Summary
Vi beskriver en protokoll for isolering av mesenchymale stamceller fra humant navlestrengsvev og deres differensiering i skjelettmuskellinjen.
Abstract
Å utforske det terapeutiske potensialet til mesenchymale stamceller er betinget av enkel isolasjon, styrke mot differensiering og kildens pålitelighet og robusthet. Vi beskriver her en trinnvis protokoll for isolering av mesenchymale stamceller fra humant navlestrengsvev (uMSCs), deres immunofenotyping og forplantning av slike kulturer over flere passasjer. I denne prosedyren er levedyktigheten til uMSCene høy fordi det ikke er noen enzymatisk fordøyelse. Videre sikrer fjerning av blodkar, inkludert navlestrengsarteriene og venen, at det ikke er forurensning av celler av endotel opprinnelse. Ved hjelp av strømningscytometri er uMSCer ved isolasjon CD45-CD34−, noe som indikerer fravær av celler fra den hematopoietiske avstamningen. Det er viktig at de uttrykker viktige overflatemarkører, CD105, CD90 og CD73. Ved etablering av kulturer beskriver denne artikkelen en effektiv metode for å indusere differensiering i disse uMSCene i skjelettmuskellinjen. En detaljert analyse av myogen progresjon i differensierte uMSCer avslører at uMSCs uttrykker Pax7, en markør for myogene forfedre i de første stadiene av differensiering, etterfulgt av uttrykket myoD og Myf5, og til slutt en terminal differensieringsmarkør, myosin tung kjede (MyHC).
Introduction
Den menneskelige navlestrengen har blitt kreditert for å ha et robust reservoar av mesenchymale stamceller, som for tiden utforskes for regenerative terapier på grunn av deres robuste sprednings- og differensieringshastigheter, immunmodulerende egenskaper og evne til å generere celler fra alle de tre bakterielagene1. Navlestrengsvevet består av flere rom som navlestrengsblodet, navlestrengsunderen og Whartons gelé (WJ), som i seg selv omfatter tre utydelige regioner - perivascularsonen, den intervaskulære sonen og sub-amnion eller ledningsforingen (CL)2. Selv om uMSCer kan isoleres fra alle disse forskjellige regionene og bredt uttrykke viktige MSC-markører, er det ingen klarhet i om disse rommene inneholder samme populasjon av uMSCer eller viser forskjeller i differensieringspottencies3. Derfor krever protokoller for isolering av uMSCer en større presisjon i deres modus og isolasjonsområde, den robuste karakteriseringen av differensieringspotensialer, og til slutt en komparativ analyse fra forskjellige rom i ledningen.
I denne sammenhengen har få studier vist forskjeller i uMSC proliferative og differensierende potensialer mellom ulike deler av ledningen. Av disse viste komparative analyser mellom uMSCer isolert fra CL- og WJ-regionene et større proliferativt potensial i CL-avledede uMSCer 3,4. I en egen studie presterte WJ-avledede uMSCer bedre i proliferasjonsanalyser sammenlignet med perivasculære celler (HUCPV)5. Ved å undersøke forskjeller mellom blodavledede uMSCer og hjertevevsavledede uMSCer uten vaskulær forurensning, ble det rapportert forskjellsuttrykk for viktige MSC-markører mellom de to rommene, samt økte spredningshastigheter i ledningsvevsavledede uMSCer6.
Av de flere studiene som undersøker differensieringspotensialene til uMSCer primært i vev av mesoderm-slekten som osteogen, adipogene og kondrogene avstamninger, har svært få gitt detaljerte protokoller for myogen differensiering og etterfølgende karakterisering, samt komparative analyser mellom ulike ledningsrom. I denne sammenhengen har vi utviklet en robust muskeldifferensieringsprotokoll og observert at ledningsvevsavledede uMSCer viser overlegne myogene differensieringsevner sammenlignet med ledningsblod6. Her er en trinnvis protokoll detaljert for isolering av uMSCer fra hele ledningsvevet uten celler forbundet med vaskulaturen, deres karakterisering og deres differensiering i den myogene avledningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruken av navlestrengsvev i denne studien ble godkjent av Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), Institutional Ethics Committee, Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana og Institutional Biosafety Committee, THSTI. Humane ledningsvevsprøver ble høstet fra terminleveranser på fødselstidspunktet. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra . Alle metoder ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter.
