Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie.
Abstract
Die Erforschung des therapeutischen Potenzials mesenchymaler Stammzellen hängt von der Leichtigkeit der Isolierung, der Potenz zur Differenzierung und der Zuverlässigkeit und Robustheit der Quelle ab. Wir beschreiben hier ein schrittweises Protokoll für die Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe (uMSCs), deren Immunphänotypisierung und die Ausbreitung solcher Kulturen über mehrere Passagen. Bei diesem Verfahren ist die Lebensfähigkeit der uMSCs hoch, da keine enzymatische Verdauung stattfindet. Darüber hinaus stellt die Entfernung von Blutgefäßen, einschließlich der Nabelschnurarterien und der Vene, sicher, dass es keine Kontamination von Zellen endothelialen Ursprungs gibt. Unter Verwendung der Durchflusszytometrie sind uMSCs bei der Isolierung CD45−CD34−, was auf eine Abwesenheit von Zellen aus der hämatopoetischen Linie hinweist. Wichtig ist, dass sie die Tastenoberflächenmarkierungen CD105, CD90 und CD73 ausdrücken. Nach der Etablierung von Kulturen beschreibt dieses Papier eine effiziente Methode, um die Differenzierung dieser uMSCs in die Skelettmuskellinie zu induzieren. Eine detaillierte Analyse der myogenen Progression in differenzierten uMSCs zeigt, dass uMSCs Pax7 exprimieren, einen Marker für myogene Vorläufer in den Anfangsstadien der Differenzierung, gefolgt von der Expression von MyoD und Myf5 und schließlich einem terminalen Differenzierungsmarker, Myosin Heavy Chain (MyHC).
Introduction
Der menschlichen Nabelschnur wird ein robustes Reservoir mesenchymaler Stammzellen zugeschrieben, die derzeit aufgrund ihrer robusten Proliferations- und Differenzierungsraten, immunmodulatorischen Eigenschaften und ihrer Fähigkeit, Zellen aus allen drei Keimschichten 1 zu erzeugen, für regenerative Therapien erforschtwerden. Das Nabelschnurgewebe besteht aus mehreren Kompartimenten wie dem Nabelschnurblut, dem Nabelvenensubendothel und dem Wharton-Gelee (WJ), das an sich drei ununterschiedliche Regionen umfasst - die perivaskuläre Zone, die intervaskuläre Zone und das Subamnion oder die Nabelschnurauskleidung (CL)2. Während uMSCs aus all diesen verschiedenen Regionen isoliert werden können und wichtige MSC-Marker weitgehend ausdrücken, gibt es keine Klarheit darüber, ob diese Kompartimente die gleiche Population von uMSCs enthalten oder Unterschiede in ihren Differenzierungspotenzenaufweisen 3. Daher erfordern Protokolle für die Isolierung von uMSCs eine größere Präzision in ihrem Modus und Bereich der Isolation, die robuste Charakterisierung von Differenzierungspotentialen und schließlich eine vergleichende Analyse aus verschiedenen Kompartimenten der Schnur.
In diesem Zusammenhang haben nur wenige Studien Unterschiede in den proliferativen und differenzativen Potentialen von uMSC zwischen verschiedenen Teilen der Schnur gezeigt. Von diesen ergaben vergleichende Analysen zwischen uMSCs, die aus den CL- und WJ-Regionen isoliert wurden, ein größeres Proliferationspotenzial in CL-abgeleiteten uMSCs 3,4. In einer separaten Studie schnitten WJ-abgeleitete uMSCs in Proliferationsassays im Vergleich zu perivaskulären Zellen (HUCPV) besser ab.5. Bei der Untersuchung von Unterschieden zwischen aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs und aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs, die keine vaskuläre Kontamination aufweisen, wurde eine differentielle Expression der wichtigsten MSC-Marker zwischen den beiden Kompartimenten sowie erhöhte Proliferationsraten in Nabelschnurgewebe-abgeleiteten uMSCsberichtet 6.
