Summary
Nous décrivons un protocole pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation dans la lignée musculaire squelettique.
Abstract
L’exploration du potentiel thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses dépend de la facilité d’isolement, de la puissance vers la différenciation, ainsi que de la fiabilité et de la robustesse de la source. Nous décrivons ici un protocole par étapes pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain (cSM), leur immunophénotypage et la propagation de telles cultures sur plusieurs passages. Dans cette procédure, la viabilité des uMSC est élevée car il n’y a pas de digestion enzymatique. De plus, l’ablation des vaisseaux sanguins, y compris les artères du cordon ombilical et la veine, garantit qu’il n’y a pas de contamination des cellules d’origine endothéliale. En utilisant la cytométrie en flux, les cSEm lors de l’isolement sont CD45−CD34−, ce qui indique une absence de cellules de la lignée hématopoïétique. Il est important de noter qu’ils expriment les marqueurs de surface clés, CD105, CD90 et CD73. Lors de l’établissement des cultures, cet article décrit une méthode efficace pour induire la différenciation de ces uMSC dans la lignée musculaire squelettique. Une analyse détaillée de la progression myogénique dans les uMSC différenciés révèle que les uMSC expriment Pax7, un marqueur des progéniteurs myogéniques dans les premiers stades de différenciation, suivis de l’expression de MyoD et Myf5, et, enfin, d’un marqueur de différenciation terminal, la chaîne lourde de myosine (MyHC).
Introduction
Le cordon ombilical humain a été crédité de posséder un réservoir robuste de cellules souches mésenchymateuses, qui sont actuellement explorées pour les thérapies régénératives en raison de leurs taux de prolifération et de différenciation robustes, de leurs propriétés immunomodulatrices et de leur capacité à générer des cellules à partir des trois couches germinales1. Le tissu du cordon ombilical se compose de plusieurs compartiments tels que le sang de cordon ombilical, le sous-endothélium de la veine ombilicale et la gelée de Wharton (WJ), qui englobe en soi trois régions indistinctes: la zone périvasculaire, la zone intervasculaire et le sous-amnion ou la muqueuse du cordon (CL)2. Bien que les uMSC puissent être isolés de toutes ces différentes régions et exprimer largement les marqueurs clés du MSC, il n’est pas clair si ces compartiments contiennent la même population d’uMSC ou présentent des différences dans leurs puissances de différenciation3. Par conséquent, les protocoles d’isolement des uMSC nécessitent une plus grande précision dans leur mode et leur région d’isolement, la caractérisation robuste des potentiels de différenciation et, enfin, une analyse comparative à partir de différents compartiments du cordon.
Dans ce contexte, peu d’études ont démontré des différences dans les potentiels prolifératifs et différentiatifs de l’uMSC entre les différentes parties du cordon. Parmi ceux-ci, des analyses comparatives entre des uMSC isolés des régions CL et WJ ont révélé un plus grand potentiel prolifératif dans les uMSC dérivés de CL 3,4. Dans une étude distincte, les uMSC dérivés du WJ ont obtenu de meilleurs résultats dans les essais de prolifération que les cellules périvasculaires (HUCPV)5. Lors de l’examen des différences entre les cSEm dérivés du sang de cordon et les cSEm dérivés du tissu de cordon ombilical dépourvus de contamination vasculaire, une expression différentielle des marqueurs clés du CSM a été rapportée entre les deux compartiments, ainsi qu’une augmentation des taux de prolifération dans les cSEm dérivés du tissu du cordon6.
Parmi les nombreuses études examinant les potentiels de différenciation des cSEm principalement dans les tissus de la lignée mésodermique tels que les lignées ostéogéniques, adipogéniques et chondrogènes, très peu ont fourni des protocoles détaillés pour la différenciation myogénique et la caractérisation ultérieure, ainsi que des analyses comparatives entre divers compartiments du cordon. Dans ce contexte, nous avons développé un protocole robuste de différenciation musculaire et observé que les uMSC dérivés du tissu du cordon présentaient des capacités de différenciation myogénique supérieures à celles du sang de cordon6. Ici, un protocole par étapes est détaillé pour l’isolement des uMSC de l’ensemble du tissu du cordon dépourvu de cellules associées au système vasculaire, leur caractérisation et leur différenciation dans la lignée myogénique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
L’utilisation du tissu de cordon ombilical dans cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel pour la recherche sur les cellules souches (IC-SCR), le Comité d’éthique institutionnelle, l’Institut translationnel des sciences et de la technologie de la santé (IEC-THSTI), le Comité d’éthique institutionnelle de l’hôpital civil de Gurugram, Haryana, et le Comité institutionnel de biosécurité, THSTI. Des échantillons de tissu de cordon humain ont été prélevés lors d’accouchements à terme au moment de la naissance. Le consentement écrit éclairé a été obtenu des sujets. Toutes les méthodes ont été mises en œuvre conformément aux directives et réglementations pertinentes.