1. Isolering av MSCer fra ledningsvev
- På leveringstidspunktet, kutt minst 5 cm ledning, helst nærmere morkaken, og steriliser ledningen ved å swabbing den ytre overflaten med 70% etanol. Overfør ledningsvevet sekvensielt fra ett 50 ml oppsamlingsrør som inneholder fosfatbufret saltvann (PBS) til en annen som inneholder det samme. Transporter oppsamlingsrøret med navnet på motivet på is til laboratoriet innen 1 time.
MERK: For en større studie kan det være nyttig å strekkode prøvene for å aktivere sporing gjennom hele studien. Viktigst, alt personell som håndterer menneskelig vev bør tilbys hele regimet til hepatitt B-vaksinen. - I laboratoriet slår du på UV-en i 25 minutter i BSL-2-hetten for å sterilisere autoklavede instrumenter og pipetter før bruk.
- Overfør ledningsvevsstykket fra oppsamlingsrøret til en 10 cm2 vevskulturbehandlet tallerken som inneholder PBS beriket med 5 g/L glukose, 50 μg/ml gentamicin, 2,5 μg/ml amfotericin B, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin (skjematisk i figur 1).
- Bruk en skalpell, skjær ledningsvevet vertikalt langs sin langsgående akse for å oppnå to halve sylindriske stykker. På grunn av ledningssprengning og mucoidoverflaten, fest vevet med et par tang holdt i den andre hånden.
- På dette tidspunktet observere navlestrengene og venen og fjerne blodkarene ved å bruke en skalpell for å skrape dem av i en retning fra overflaten. Skyll ledningsvevet igjen i PBS for å fjerne alt gjenværende blod som er forbundet med vevet. Sørg for at skrapingen er skånsom for å bevare integriteten til cellene i WJ rundt karene.
- Hakk hver halvdel av ledningsvevet i fragmenter på 0,5 cm3 størrelse og legg fragmentene med lysflaten vendt ned på parabolen. Inkuber retten kort i 10 min i et 37 °C fuktig kammer som inneholder 5 % CO2.
- Etter inkubasjon, oversvømme parabolen som inneholder ledningsvevsstykker med 20 ml medium som inneholder MEM Alpha-modifikasjon uten L-glutamin, ribo- og deoksyribonukleosider, 15% foster bovint serum (ikke varmeinaktivert) og 50 μg/ml gentamycin. Tilsett vekstmediet forsiktig langs sidene for å forhindre at vevet løsner fra orienteringen. Legg til overflødig medium for å ta hensyn til en brøkdel som vil bli gjennomvåt av vevet utviser under inkubasjon.
- Etter 3 dager med inkubasjon, legg til friskt medium til kulturene. Sørg for at kulturene er beskyttet mot støt og bevegelse av explants mens du håndterer oppvasken.
- Etter 1 uke, fjern vevsfragmentene individuelt ved hjelp av sterile tang og kast med passende biofareposer for avhending. Behold det eksisterende mediet og tilsett 10 ml fersk vekstmedium. Erstatt vekstmediet hver fjerde dag til individuelle kolonier når en sammenløp på 70%.
MERK: Det er sannsynlig at cellene ikke vil bli jevnt fordelt gjennom hele parabolen, da det vil være individuelle proliferative kolonier som må overvåkes for samløp med tiden. Vanligvis, innen en måned, genererer en 10 cm2 tallerken nok celler til å bli delt inn i en egen tallerken. - Høst tilhengercellene ved hjelp av trypsin/EDTA-oppløsning (1x 0,25 % trypsin og 0,02 % EDTA i Hanks Balansert saltløsning [HBSS]). Sentrifuger cellesuspensjonen ved 470 × g i 5 min ved 25 °C og resuspend cellepellet i vekstmedium.