Von den verschiedenen Studien, die die Differenzierungspotenziale von uMSCs hauptsächlich in Gewebe der Mesoderm-Linie wie osteogene, adipogene und chondrogene Linien untersuchen, haben nur sehr wenige detaillierte Protokolle für die myogene Differenzierung und anschließende Charakterisierung sowie vergleichende Analysen zwischen verschiedenen Nabelschnurkompartimenten geliefert. In diesem Zusammenhang haben wir ein robustes Muskeldifferenzierungsprotokoll entwickelt und beobachtet, dass aus Nabelschnurgewebe gewonnene uMSCs im Vergleich zu Nabelschnurblut überlegene myogene Differenzierungsfähigkeitenaufweisen 6. Hier wird ein schrittweises Protokoll für die Isolierung von uMSCs aus dem gesamten Nabelschnurgewebe ohne Zellen, die mit dem Gefäßsystem assoziiert sind, ihre Charakterisierung und ihre Differenzierung in die myogene Linie detailliert beschrieben.
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Protocol
Die Verwendung von Nabelschnurgewebe in dieser Studie wurde vom Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), dem Institutional Ethics Committee, dem Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), dem Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana, und dem Institutional Biosafety Committee, THSTI, genehmigt. Menschliche Nabelschnurgewebeproben wurden aus Terminlieferungen zum Zeitpunkt der Geburt entnommen. Von den Probanden wurde eine informierte schriftliche Zustimmung eingeholt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.
1. Isolierung von MSCs aus Nabelschnurgewebe
- Zum Zeitpunkt der Lieferung schneiden Sie mindestens 5 cm Schnur, vorzugsweise näher an der Plazenta, und sterilisieren Sie die Schnur, indem Sie die äußere Oberfläche mit 70% Ethanol abtupfen. Übertragen Sie das Stück Nabelschnurgewebe nacheinander von einem 50-ml-Sammelröhrchen, das phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält, zu einem anderen, das dasselbe enthält. Transportieren Sie das Sammelrohr mit dem Namen des Probanden auf Eis innerhalb von 1 Stunde ins Labor.
HINWEIS: Bei einer größeren Studie kann es sinnvoll sein, die Proben mit einem Barcode zu versehen, um ihre Verfolgung während der gesamten Studie zu ermöglichen. Wichtig ist, dass allen Mitarbeitern, die mit menschlichem Gewebe umgehen, das vollständige Regime des Hepatitis-B-Impfstoffs angeboten wird. - Schalten Sie im Labor das UV für 25 Minuten in der BSL-2-Haube ein, um autoklavierte Instrumente und Pipetten vor dem Gebrauch zu sterilisieren.
- Überführen Sie das Schnurgewebestück aus dem Entnahmeröhrchen in eine 10 cm 2 große mit Gewebekultur behandelte Schale, die PBS enthält, das mit 5 g/L Glukose, 50 μg/ml Gentamicin,2,5 μg/ml Amphotericin B, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin angereichert ist (schematisch in Abbildung 1).
- Schneiden Sie das Nabelschnurgewebe mit einem Skalpell vertikal entlang seiner Längsachse auf, um zwei halbzylindrische Stücke zu erhalten. Aufgrund der Nabelschnurtorsion und der Schleimhautoberfläche das Gewebe mit einer Pinzette in der anderen Hand festnageln.
- Beobachten Sie an dieser Stelle die Nabelschnurarterien und die Vene und entfernen Sie die Blutgefäße, indem Sie sie mit einem Skalpell in eine Richtung von der Oberfläche abkratzen. Spülen Sie das Nabelschnurgewebe noch einmal in PBS, um das gesamte mit dem Gewebe verbundene Restblut zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass das Abkratzen schonend ist, um die Integrität der Zellen in der WJ, die die Gefäße umgibt, zu erhalten.