1. Isolement des CSM du tissu du cordon ombilical
- Au moment de l’accouchement, coupez au moins 5 cm de cordon, de préférence plus près du placenta, et stérilisez le cordon en frottant la surface extérieure avec de l’éthanol à 70%. Transférer séquentiellement le morceau de tissu de cordon d’un tube de collecte de 50 mL contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à un autre contenant la même chose. Transporter le tube de collecte portant le nom du sujet sur glace jusqu’au laboratoire dans un délai de 1 h.
REMARQUE: Pour une étude plus vaste, il peut être utile de code-barres des échantillons pour permettre leur suivi tout au long de l’étude. Il est important de noter que tout le personnel manipulant des tissus humains devrait se voir offrir le schéma thérapeutique complet du vaccin contre l’hépatite B. - En laboratoire, allumez l’UV pendant 25 minutes dans la hotte BSL-2 pour stériliser les instruments et les pipettes autoclavés avant utilisation.
- Transférer le morceau de tissu de cordon du tube de collecte dans une boîte de 10 cm2 traitée par culture tissulaire contenant du PBS enrichi en 5 g/L de glucose, 50 μg/mL de gentamicine, 2,5 μg/mL d’amphotéricine B, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (schéma à la figure 1).
- À l’aide d’un scalpel, trancher le tissu du cordon verticalement le long de son axe longitudinal pour obtenir deux demi-pièces cylindriques. En raison de la torsion du cordon et de la surface mucoïde, épinglez le tissu avec une paire de pinces tenues dans l’autre main.
- À ce stade, observez les artères ombilicales et la veine et retirez les vaisseaux sanguins à l’aide d’un scalpel pour les gratter dans une direction de la surface. Rincez à nouveau le tissu du cordon ombilical dans le PBS pour éliminer tout le sang résiduel associé au tissu. Assurez-vous que le raclage est doux pour préserver l’intégrité des cellules dans le WJ entourant les vaisseaux.
- Hacher chaque moitié du tissu du cordon en fragments de 0,5 cmde 3 tailles et placer les fragments avec la surface luminale vers le bas sur le plat. Incuber brièvement le plat pendant 10 min dans une chambre humidifiée à 37 °C contenant 5 % de CO2.
- Après l’incubation, inonder la boîte contenant les morceaux de tissu du cordon avec 20 mL de milieu contenant MEM Alpha Modification sans L-glutamine, ribo- et désoxyribonucléosides, 15% de sérum bovin fœtal (non inactivé par la chaleur) et 50 μg / mL de gentamycine. Ajouter doucement le milieu de croissance le long des côtés pour éviter que les explantes tissulaires ne soient délogées de leur orientation. Ajouter l’excès de milieu pour tenir compte d’une fraction qui sera absorbée par les explantes tissulaires pendant l’incubation.
- Après 3 jours d’incubation, ajoutez du milieu frais aux cultures. Assurez-vous que les cultures sont protégées des chocs et des mouvements des explants lors de la manipulation de la vaisselle.
- Après 1 semaine, retirez les fragments de tissu individuellement à l’aide d’une pince stérile et jetez-les à l’aide de sacs appropriés pour l’élimination. Conserver le milieu existant et ajouter 10 mL de milieu de croissance frais. Remplacez le milieu de croissance tous les 4 jours jusqu’à ce que les colonies individuelles atteignent une confluence de 70%.
