीडी 90 अभिव्यक्ति के लिए क्यू 2 चतुर्थांश सकारात्मक में सभी तीन यूएमएससी लाइनों में कोशिकाओं को दिखाती है। पैनलों की निचली पंक्ति सीडी 105 अभिव्यक्ति के लिए क्यू 1 चतुर्थांश सकारात्मक और सीडी 34 और सीडी 45 अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक में कोशिकाओं को दिखाती है। (बी) यूएमएससी एमएससी मार्कर, सीडी 73 (एन = 16) की अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं। संक्षिप्त नाम: मानव गर्भनाल ऊतक से यूएमएससी = मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| यूएमएससी सकारात्मक मार्कर | यूएमएससी नकारात्मक मार्कर |
| सीडी 105 | सीडी 34 |
| सीडी 90 | सीडी 45 |
| सीडी 73 | सीडी 106 |
| सीडी 29 | एचएलए डॉ. |
| सीडी 44 | सीडी 31 |
| एचएलए एबीसी | सीडी 14 |
| सीडी 49 ई | सीडी 49 ई |
| सीडी 54 | |
| सीडी 13 |
तालिका 1: यूएमएससी के लिए सकारात्मक और नकारात्मक मार्करों की सूची। संक्षिप्त नाम: मानव गर्भनाल ऊतक से यूएमएससी = मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं।
मायोजेनिक वंश में यूएमएससी के भेदभाव के लिए, यूएमएससी आमतौर पर पैक्स 7 को व्यक्त करते हैं, एम 1 के अलावा के पहले 2 दिनों के भीतर अग्रदूत कोशिकाओं के लिए एक मार्कर, एम 1 जोड़ (चित्रा 3) के पहले 4 दिनों के भीतर मायोडी द्वारा पीछा किया जाता है। भेदभाव के 6 दिनों में, कोशिकाएं मायोजेनिन प्रोटीन को व्यक्त करती हैं, इसके बाद भेदभाव के प्रेरण के 10 दिनों और 14 दिनों के बीच मायोसिन भारी श्रृंखला (एमवाईएचसी) की अभिव्यक्ति होती है। हमने इस प्रोटोकॉल की मजबूती की पुष्टि करते हुए, मायोजेनिक मार्करों की चरणबद्ध अभिव्यक्ति का दस्तावेजीकरण करने के लिए आरएनए अनुक्रमण, प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, आरटी-पीसीआर और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करके मायोजेनिक अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स को अधिक विस्तार से चित्रित किया। कंकाल की मांसपेशियों में विभेदित उदासीन यूएमएससी और यूएमएससी के बीच पूरे जीनोम ट्रांसक्रिप्टोमिक अनुक्रमण ने मायोजेनिक भेदभाव (चित्रा 4) के प्रेरण के जवाब में 907 जीनों के उत्थान का खुलासा किया।
चित्रा 3: कंकाल की मांसपेशियों में यूएमएससी का भेदभाव 2 दिनों, 4 दिनों, 7 दिनों और 10 दिनों के लिए एम 1 माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था और 2 दिनों के बाद (ए) पैक्स 7 के लिए मूल्यांकन किया गया था, (बी) 4 दिनों के बाद मायोडी, (सी) विभिन्न यूएमएससी लाइनों से मायोजेनिन अभिव्यक्ति, 7 दिनों के बाद टी 8, टी 12, टी 14 और टी 25 द्वारा निरूपित, और (डी) 10 दिनों के बाद एमवाईएचसी। स्केल सलाखों = (बी, डी) 50 μm। संक्षिप्त नाम: मानव गर्भनाल ऊतक से यूएमएससी = मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं; जीएपीडीएच = ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; मायोडी = मायोब्लास्ट निर्धारण प्रोटीन 1; मायएचसी = मायोसिन भारी श्रृंखला; डीएपीआई = 4 ',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; एमबी = मायोब्लास्ट; एमटी = मायोट्यूब। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: गर्भनाल रक्त और गर्भनाल ऊतक से प्राप्त यूएमएससी की तुलनात्मक ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग कंकाल की मांसपेशियों में विभेदित होती है। नियंत्रण यूएमएससी और यूएमएससी के बीच 907 जीनों की सामान्यीकृत गिनती का गर्मी मानचित्र कॉर्ड रक्त और कॉर्ड ऊतक से 7 दिनों के लिए कंकाल की मांसपेशियों में विभेदित होता है। वेन आरेख (बाएं) गर्भनाल रक्त-व्युत्पन्न यूएमएससी की तुलना में कॉर्ड ऊतक-व्युत्पन्न यूएमएससी में अपग्रेड किए गए मायोजेनिक जीन की एक बड़ी संख्या दिखाता है। नीचे दी गई तालिका कॉर्ड ऊतक और गर्भनाल रक्त दोनों में अपग्रेड किए गए सामान्य मायोजेनिक जीन को दर्शाती है। यह आंकड़ा मिश्रा एट अल.6 से है। संक्षिप्त नाम: 1, 2 = जैविक प्रतिकृतियां; सीबी 1,2 = गर्भनाल रक्त के यूएमएससी से प्राप्त मायोजेनिक कोशिकाएं; सीटी 1, 2 = कॉर्ड ऊतक के यूएमएससी से प्राप्त मायोजेनिक कोशिकाएं; सीओबी 1,2 = गर्भनाल रक्त से उदासीन यूएमएससी को नियंत्रित करें; सीओटी 1, 2 = कॉर्ड ऊतक से उदासीन यूएमएससी को नियंत्रित करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तुलनात्मक विश्लेषण करने के प्रयोजनों के लिए, हमने गर्भनाल रक्त और गर्भनाल ऊतक से पृथक यूएमएससी की तुलना की। आरएनए अनुक्रमण डेटा से पता चला है कि गर्भनाल के रक्त (चित्रा 4) से प्राप्त लोगों की तुलना में कॉर्ड ऊतक-व्युत्पन्न मायोजेनिक कोशिकाओं से यूएमएससी में अधिक मायोजेनिक जीन अपग्रेड किए गए थे। इस अध्ययन का समर्थन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले आरएनए अनुक्रमण डेटा को एनसीबीआई में अपलोड किया गया है (एसआरए परिग्रहण जीएसई 147114 है)। संक्षेप में, पैंथर गो-स्लिम डेटाबेस का उपयोग करके ऊतक-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण ने एक्टिन बाइंडिंग और सार्कोमियर असेंबली (टीपीएम 2, एलडीबी 3, पीपीएलआईएम 3, एफएचएल 1, नेक्सएन, एमवाईओएम 1) ट्रांसपोर्टरों से जुड़े साइटोस्केलेटल प्रोटीन की पहचान की, जो सिकुड़ा हुआ कार्य (आरटीएन 2, एसएलसी 1 9 ए 2, एसीएचई, एससीएन 1 बी, एसएलसी 1 9 ए 2, जेपीएच 2, केसीएनजे 12, एएनके) से जुड़े हैं। एफबीएक्सओ 32, टीआरआईएम 16 एल, जीएचआर), कैल्शियम सिग्नलिंग (एफकेबीपी 5), और एंजाइमेटिक फ़ंक्शन (सीओएक्स 7 ए 1, पीडीके 4) (चित्रा 4)। कुल मिलाकर, ये डेटा दर्शाते हैं कि कॉर्ड ऊतक-व्युत्पन्न यूएमएससी मजबूत मायोजेनिक क्षमता प्रदर्शित करने वाले एक डिब्बे का प्रतिनिधित्व करते हैं।
यूएमएससी लाइनों के बीच व्यक्तिगत भिन्नता के कारण जो अलगाव में दक्षता, यूएमएससी डिब्बे के भीतर विषमता, मां की उम्र और मां की स्वास्थ्य स्थिति से उत्पन्न हो सकती है, जिसमें उसके पोषक तत्वों के स्तर शामिल हैं, स्थापित यूएमएससी लाइनों के बीच प्रसार दर और मायोजेनिक क्षमता में अंतर हो सकता है। हालांकि, अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स में अंतर के बावजूद, मायोजेनिक मार्करों की चरणबद्ध अभिव्यक्ति के साथ मायोजेनेसिटी बढ़ाने की समग्र प्रवृत्ति को बनाए रखा जाता है।