- Zerkleinern Sie jede Hälfte des Schnurgewebes in 0,5 cm3 große Fragmente und legen Sie die Fragmente mit der luminalen Oberfläche nach unten auf die Schale. Brüten Sie die Schale kurz für 10 min in einer 37 °C befeuchteten Kammer, die 5% CO2 enthält.
- Nach der Inkubation die Schale mit den Nabelschnurgewebestücken mit 20 ml Medium, das MEM Alpha Modification ohne L-Glutamin, Ribo- und Desoxyribonukleoside, 15% fetales Rinderserum (nicht hitzeinaktiviert) und 50 μg/ml Gentamycin enthält, überfluten. Fügen Sie das Wachstumsmedium vorsichtig an den Seiten hinzu, um zu verhindern, dass sich die Gewebeexplantationen von ihrer Orientierung lösen. Fügen Sie überschüssiges Medium hinzu, um einen Bruchteil zu berücksichtigen, der während der Inkubation von den Gewebeexplantaten aufgesaugt wird.
- Nach 3 Tagen Inkubation frischen Medium zu den Kulturen hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Kulturen vor Stößen und Bewegungen der Explantate geschützt sind, während Sie mit dem Geschirr umgehen.
- Nach 1 Woche die Gewebefragmente einzeln mit steriler Pinzette entfernen und mit geeigneten Biohazard-Beuteln zur Entsorgung entsorgen. Behalten Sie das vorhandene Medium bei und fügen Sie 10 ml frisches Wachstumsmedium hinzu. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium alle 4 Tage, bis einzelne Kolonien einen Zusammenfluss von 70% erreichen.
HINWEIS: Es ist wahrscheinlich, dass die Zellen nicht gleichmäßig in der Schale verteilt sind, da es einzelne proliferative Kolonien geben wird, die mit der Zeit auf Zusammenfluss überwacht werden müssen. Im Allgemeinen erzeugt eine 10 cm 2 große Schale innerhalb eines Monats genügend Zellen, um in eine separateSchale aufgeteilt zu werden. - Ernten Sie die adhärenten Zellen mit Trypsin / EDTA-Lösung (1x 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Die Zellsuspension bei 470 × g für 5 min bei 25 °C zentrifugieren und das Zellpellet in Wachstumsmedium resuspendieren.
2. Immunphänotypisierung und Ausbreitung von uMSCS
- Fahren Sie mit der Immunphänotypisierung fort, sobald die adhärenten Zellen einen Zusammenfluss von 50% -60% erreicht haben und gut verteilt sind. Führen Sie keine MSC-Markeranalyse für vollständig konfluente Kulturen durch, da dies tendenziell zu einer Herunterregulierung der wichtigsten MSC-Marker führt.
- Nach der Trypsinisierung eine Zellsuspension von 1 × 106 Zellen/ml in FACS-Röhrchen (1 × 105 Zellen/Röhrchen) verteilen und mit geeigneten fluorophorgebundenen Antikörpern (alle 1:50-Verdünnung) in Kombination anfärben: ungefärbt; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (gewöhnlicher Fluorophor); Isotypkontrollen für jedes Fluorophor. Zeichnen Sie eine Gesamtzahl von Ereignissen von mindestens 10.000 auf dem Durchflusszytometer zur weiteren Analyse auf.
HINWEIS: Da die Zellen für jeden Oberflächenmarker separat analysiert werden, ist kein Gating auf Zellteilmengen erforderlich. - Zusätzlich zu den oben genannten Markern ist das Vorhandensein positiver und negativer Oberflächenmarker in uMSC-Linien zu bestätigen, die aus einzelnen Nabelschnurgewebeproben erstellt wurden (Tabelle 1).
- Analysieren Sie die markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie und bestimmen Sie den Prozentsatz der CD105 + CD90 + - und CD105 + CD73 + -Zellen. Analysieren Sie CD105+ und CD34−CD45− Zellen separat.