REMARQUE: Il est probable que les cellules ne seront pas réparties uniformément dans tout le plat, car il y aura des colonies prolifératives individuelles qui devront être surveillées pour la confluence avec le temps. Généralement, en un mois, un plat de 10 cm2 génère suffisamment de cellules pour être divisé en un plat séparé. - Récoltez les cellules adhérentes à l’aide d’une solution de trypsine/EDTA (1x 0,25% de trypsine et 0,02% d’EDTA dans la solution saline équilibrée de Hanks [HBSS]). Centrifuger la suspension cellulaire à 470 × g pendant 5 min à 25 °C et remettre la pastille cellulaire en milieu de croissance.
2. Immunophénotypage et propagation de l’uMSCS
- Procéder à l’immunophénotypage une fois que les cellules adhérentes ont atteint 50% à 60% de confluence et sont bien réparties. N’effectuez pas d’analyse des marqueurs MSC sur des cultures entièrement confluentes, car cela tend à provoquer une régulation négative des marqueurs MSC clés.
- Après la trypsinisation, distribuer une suspension cellulaire de 1 × 106 cellules/mL dans des tubes FACS (1 × 105 cellules/tube) et la coloration avec des anticorps appropriés liés aux fluorophores (tous dilutions 1:50) en combinaison : non colorés ; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluorophore commun); contrôles d’isotype pour chaque fluorophore. Enregistrez un nombre total d’événements d’au moins 10 000 sur le cytomètre en flux pour une analyse plus approfondie.
REMARQUE : Étant donné que les cellules sont analysées séparément pour chaque marqueur de surface, il n’est pas nécessaire de contrôler les sous-ensembles de cellules. - En plus des marqueurs ci-dessus, confirmer la présence de marqueurs de surface positifs et négatifs dans les lignes uMSC créées à partir d’échantillons individuels de tissu de cordon (tableau 1).
- Analysez les cellules marquées par cytométrie en flux et déterminez le pourcentage de cellules CD105+CD90+ et CD105+CD73+ . Analysez séparément les cellules CD105+ et CD34−CD45− .
3. Différenciation des cSM en muscle squelettique
- Enduire les plaques de culture tissulaire avec 0,01% de collagène et 20 μg/mL de laminine dans le PBS. Enduisez ces plaques pendant au moins 4 h à température ambiante.
- Plaque uMSC à une densité de 10 000 cellules/cm2 en milieu de croissance.
- Lorsque les cellules sont confluentes à 70%, aspirez le milieu de croissance et rincez les cultures 2x avec du PBS. Ajouter au CSM un milieu de différenciation myogénique (M1) composé de DMEM + 5 % de sérum de cheval + 0,1 μM de dexaméthasone + 50 μM d’hydrocortisone. Pour déterminer la cinétique de la progression myogénique, ajouter le milieu M1 tous les deux jours aux cultures.
- Pour déterminer la cinétique de la progression myogénique, analysez les cSM pour l’expression de Pax7, MyoD, Myogénine et MyHC à 2 jours, 4-5 jours, 6-7 jours et 10-14 jours, respectivement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le succès de l’isolement des cSUm du tissu du cordon ombilical est >95%, contrairement aux faibles taux de réussite du sang de cordon entier. Une fois l’isolement réussi des cSEm, l’analyse FACS révèle que toutes les cellules sont CD34−CD45−CD105+CD90+. Cependant, dans l’analyse comparative, les cSEm isolés du sang de cordon présentent des populations hétérogènes, dans lesquelles une proportion de cellules présentent CD34 + CD45 + CD105+ (~ 15%). De plus, les CD105+CD90+ double positifs sont moins nombreux (~5 %) (figure supplémentaire S1). Il en résulte une réduction des niveaux de différenciation myogénique entre les cSEm du sang de cordon, car l’expression de CD105 et de CD90 est nécessaire pour l’induction de la myogenèse. Les uMSC affichent également l’expression des marqueurs répertoriés dans le tableau 1. S’il y a contamination des cSEm dérivés du sang de cordon, il y aura également une présence de cellules CD34+CD45+ . Il en résulte de faux comptages de cellules pour le placage pour la différenciation myogénique. Une indication que >90% des cellules sont doublement positives pour l’expression de CD105 et CD90 est que les cSEm ne se sont engagées dans aucune lignée mésodermique et continuent de rester multipotentes, car l’expression de CD105 et CD90 est régulée à la baisse lors de la différenciation. Il est impératif d’utiliser plusieurs marqueurs pour la confirmation des phénotypes uMSC, car il n’existe pas de marqueur uMSC définitif unique. Dans cette analyse, nous avons évalué la présence de tous les marqueurs énumérés dans le tableau 1 pour chacune des lignées uMSC établies en laboratoire. De plus, nous avons déterminé l’état double positif de CD105 et CD90 (Figure 2A), ainsi que de CD105 et CD73 (Figure 2B), en veillant à ce que les uMSC expriment plusieurs marqueurs clés. Ceci est nécessaire pour éviter de contaminer les cellules mono-positives qui sont présentes en nombre inférieur à 0,05%.