2. Immunofenotyping og forplantning av uMSCS
- Fortsett til immunofenotyping når tilhengercellene har nådd 50% -60% samløp og er godt spredt. Ikke utfør MSC-markøranalyse på fullt sammenfallende kulturer, da dette har en tendens til å forårsake nedregulering av viktige MSC-markører.
- Etter trypsinisering, fordel en celle suspensjon på 1 × 106 celler / ml i FACS rør (1 × 105 celler / rør) og flekk med passende fluorofor-koblede antistoffer (alle 1:50 fortynning) i kombinasjon: unstained; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (vanlig fluorofor); isotypekontroller for hver fluorofor. Registrer et totalt antall hendelser på minst 10 000 på strømningscytometeret for videre analyse.
MERK: Siden cellene analyseres for hver overflatemarkør separat, er det ikke nødvendig å stirre på celledelsett. - I tillegg til markørene ovenfor, bekreft tilstedeværelsen av positive og negative overflatemarkører i uMSC-linjer opprettet fra individuelle ledningsvevsprøver (tabell 1).
- Analyser cellene merket med flytcytometri og finn ut prosentandelen av CD105+CD90+ og CD105+CD73+-celler. Analyser CD105+ og CD34-CD45-celler separat.
3. Differensiering av uMSC i skjelettmuskulatur
- Frakkvev kulturplater med 0,01% kollagen og 20 μg / ml laminin i PBS. Belegge disse platene i minst 4 timer ved romtemperatur.
- Plate uMSCer med en tetthet på 10.000 celler / cm2 i vekstmedium.
- Når cellene er 70% konfluente, aspirer vekstmediet og skyll kulturene 2x med PBS. Tilsett myogen differensieringsmedium (M1) som består av DMEM + 5% hesteserum + 0,1 μM deksametason + 50 μM hydrokortison til uMSCene. For bestemmelse av kinetikken til myogen progresjon, legg M1 medium annenhver dag til kulturene.
- For å bestemme kinetikken til myogen progresjon, analyser uMSCer for henholdsvis Pax7, MyoD, Myogenin og MyHC-uttrykk etter 2 dager, 4-5 dager, 6-7 dager og 10-14 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Suksessen med isolasjon av uMSC fra ledningsvev er >95%, i motsetning til de dårlige suksessratene fra hel ledningsblod. Ved vellykket isolering av UMSCer viser FACS-analysen at alle cellene er CD34-CD45−CD105+CD90+. I komparativ analyse viser imidlertid uMSCer isolert fra ledningsblodvisning heterogene populasjoner, der en andel av cellene viser CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%). I tillegg er dobbeltpositive CD105+CD90+ færre i antall (~5 %) (tilleggstall S1). Dette resulterer i redusert nivåer av myogen differensiering blant uMSCs fra ledningsblod, da både CD105 og CD90 uttrykk er nødvendig for induksjon av myogenese. uMSCer viser også uttrykket for markørene som er oppført i tabell 1. Hvis det er forurensning av ledningen blodavledede uMSCer, vil det også være en tilstedeværelse av CD34 + CD45 + celler. Dette resulterer i falske celle teller for plating for myogen differensiering. En indikasjon på at >90 % av cellene er dobbelt positive for CD105- og CD90-uttrykket, er at UMSCene ikke har forpliktet seg til noen mesodermal avstamning og fortsetter å forbli multipotent, ettersom både CD105- og CD90-uttrykket er nedregulert ved differensiering. Det er viktig å bruke flere markører for bekreftelse av uMSC-fenotyper, da det ikke er noen enkelt definitiv uMSC-markør. I denne analysen evaluerte vi tilstedeværelsen av alle markørene som er oppført i tabell 1 for hver av uMSC-linjene som er etablert i laboratoriet. I tillegg har vi fastslått den dobbeltpositive statusen til CD105 og CD90 (figur 2A), i tillegg til CD105 og CD73 (figur 2B), noe som sikrer at UMSCene uttrykker flere nøkkelmarkører. Dette er nødvendig for å unngå å forurense enkeltpositive celler som er til stede i antall mindre enn 0,05%.