3. Differenzierung von uMSCs in Skelettmuskulatur
- Beschichten Sie Gewebekulturplatten mit 0,01% Kollagen und 20 μg/ml Laminin in PBS. Beschichten Sie diese Platten für mindestens 4 h bei Raumtemperatur.
- Platte uMSCs mit einer Dichte von 10.000 Zellen/cm2 in Wachstumsmedium.
- Wenn die Zellen zu 70% konfluent sind, saugen Sie das Wachstumsmedium ab und spülen Sie die Kulturen 2x mit PBS aus. Fügen Sie den uMSCs myogenes Differenzierungsmedium (M1) hinzu, das aus DMEM + 5% Pferdeserum + 0,1 μM Dexamethason + 50 μM Hydrocortison besteht. Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, fügen Sie den Kulturen jeden zweiten Tag M1-Medium hinzu.
- Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, analysieren Sie uMSCs für Pax7, MyoD, Myogenin und MyHC-Expression nach 2 Tagen, 4-5 Tagen, 6-7 Tagen bzw. 10-14 Tagen.
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Representative Results
Der Erfolg der Isolierung von uMSCs aus Nabelschnurgewebe beträgt >95%, im Gegensatz zu den schlechten Erfolgsraten von Nabelschnurblut. Nach erfolgreicher Isolierung von uMSCs zeigt die FACS-Analyse, dass alle Zellen CD34−CD45−CD105+CD90+ sind. In der vergleichenden Analyse zeigen uMSCs, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden, jedoch heterogene Populationen, wobei ein Teil der Zellen CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%) aufweist. Darüber hinaus sind doppelt positive CD105 + CD90+ weniger zahlreich (~ 5%) (Ergänzende Abbildung S1). Dies führt zu einer reduzierten myogenen Differenzierung zwischen uMSCs aus Nabelschnurblut, da sowohl CD105- als auch CD90-Expression für die Induktion der Myogenese erforderlich sind. uMSCs zeigen auch den Ausdruck der in Tabelle 1 aufgeführten Markierungen an. Wenn es eine Kontamination der aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs gibt, wird auch CD34 + CD45 + -Zellen vorhanden sein. Dies führt zu falschen Zellzahlen für die Beschichtung zur myogenen Differenzierung. Ein Hinweis darauf, dass >90% der Zellen doppelt positiv für CD105- und CD90-Expression sind, ist, dass sich die uMSCs keiner mesodermalen Linie verschrieben haben und weiterhin multipotent bleiben, da sowohl die CD105- als auch die CD90-Expression bei der Differenzierung herunterreguliert werden. Es ist unerlässlich, mehrere Marker für die Bestätigung von uMSC-Phänotypen zu verwenden, da es keinen einzigen definitiven uMSC-Marker gibt. In dieser Analyse bewerteten wir das Vorhandensein aller in Tabelle 1 aufgeführten Marker für jede der im Labor festgelegten uMSC-Linien. Darüber hinaus haben wir den doppelt positiven Status von CD105 und CD90 (Abbildung 2A) sowie von CD105 und CD73 (Abbildung 2B) bestimmt, um sicherzustellen, dass die uMSCs mehrere Schlüsselmarker ausdrücken. Dies ist notwendig, um eine Kontamination einzelner positiver Zellen zu vermeiden, die in einer Anzahl von weniger als 0,05% vorhanden sind.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der schrittweisen Isolierung und Charakterisierung von uMSCs aus Nabelschnurgewebe. Abkürzung: uMSCs = mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: MSC-Markeranalyse in aus Nabelschnurgewebe abgeleiteten uMSCs. (A) uMSCs zeigen die Expression von CD105 und CD90 und exprimieren keine hämatopoetischen Marker, CD34 und CD45. Repräsentative FACS-Diagramme von drei uMSC-Linien (UCT15, UCT18 und UCT26) werden angezeigt (N = 16). Die obere Reihe der Panels zeigt Zellen in allen drei uMSC-Linien im Q2-Quadranten, die positiv auf CD105- und CD90-Expression sind. Die untere Reihe der Panels zeigt Zellen im Q1-Quadranten, die positiv für die CD105-Expression und negativ für die CD34- und CD45-Expression sind. (B) uMSCs zeigen den Ausdruck des MSC-Markers CD73 an (N = 16). Abkürzung: uMSCs = mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| uMSC-positive Marker | uMSC negative Marker |
| CD105 | CD34 |
| CD90 | CD45 |
| CD73 | CD106 |
| CD29 | HLA DR |
| CD44 | CD31 |
| HLA ABC | CD14 |
| CD49e | CD49e |
| CD54 | |
| CD13 |
Tabelle 1: Liste der positiven und negativen Marker für uMSCs Abkürzung: uMSCs = mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe.