पूरक चित्रा एस 1: गर्भनाल रक्त-व्युत्पन्न यूएमएससी में एमएससी मार्कर विश्लेषण। यूएमएससी सीडी 105 और हेमटोपोइएटिक मार्कर, सीडी 34 और सीडी 45 की अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं। सीडी 105+ आबादी के विश्लेषण से पता चलता है कि इन कोशिकाओं का केवल एक छोटा सा अनुपात सीडी 90 (एन = 5) को सह-व्यक्त करता है। संक्षिप्त नाम: मानव गर्भनाल ऊतक से यूएमएससी = मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत ऊतक का संग्रह है, प्रसव के समय से बाँझ संस्कृतियों के रखरखाव के लिए, प्रसार की पूरी अवधि के लिए। कॉर्ड संग्रह के दौरान, यह आवश्यक है कि कॉर्ड किसी भी गैर-निष्फल सतह को स्पर्श न करे और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक पीबीएस युक्त ट्यूबों में संग्रह से पहले 70% इथेनॉल के साथ बाहरी रूप से स्वैब किया जाए। यूएमएससी अलगाव के लिए ऊतक के कॉर्ड संग्रह और प्रसंस्करण के बीच के समय को सीमित करना महत्वपूर्ण है। यदि संग्रह की साइट से प्रयोगशाला तक ऊतक को परिवहन करने की आवश्यकता है, तो एंटीबायोटिक युक्त बफर में ऊतक को बनाए रखने और इसे बर्फ पर संग्रहीत करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
विधि के संशोधन और समस्या निवारण
यूएमएससी के मायोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण संशोधन 0.01% प्रकार 1 कोलेजन और 20 μg / एमएल लैमिनिन के साथ व्यंजनों की कोटिंग है। हमने देखा कि एम 1 माध्यम की उपस्थिति में यूएमएससी में मायोजेनिक प्रगति को बढ़ाया जाता है जब आसंजन की स्थिति भी संशोधित होती है। चाहे अन्य श्रेष्ठ का उपयोग, यद्यपि महंगा हो, मैट्रिगेल जैसे मैट्रिसेस इस प्रोटोकॉल में और सुधार कर सकते हैं, परीक्षण करने की आवश्यकता है। व्यक्तिगत नमूनों के बीच उपज में भिन्नता के परिणामस्वरूप कुछ ऊतक कम सेल गिनती पैदा कर सकते हैं। ऐसे उदाहरणों में, कॉर्ड ऊतक की अधिक लंबाई एकत्र करना बेहतर हो सकता है जो >5 सेमी है। इस संदर्भ में, कुछ रिपोर्टों ने यूएमएससी की उपज बढ़ाने के लिए 10 सेमी कॉर्ड ऊतक का उपयोग किया है। कॉर्ड ऊतक से यूएमएससी के अलगाव का वर्णन करने वाली अधिकांश रिपोर्टों ने कॉर्ड स्ट्रोमा 3,5,7,8 से कोशिकाओं की बढ़ती रिहाई के लिए बाह्य मैट्रिक्स-अपमानजनक एंजाइमों का उपयोग किया है। इस रिपोर्ट सहित कुछ अध्ययनों द्वारा एक्सप्लांट संस्कृतियों के उपयोग ने लगातार सेलुलर व्यवहार्यता में वृद्धि और उपज 6,9,10 का प्रदर्शन किया है। इसके अतिरिक्त, सेल आबादी को शुद्ध करने के लिए सेल सॉर्टिंग करने की आवश्यकता की अनुपस्थिति, जो अक्सर गर्भनाल रक्त से यूएमएससी को शुद्ध करने में शामिल होती है, सेलुलर संख्या और अखंडता को बढ़ाती है।
विधि की सीमाएँ
विधि की एक महत्वपूर्ण सीमा व्यक्तिगत कॉर्ड ऊतक नमूनों से यूएमएससी लाइनों की पूर्ण स्थापना के लिए आवश्यक समय है। आमतौर पर, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रत्येक यूएमएससी लाइन उत्पन्न करने के लिए 3 सप्ताह की आवश्यकता होती है। इसके बाद, पूर्ण मायोजेनिक भेदभाव के लिए 2 सप्ताह की आवश्यकता होती है। जांच की यह विस्तारित अवधि अंतर्गर्भाशयी परिवेश पर जानकारी प्राप्त करने या शरीर की संरचना जैसे संतान अंग चयापचय मापदंडों की भविष्यवाणी करने के इरादे से, विभिन्न प्रतिभागियों से यूएमएससी की भेदभाव क्षमता की जांच करने वाले बड़े समूहों में बोझिल हो सकती है। एक दूसरी सीमा कॉर्ड ऊतक मैट्रिक्स के भीतर विषमता है, जिसमें विभिन्न यूएमएससी डिब्बों के बीच आंतरिक फेनोटाइपिक अंतर हो सकते हैं और जो विभिन्न स्रोतों के बीच भेदभाव क्षमता के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, डब्ल्यूजे से यूएमएससी सीएल-व्युत्पन्न यूएमएससी11 की तुलना में कम ऑस्टियोजेनिक क्षमता प्रदर्शित करते हैं। इसलिए, यह विधि कॉर्ड ऊतक के भीतर विभिन्न डिब्बों के बीच निहित अंतर का वर्णन नहीं करती है।