Figur 1: Skjematisk som viser trinnvis isolasjon og karakterisering av UMSCer fra ledningsvev. Forkortelse: uMSCs = mesenchymale stamceller fra humant navlestrengsvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: MSC-markøranalyse i trådløsvevsavledede uMSCer. (A) uMSCer viser uttrykket for CD105 og CD90 og uttrykker ikke hematopoietiske markører, CD34 og CD45. Representative FACS-plott på tre uMSC-linjer (UCT15, UCT18 og UCT26) vises (N = 16). Øverste rad med paneler viser celler i alle tre uMSC-linjene i Q2-kvadranten som er positiv for CD105- og CD90-uttrykk. Nederste rad med paneler viser celler i Q1-kvadranten som er positive for CD105-uttrykk og negative for CD34- og CD45-uttrykk. (B) uMSCer viser uttrykket for MSC-merket, CD73 (N = 16). Forkortelse: uMSCs = mesenchymale stamceller fra humant navlestrengsvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| uMSC positive markører | uMSC-negative markører |
| CD105 | CD34 |
| CD90 | CD45 |
| CD73 | CD106 |
| CD29 | HLA DR |
| CD44 | CD31 |
| HLA ABC | CD14 |
| CD49e | CD49e |
| CD54 | |
| CD13 |
Tabell 1: Liste over positive og negative markører for UMSCer. Forkortelse: uMSCs = mesenchymale stamceller fra humant navlestrengsvev.
For differensiering av UMSCer i den myogene slektslinjen uttrykker uMSCer vanligvis Pax7, en markør for forløperceller i løpet av de første 2 dagene etter tilsetningen av M1, etterfulgt av MyoD innen de første 4 dagene etter M1-tillegg (figur 3). Ved 6 dager med differensiering uttrykker celler Myogenin protein, etterfulgt av uttrykket av Myosin tung kjede (MyHC) mellom 10 dager og 14 dager etter induksjon av differensiering. Vi karakteriserte mer detaljert kinetikken til myogentikeruttrykk ved hjelp av RNA-sekvensering, strømningscytometri, immunocytokjemi, RT-PCR og vestlig blotanalyse for å dokumentere det trinnvise uttrykket av myogene markører, som bekrefter robustheten til denne protokollen. Fullgenomtranskripsjonssekvensering mellom uifferensierte uMSCer og uMSCer som ble differensiert til skjelettmuskulatur, avslørte oppreguleringen av 907 gener som svar på induksjonen av myogen differensiering (figur 4).