Figure 1 : Schéma montrant l’isolement et la caractérisation par étapes des cSEm à partir de tissu de cordon. Abréviation : uMSCs = cellules souches mésenchymateuses provenant de tissus du cordon ombilical humain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse des marqueurs CSM dans les cSEm dérivés du tissu du cordon. (A) Les cSEm affichent l’expression de CD105 et CD90 et n’expriment pas les marqueurs hématopoïétiques, CD34 et CD45. Des diagrammes FACS représentatifs de trois lignes uMSC (UCT15, UCT18 et UCT26) sont présentés (N = 16). La rangée supérieure des panneaux montre les cellules des trois lignes uMSC dans le quadrant Q2 positif pour l’expression CD105 et CD90. La rangée inférieure des panneaux montre les cellules du quadrant Q1 positives pour l’expression CD105 et négatives pour l’expression CD34 et CD45. (B) Les uMSC affichent l’expression du marqueur MSC, CD73 (N = 16). Abréviation : uMSCs = cellules souches mésenchymateuses provenant de tissus du cordon ombilical humain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Marqueurs positifs uMSC | Marqueurs négatifs uMSC |
| CD105 | CD34 |
| CD90 | CD45 |
| CD73 | CD106 |
| CD29 | HLA DR |
| CD44 | CD31 |
| HLA ABC | CD14 |
| CD49e | CD49e |
| CD54 | |
| CD13 |
Tableau 1 : Liste des marqueurs positifs et négatifs pour les cSEm. Abréviation : uMSCs = cellules souches mésenchymateuses provenant de tissus du cordon ombilical humain.
Pour la différenciation des uMSC dans la lignée myogénique, les uMSC expriment généralement Pax7, un marqueur pour les cellules précurseurs dans les 2 premiers jours de l’ajout de M1, suivi de MyoD dans les 4 premiers jours de l’ajout de M1 (Figure 3). À 6 jours de différenciation, les cellules expriment la protéine myogénine, suivie de l’expression de la chaîne lourde de myosine (MyHC) entre 10 jours et 14 jours de l’induction de la différenciation. Nous avons caractérisé plus en détail la cinétique de l’expression myogénique à l’aide du séquençage de l’ARN, de la cytométrie en flux, de l’immunocytochimie, de la RT-PCR et de l’analyse par transfert western pour documenter l’expression par étapes des marqueurs myogéniques, confirmant ainsi la robustesse de ce protocole. Le séquençage transcriptomique du génome entier entre les uMSC indifférenciés et les uMSC différenciés en muscle squelettique a révélé la régulation à la hausse de 907 gènes en réponse à l’induction de la différenciation myogénique (Figure 4).
