Descrevemos um protocolo para o isolamento das células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano e sua diferenciação na linhagem muscular esquelética.
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Artigo de método
Geração de Células-Tronco Mesenquimal do Tecido do Cordão Umbilical Humano e sua Diferenciação na Linhagem Muscular Esquelética
Neste artigo
Resumo
Resumo
Explorar o potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais depende da facilidade de isolamento, potência em direção à diferenciação e confiabilidade e robustez da fonte. Descrevemos aqui um protocolo stepwise para o isolamento de células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano (uMSCs), sua imunofenofoteca, e a propagação de tais culturas ao longo de várias passagens. Neste procedimento, a viabilidade dos MOSCs é alta porque não há digestão enzimática. Além disso, a remoção dos vasos sanguíneos, incluindo as artérias do cordão umbilical e a veia, garante que não haja contaminação de células de origem endotelial. Usando citometria de fluxo, os uMSCs no isolamento são CD45-CD34−, indicando ausência de células da linhagem hematopoiética. É importante ressaltar que eles expressam marcadores de superfície chave, CD105, CD90 e CD73. Após o estabelecimento de culturas, este artigo descreve um método eficiente para induzir a diferenciação nesses FUSÕES na linhagem muscular esquelética. Uma análise detalhada da progressão miogênica em uMSCs diferenciados revela que os uMSCs expressam Pax7, um marcador para progenitores miogênicos nos estágios iniciais de diferenciação, seguido pela expressão de MyoD e Myf5, e, finalmente, um marcador de diferenciação terminal, cadeia pesada de miosina (MyHC).
Introdução
O cordão umbilical humano foi creditado por possuir um robusto reservatório de células-tronco mesenquimais, que atualmente estão sendo exploradas para terapias regenerativas devido às suas robustas taxas de proliferação e diferenciação, propriedades imunomodulatórias e capacidade de gerar células de todas as três camadas germinativas1. O tecido do cordão umbilical consiste em múltiplos compartimentos, como o sangue do cordão umbilical, o subendotélio da veia umbilical e a geleia de Wharton (WJ), que por si só abrange três regiões indistintas - a zona perivascular, a zona intervascular e o subameamento ou o revestimento do cordão (CL)
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Protocolo
O uso de tecido do cordão umbilical neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Pesquisa de Células-Tronco (IC-SCR), pelo Comitê de Ética Institucional, Instituto Translacional de Ciência e Tecnologia em Saúde (IEC-THSTI), pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Civil, Gurugram, Haryana e pelo Comitê de Biossegurança Institucional, THSTI. Amostras de tecido do cordão humano foram colhidas a partir de partos a termo no momento do nascimento. O consentimento por escrito informado foi obtido dos sujeitos. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes.
1. Isolamento de MSCs do t....
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Resultados
O sucesso do isolamento dos UMSCs do tecido do cordão umbilical é >95%, ao contrário das baixas taxas de sucesso do sangue do cordão umbilical. Após o isolamento bem-sucedido dos uMSCs, a análise facs revela que todas as células são CD34−CD45−CD105+CD90+. No entanto, na análise comparativa, os ICSS isolados do sangue do cordão umbilical apresentam populações heterogêneas, em que uma proporção de células mostram CD34+CD45+CD105+ (~15%). Além d.......
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Discussão
Passos críticos
Um passo crítico neste protocolo é a coleta de tecido em condições assépticas, desde o momento da entrega até a manutenção de culturas estéreis, durante toda a duração da propagação. Durante a coleta do cabo, é essencial que o cabo não toque em nenhuma superfície não esterilizada e seja examinado externamente com 70% de etanol antes da coleta em tubos contendo PBS complementados com antibióticos. É importante limitar o tempo entre a coleta do cabo e o processamento do tecido para o iso.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos ao Sr. Ojas Tikoo pela ajuda nas filmagens e produção de vídeo. Também reconhecemos a ajuda recebida da equipe do GARBH-Ini (Grupo Interdisciplinar de Pesquisa Avançada e Resultado de Nascimento-DBT-Índia), enfermeiros e altos oficiais de pesquisa do Gurugram Civil Hospital e do Dr. Pallavi Kshetrapal para ajudar na logística. Este trabalho foi apoiado por subvenções concedidas a Suchitra Gopinath do Departamento de Biotecnologia da Índia (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Anfotericina B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Solução antibiótica 100x Líquido, endotoxina testada (10.000 U de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL em solução salina normal a 0,9%) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anticorpo anti-GAPDH | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anticorpo anti-MyHC (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anticorpo anti-MyoD (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anticorpo antimiogenina (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anticorpo anti-Pax7 | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Camundongo anti-clone CD90 humano 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Colágeno Tipo 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glicose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexametasona | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II ou FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Soro Bovino Fetal, qualificado Brasil | GIBCO | 10270106 | não ser inativado |
| por calor FITC Mouse anti-humano Clone CD106 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-clone CD14 humano M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-clone CD31 humano WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-clone CD34 humano 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-clone CD45 humano HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| Clone anti-humano CD49D do camundongo FITC 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| Clone anti-humano CD90 do rato FITC 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| clone anti-humano HLA-A, B, C do rato FITC G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| clone anti-humano G18-145 do rato FITC | Biosciences | 555786 | |
| FlowJo | |||
| Gentamicina | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Soro de cavalo | HiMedia | RM1239 | |
| Hidrocortisona | Merck | H4001 | |
| Laminina | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modificação sem L-glutamina, ribonucleosídeos e desoxirribonucleosídeos | Hyclone | SH30568. FS | Meio basal para uMSCs |
| PE Mouse anti-clone CD105 humano 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-clone CD44 humano 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-clone CD49E humano llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-clone IgG humano G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-humano CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH = 7,4 | Solução de | M1866 | |
| (1x 0,25% de tripsina e 0,02% de EDTA em solução salina balanceada Hanks (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
Referências
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L.
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Reimpressões e permissões