मौजूदा विधियों के संबंध में विधि का महत्व
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम व्यक्तिगत कॉर्ड ऊतक नमूनों से 1 × 104 से 1 × 106 यूएमएससी की सेल गिनती प्राप्त करने में सक्षम हैं। इन यूएमएससी लाइनों को कम से कम 6-8 मार्गों के लिए परख के लिए मज़बूती से इस्तेमाल किया जा सकता है। मानव आबादी के विशिष्ट सेलुलर फेनोटाइप में भिन्नता की सीमा के बावजूद, उत्तर भारत की 15 महिलाओं के हमारे समूह में देखे गए यूएमएससी का औसत दोहरीकरण समय2 दिनों से भी कम था। 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू) के समावेश का उपयोग करके उनकी प्रसार दरों के विश्लेषण से पता चला है कि कम से कम 80% कोशिकाएं6 घंटे 6 की अवधि में एस-चरण से गुजरी थीं। इसके अतिरिक्त, कॉर्ड ऊतक से यूएमएससी भी कम बुढ़ापे की दर प्रदर्शित करते हैं, जो अलगाव 6 की इस विधि की मजबूती का संकेतदेते हैं। हमने पहले इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके यूएमएससी में मायोजेनिक प्रेरण की डिग्री की तुलना मानव और म्यूरिन प्लुरिपोटेंशियल स्टेम कोशिकाओं 6,12 में मायोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक के साथ की थी। हमने पाया कि यह प्रोटोकॉल मौजूदा प्रोटोकॉल की तुलना में मायोजेनिक भेदभाव का अधिक शक्तिशाली प्रेरक है।
विधि और अनुप्रयोगों का महत्व
सफल सेलुलर और पुनर्योजी उपचार सेलुलर व्यवहार्यता और उपज पर निर्भर हैं, प्रारंभिक मार्ग से बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, यह विधि नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक सुविधाजनक विकल्प प्रदान करती है। इस रिपोर्ट में प्रदान किए गए मजबूत मायोजेनिक भेदभाव प्रोटोकॉल और हमारे काम में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके मायोजेनिक प्रगति के गहन आणविक लक्षण वर्णन भ्रूण मायोजेनेसिस को पुन: प्राप्त करने के प्रयासों के पूरक हैं और अंतर्गर्भाशयी वातावरण की नकल करने और प्रसवोत्तर चयापचय को प्रतिबिंबित करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
हम फिल्मांकन और वीडियो निर्माण में उनकी मदद के लिए श्री ओजस टिक्कू को धन्यवाद देते हैं। हम गुरुग्राम सिविल अस्पताल के कर्मचारियों, नर्सों और वरिष्ठ अनुसंधान अधिकारियों और लॉजिस्टिक्स के साथ मदद के लिए डॉ पल्लवी क्षेत्रपाल से प्राप्त मदद को भी स्वीकार करते हैं। इस कार्य को जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत (बीटी/09/आईवाईबीए/2015) से सुचित्रा गोपीनाथ को दिए गए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; बीटी/पीआर29599/पीएफएन/20/1393/2018)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
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