Figure 3 : Différenciation des cSEm en muscle squelettique. Les cSEm ont été cultivés dans un milieu M1 pendant 2 jours, 4 jours, 7 jours et 10 jours et évalués pour (A) Pax7 après 2 jours, (B) MyoD après 4 jours, (C) Expression de myogénine à partir de différentes lignées uMSC, notées T8, T12, T14 et T25 après 7 jours, et (D) MyHC après 10 jours. Barres d’échelle = (B, D) 50 μm. Abréviations : uMSC = cellules souches mésenchymateuses provenant de tissu de cordon ombilical humain; GAPDH = glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase; MyoD = protéine de détermination des myoblastes 1; MyHC = chaîne lourde de myosine; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; Mb = myoblaste; MT = myotube. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Profilage transcriptomique comparatif des cSM dérivés du sang de cordon et du tissu de cordon différenciés en muscle squelettique. Carte thermique des comptes normalisés de 907 gènes entre les uMSC de contrôle et les uMSC différenciés en muscle squelettique pendant 7 jours à partir de sang de cordon et de tissu de cordon. Le diagramme de Venn (à gauche) montre un plus grand nombre de gènes myogéniques régulés à la hausse dans les uMSC dérivés du tissu de cordon par rapport aux uMSC dérivés du sang de cordon. Le tableau ci-dessous montre les gènes myogéniques communs régulés à la hausse dans le tissu et le sang de cordon. Ce chiffre est tiré de Mishra et al.6. Abréviations : 1, 2 = répliques biologiques ; CB1,2 = cellules myogéniques dérivées des cSM du sang de cordon; CT1, 2 = cellules myogéniques dérivées des cSMS d’uMSC du tissu du cordon; coB1,2 = contrôler les csem indifférenciés du sang de cordon; coT1, 2 = contrôler les csem indifférenciés du tissu du cordon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Aux fins d’une analyse comparative, nous avons comparé les cSM isolés du sang de cordon et du tissu de cordon. Les données de séquençage de l’ARN ont révélé qu’il y avait plus de gènes myogéniques régulés à la hausse dans les cSEm à partir de cellules myogéniques dérivées du tissu de cordon que dans celles dérivées du sang de cordon (figure 4). Les données de séquençage de l’ARN utilisées à l’appui de cette étude sont téléchargées sur NCBI (l’accession SRA est GSE147114). En bref, l’analyse transcriptomique spécifique aux tissus à l’aide de la base de données PANTHER GO-slim a identifié des protéines cytosquelettiques associées à la liaison à l’actine et à l’assemblage de sarcomères (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) des transporteurs associés à la fonction contractile (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), au maintien de la masse musculaire ( FBXO32, TRIM16L, GHR), signalisation calcique (FKBP5) et fonction enzymatique (COX7A1, PDK4) (Figure 4). Dans l’ensemble, ces données démontrent que les cSEm dérivés du tissu du cordon représentent un compartiment présentant un potentiel myogénique robuste.
En raison de la variation individuelle entre les lignées uMSC qui pourrait résulter d’efficacités isolées, de l’hétérogénéité dans le compartiment uMSC, de l’âge de la mère et de l’état de santé de la mère, y compris ses niveaux de nutriments, il pourrait y avoir des différences dans les taux de prolifération et les potentiels myogéniques entre les lignées uMSC établies. Cependant, malgré les différences dans la cinétique d’expression, la tendance générale à l’augmentation de la myogénicité avec l’expression par étapes des marqueurs myogéniques est maintenue.
Figure supplémentaire S1 : Analyse des marqueurs CSM dans les cSEm dérivés du sang de cordon. Les uMSC affichent l’expression de CD105 et de marqueurs hématopoïétiques, CD34 et CD45. L’analyse de la population de CD105+ montre que seule une faible proportion de ces cellules co-exprimeNT CD90 (N = 5). Abréviation : uMSCs = cellules souches mésenchymateuses provenant de tissus du cordon ombilical humain. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Étapes critiques
Une étape critique de ce protocole est la collecte de tissus dans des conditions aseptiques, du moment de l’accouchement au maintien des cultures stériles, pendant toute la durée de la propagation. Lors de la collecte du cordon, il est essentiel que le cordon ne touche aucune surface non stérilisée et soit tamponné à l’extérieur avec de l’éthanol à 70% avant d’être collecté dans des tubes contenant du PBS complété par des antibiotiques. Il est important de limiter le temps entre la collecte du cordon et le traitement du tissu pour l’isolement uMSC. S’il est nécessaire de transporter des tissus du site de collecte au laboratoire, il faut veiller à maintenir le tissu dans des tampons contenant des antibiotiques et à le stocker sur de la glace.