Figur 3: Differensiering av uMSCer i skjelettmuskulatur. uMSCer ble dyrket i M1 medium i 2 dager, 4 dager, 7 dager og 10 dager og vurdert for (A) Pax7 etter 2 dager, (B) MyoD etter 4 dager, (C) Myogenin uttrykk fra forskjellige uMSC linjer, betegnet av T8, T12, T14, og T25 etter 7 dager, og (D) MyHC etter 10 dager. Skalastenger = (B, D) 50 μm. Forkortelser: uMSCs = mesenchymale stamceller fra humant navlestrengsvev; GAPDH = glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase; MyoD = myoblastbestemmelse protein 1; MyHC = myosin tung kjede; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; Mb = myoblast; MT = myotube. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Komparativ transkripsjonsprofilering av uMSCer avledet fra ledningsblod og ledningsvev differensiert i skjelettmuskulatur. Varmekart over normaliserte tellinger av 907 gener mellom kontroll uMSCs og uMSCs differensiert i skjelettmuskulatur i 7 dager fra ledningsblod og ledningsvev. Venn diagram (venstre) viser et større antall myogene gener upregulert i ledning vev-avledet uMSCs sammenlignet med ledning blod-avledet uMSCs. Tabellen nedenfor viser de vanlige myogene genene som er oppregulert i både ledningsvev og ledningsblod. Denne figuren er fra Mishra et al.6. Forkortelser: 1, 2 = biologiske repliker; CB1,2 = myogene celler avledet fra uMSC av ledningsblod; CT1, 2 = myogene celler avledet fra uMSC av ledningsvev; coB1,2 = kontrollere uifferensierte uMSCer fra ledningsblod; coT1, 2 = kontrollere uifferensierte UMSCer fra ledningsvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å gjennomføre en komparativ analyse sammenlignet vi uMSCer isolert fra ledningsblod og ledningsvev. RNA-sekvenseringsdata viste at det var flere myogene gener oppregulert i uMSCer fra ledningsvevsavledede myogene celler enn fra de som er avledet fra ledningsblod (figur 4). RNA-sekvenseringsdataene som brukes til å støtte denne studien, lastes opp til NCBI (SRA-tiltredelse er GSE147114). Kort fortalt identifiserte vevsspesifikk transkripsjonsanalyse ved hjelp av PANTHER GO-slank database cytoskeletale proteiner assosiert med aktinbinding og sarkomermontering (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) transportører assosiert med kontraktilfunksjon (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), vedlikehold av muskelmasse ( FBXO32, TRIM16L, GHR), kalsiumsignalering (FKBP5) og enzymatisk funksjon (COX7A1, PDK4) (figur 4). Til sammen viser disse dataene at ledningsvevsavledede UMSCer representerer et rom som viser robust myogent potensial.
På grunn av individuell variasjon mellom uMSC-linjer som kan oppstå som følge av effektivitet isolert sett, heterogenitet i uMSC-rommet, morens alder og mors helsestatus, inkludert næringsnivået, kan det være forskjeller i spredningshastigheter og myogene potensialer mellom etablerte uMSC-linjer. Til tross for forskjeller i uttrykkskinetikken opprettholdes imidlertid den generelle trenden med å øke myogeniteten med det scenevise uttrykket av myogene markører.
Supplerende figur S1: MSC-markøranalyse i blodavledede uMSCer med ledning. uMSCer viser uttrykket for CD105- og hematopoietiske markører, CD34 og CD45. Analyse av CD105+ -populasjonen viser at bare en liten andel av disse cellene uttrykker CD90 (N = 5). Forkortelse: uMSCs = mesenchymale stamceller fra humant navlestrengsvev. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn
Et kritisk skritt i denne protokollen er innsamling av vev under aseptiske forhold, fra leveringstidspunktet til vedlikehold av sterile kulturer, for hele varigheten av forplantningen. Under ledningsoppsamling er det viktig at ledningen ikke berører noen ikke-sterilisert overflate og er eksternt vattstein med 70% etanol før oppsamling i rør som inneholder PBS supplert med antibiotika. Det er viktig å begrense tiden mellom ledningsoppsamling og behandling av vevet for uMSC-isolasjon. I tilfelle det er behov for å transportere vev fra innsamlingsstedet til laboratoriet, må det tas hensyn til å opprettholde vevet i antibiotikaholdige buffere og lagre det på is.
Endringer og feilsøking av metoden
Den viktigste modifikasjonen i denne protokollen for å indusere myogen differensiering av uMSCer er belegget av retter med 0,01% type 1 kollagen og 20 μg / ml laminin. Vi observerte at myogen progresjon i uMSCs i nærvær av M1 medium er forbedret når vedheft forhold er også modulert. Hvorvidt bruk av andre overlegne, om enn dyre, matriser som Matrigel kan forbedre denne protokollen ytterligere, må testes. Variasjoner i utbyttet mellom individuelle prøver kan føre til at noen vev genererer et lavere celleantall. I slike tilfeller kan det være å foretrekke å samle en større lengde av ledningsvev som er >5 cm. I denne sammenhengen har få rapporter brukt 10 cm ledningsvev for å øke utbyttet av uMSCer. De fleste rapportene som beskriver isolering av uMSCs fra ledningsvev har gjort bruk av ekstracellulære matrise-nedbrytende enzymer for økt frigjøring av celler fra ledning stroma 3,5,7,8. Bruken av eklantkulturer av noen få studier, inkludert denne rapporten, har kontinuerlig vist økt cellulær levedyktighet og gir 6,9,10. I tillegg øker fraværet av behovet for å utføre cellesortering for å rense cellepopulasjoner, som ofte er inkludert i rensing av uMSCer fra ledningsblod, cellulære tall og integritet.