Für die Differenzierung von uMSCs in die myogene Linie exprimieren uMSCs typischerweise Pax7, einen Marker für Vorläuferzellen innerhalb der ersten 2 Tage nach der Addition von M1, gefolgt von MyoD innerhalb der ersten 4 Tage nach der M1-Addition (Abbildung 3). Nach 6 Tagen Differenzierung exprimieren die Zellen das Myogenin-Protein, gefolgt von der Expression der Myosin-Schwerkette (MyHC) zwischen 10 Tagen und 14 Tagen nach der Induktion der Differenzierung. Wir charakterisierten detaillierter die Kinetik der myogenen Expression mittels RNA-Sequenzierung, Durchflusszytometrie, Immunzytochemie, RT-PCR und Western-Blot-Analyse, um die stufenweise Expression myogener Marker zu dokumentieren und die Robustheit dieses Protokolls zu bestätigen. Die transkriptomische Sequenzierung des gesamten Genoms zwischen undifferenzierten uMSCs und uMSCs, die in Skelettmuskeln differenziert wurden, zeigte die Hochregulierung von 907 Genen als Reaktion auf die Induktion der myogenen Differenzierung (Abbildung 4).
Abbildung 3: Differenzierung von uMSCs in Skelettmuskulatur. uMSCs wurden in M1 medium für 2 Tage, 4 Tage, 7 Tage und 10 Tage kultiviert und nach 2 Tagen auf (A) Pax7, (B) MyoD nach 4 Tagen, (C) Myogeninexpression aus verschiedenen uMSC-Linien, gekennzeichnet durch T8, T12, T14 und T25 nach 7 Tagen, und (D) MyHC nach 10 Tagen untersucht. Maßstabsstäbe = (B, D) 50 μm. Abkürzungen: uMSCs = mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe; GAPDH = Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; MyoD = Myoblastenbestimmungsprotein 1; MyHC = Myosin schwere Kette; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; Mb = Myoblast; MT = Myotube. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Vergleichende transkriptomische Profilierung von uMSCs aus Nabelschnurblut und Nabelschnurgewebe differenziert in Skelettmuskulatur. Heatmap der normalisierten Zählungen von 907 Genen zwischen Kontroll-uMSCs und uMSCs, die 7 Tage lang aus Nabelschnurblut und Nabelschnurgewebe in Skelettmuskeln differenziert wurden. Das Venn-Diagramm (links) zeigt eine größere Anzahl von myogenen Genen, die in aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs hochreguliert sind, verglichen mit aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs. Die folgende Tabelle zeigt die häufigsten myogenen Gene, die sowohl im Nabelschnurgewebe als auch im Nabelschnurblut hochreguliert sind. Diese Figur stammt von Mishra et al.6. Abkürzungen: 1, 2 = biologische Replikate; CB1,2 = myogene Zellen, die aus uMSCs des Nabelschnurblutes gewonnen werden; CT1, 2 = myogene Zellen, die aus uMSCs von Nabelschnurgewebe gewonnen werden; coB1,2 = undifferenzierte uMSCs aus Nabelschnurblut kontrollieren; coT1, 2 = undifferenzierte uMSCs aus Nabelschnurgewebe kontrollieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Für eine vergleichende Analyse verglichen wir uMSCs, die aus Nabelschnurblut und Nabelschnurgewebe isoliert wurden. RNA-Sequenzierungsdaten zeigten, dass in