Modifications et dépannage de la méthode
La principale modification de ce protocole pour induire la différenciation myogénique des cSM est l’enrobage des plats avec 0,01% de collagène de type 1 et 20 μg / mL de laminine. Nous avons observé que la progression myogénique dans les cSEm en présence d’un milieu M1 est améliorée lorsque les conditions d’adhérence sont également modulées. Il faut tester si l’utilisation d’autres matrices supérieures, bien que coûteuses, telles que Matrigel pourrait encore améliorer ce protocole. Les variations de rendement entre les échantillons individuels peuvent entraîner une diminution du nombre de cellules dans certains tissus. Dans de tels cas, il pourrait être préférable de prélever une plus grande longueur de tissu de cordon de >5 cm. Dans ce contexte, peu de rapports ont utilisé 10 cm de tissu de cordon pour augmenter le rendement des cSEm. La majorité des rapports décrivant l’isolement des cSM uMS du tissu du cordon ont utilisé des enzymes dégradant la matrice extracellulaire pour augmenter la libération de cellules du stroma du cordon 3,5,7,8. L’utilisation de cultures d’explants par quelques études, y compris ce rapport, a continuellement démontré une viabilité cellulaire accrue et un rendementde 6,9,10. De plus, l’absence de la nécessité d’effectuer un tri cellulaire pour purifier les populations cellulaires, qui est souvent inclus dans la purification des cSEm du sang de cordon, augmente le nombre de cellules et l’intégrité.
Limites de la méthode
L’une des principales limites de la méthode est le temps nécessaire à l’établissement complet de lignes uMSC à partir d’échantillons individuels de tissu de cordon. En règle générale, 3 semaines sont nécessaires pour générer chaque ligne uMSC à l’aide de ce protocole. Après cela, 2 semaines sont nécessaires pour une différenciation myogénique complète. Cette durée d’investigation prolongée peut être lourde dans de grandes cohortes examinant les potentiels de différenciation des cSM de différents participants, dans le but d’obtenir des informations sur le milieu intra-utérin ou de prédire les paramètres métaboliques des organes de la progéniture tels que la composition corporelle. Une deuxième limitation est l’hétérogénéité au sein de la matrice tissulaire du cordon, qui pourrait posséder des différences phénotypiques intrinsèques entre les différents compartiments de l’uMSC et qui pourrait être responsable des potentiels de différenciation entre les différentes sources. Par exemple, les uMSC du WJ présentent un potentiel ostéogénique inférieur à celui des uMSC11 dérivés du CL. Par conséquent, cette méthode ne décrit pas les différences inhérentes entre les différents compartiments du tissu du cordon lui-même.
Importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes
En utilisant ce protocole, nous sommes en mesure d’obtenir un nombre de cellules de 1 × 104 à 1 × 106 uMSC à partir d’échantillons individuels de tissu de cordon. Ces lignes uMSC peuvent être utilisées de manière fiable pour des essais sur au moins 6 à 8 passages. Malgré l’ampleur de la variation des phénotypes cellulaires typiques des populations humaines, le temps moyen de doublement des cSM observé dans notre cohorte de 15 femmes du nord de l’Inde était inférieur à 2 jours6. Une analyse de leurs taux prolifératifs à l’aide de l’incorporation de 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) a montré qu’au moins 80% des cellules étaient passées par la phase S en l’espace de 6 h6. De plus, les uMSC du tissu du cordon présentent également de faibles taux de sénescence, ce qui indique la robustesse de cette méthode d’isolement6. Nous avons précédemment comparé le degré d’induction myogénique dans les cSEm à l’aide de ce protocole avec celui utilisé pour induire la myogenèse dans les cellules souches pluripotentielles humaines et murines 6,12. Nous avons constaté que ce protocole est un inducteur plus puissant de la différenciation myogénique que les protocoles existants.
Importance de la méthode et des applications
Le succès des thérapies cellulaires et régénératives dépend de la viabilité et du rendement cellulaires, nécessitant un grand nombre de cellules dès les premiers passages. Ainsi, cette méthode offre une alternative pratique pour les applications cliniques. Le protocole robuste de différenciation myogénique fourni dans ce rapport et la caractérisation moléculaire approfondie de la progression myogénique à l’aide de ce protocole dans nos travaux complètent les efforts visant à récapituler la myogenèse fœtale et peuvent être utilisés comme modèle pour imiter l’environnement intra-utérin et refléter le métabolisme postnatal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions M. Ojas Tikoo pour son aide pour le tournage et la production vidéo. Nous reconnaissons également l’aide reçue du personnel du GARBH-Ini (Groupe interdisciplinaire sur la recherche avancée et l’issue de la naissance -DBT India), des infirmières et des agents de recherche principaux de l’hôpital civil gurugram et du Dr Pallavi Kshetrapal pour l’aide à la logistique. Ce travail a été soutenu par des subventions accordées à Suchitra Gopinath par le Département de biotechnologie de l’Inde (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