Begrensninger ved metoden
En viktig begrensning av metoden er tiden som kreves for fullstendig etablering av uMSC-linjer fra individuelle ledningsvevsprøver. Vanligvis kreves det 3 uker for å generere hver uMSC-linje ved hjelp av denne protokollen. Etter dette kreves 2 uker for fullstendig myogen differensiering. Denne utvidede varigheten av undersøkelsen kan være tungvint i store kohorter som undersøker differensieringspotensialene til uMSCer fra forskjellige deltakere, med den hensikt å skaffe informasjon om det intrauterine miljøet eller forutsi avkom organ metabolske parametere som kroppssammensetning. En annen begrensning er heterogeniteten i ledningsvevsmatrisen, som kan ha iboende fenotypiske forskjeller mellom de ulike uMSC-rommene og som kan være ansvarlig for differensieringspotensialer blant de forskjellige kildene. For eksempel viser uMSCer fra WJ lavere osteogent potensial sammenlignet med CL-avledede uMSCer11. Derfor beskriver denne metoden ikke forskjellene mellom forskjellige rom i selve ledningsvevet.
Betydningen av metoden med hensyn til eksisterende metoder
Ved hjelp av denne protokollen kan vi få et celleantall på 1 × 104 til 1 × 106 uMSCer fra individuelle ledningsvevsprøver. Disse uMSC-linjene kan brukes pålitelig til analyser i minst 6-8 passasjer. Til tross for variasjonen i cellulære fenotyper som er typiske for menneskelige populasjoner, var den gjennomsnittlige doblingstiden for uMSCer observert i vår kohort på 15 kvinner fra Nord-India mindre enn 2 dager6. En analyse av deres proliferative rater ved hjelp av inkorporering av 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) viste at minst 80% av cellene hadde gått gjennom S-fasen i et spenn på 6 h6. I tillegg viser uMSCer fra ledningsvev også lave senescence-hastigheter, noe som indikerer robustheten til denne isolasjonsmetoden6. Vi har tidligere sammenlignet graden av myogen induksjon i UMSCs ved hjelp av denne protokollen med den som brukes til å indusere myogenese i humane og murine pluripotential stamceller 6,12. Vi fant ut at denne protokollen er en mer potent induser av myogen differensiering enn eksisterende protokoller.
Viktigheten av metoden og applikasjonene
Vellykkede cellulære og regenerative terapier er avhengige av cellulær levedyktighet og utbytte, som krever et stort antall celler fra tidlige passasjer. Dermed tilbyr denne metoden et praktisk alternativ for kliniske applikasjoner. Den robuste myogene differensieringsprotokollen som er gitt i denne rapporten og den dyptgående molekylære karakteriseringen av myogen progresjon ved hjelp av denne protokollen i vårt arbeid utfyller innsatsen for å rekapitulere fosterets myogenese og kan brukes som modell for å etterligne det intrauterine miljøet og reflektere postnatal metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Mr. Ojas Tikoo for deres hjelp med filming og videoproduksjon. Vi anerkjenner også hjelpen mottatt fra GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India) ansatte, sykepleiere og seniorforskere ved Gurugram Civil Hospital og Dr. Pallavi Kshetrapal for hjelp med logistikk. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd tildelt Suchitra Gopinath fra Institutt for bioteknologi, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