uMSCs mehr myogene Gene aus aus Nabelschnurgewebe gewonnenen myogenen Zellen hochreguliert waren als aus Nabelschnurblut (Abbildung 4). Die RNA-Sequenzierungsdaten, die zur Unterstützung dieser Studie verwendet werden, werden in NCBI hochgeladen (SRA-Beitritt ist GSE147114). Kurz gesagt, die gewebespezifische transkriptomische Analyse unter Verwendung der PANTHER GO-slim-Datenbank identifizierte zytoskelettale Proteine, die mit der Aktinbindung und Sarkomerassemblierung (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) assoziiert sind, Transportern, die mit kontraktiler Funktion assoziiert sind (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), Muskelmasseerhaltung ( FBXO32, TRIM16L, GHR), Calciumsignalisierung (FKBP5) und enzymatische Funktion (COX7A1, PDK4) (Abbildung 4). Insgesamt zeigen diese Daten, dass aus Nabelschnurgewebe gewonnene uMSCs ein Kompartiment darstellen, das ein robustes myogenes Potenzial aufweist.
Aufgrund individueller Unterschiede zwischen uMSC-Linien, die sich aus isolierten Wirkungsgraden, Heterogenität innerhalb des uMSC-Kompartiments, dem Alter der Mutter und dem Gesundheitszustand der Mutter, einschließlich ihres Nährstoffgehalts, ergeben können, kann es Unterschiede in den Proliferationsraten und myogenen Potenzialen zwischen etablierten uMSC-Linien geben. Trotz Unterschieden in der Kinetik der Expression wird jedoch der allgemeine Trend der zunehmenden Myogenität mit der stufenweisen Expression myogener Marker beibehalten.
Ergänzende Abbildung S1: MSC-Markeranalyse in aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs. uMSCs zeigen die Expression von CD105 und hämatopoetischen Markern, CD34 und CD45. Die Analyse der CD105+ -Population zeigt, dass nur ein kleiner Teil dieser Zellen CD90 koexprimiert (N = 5). Abkürzung: uMSCs = mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Kritische Schritte
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Sammlung von Gewebe unter aseptischen Bedingungen, vom Zeitpunkt der Lieferung bis zur Aufrechterhaltung steriler Kulturen, für die gesamte Dauer der Vermehrung. Während der Schnursammlung ist es wichtig, dass die Schnur keine nicht sterilisierte Oberfläche berührt und extern mit 70% Ethanol abgewischt wird, bevor sie in mit Antibiotika ergänzten Röhrchen, die PBS enthalten, gesammelt wird. Es ist wichtig, die Zeit zwischen der Nabelschnurentnahme und der Verarbeitung des Gewebes für die uMSC-Isolierung zu begrenzen. Falls Gewebe vom Entnahmeort ins Labor transportiert werden muss, muss darauf geachtet werden, dass das Gewebe in antibiotikahaltigen Puffern aufbewahrt und auf Eis gelagert wird.
Modifikationen und Fehlerbehebung der Methode
Die wichtigste Modifikation in diesem Protokoll, um eine myogene Differenzierung von uMSCs zu induzieren, ist die Beschichtung von Schalen mit 0,01% Typ-1-Kollagen und 20 μg / ml Laminin. Wir beobachteten, dass die myogene Progression in uMSCs in Gegenwart von M1-Medium verstärkt wird, wenn auch die Adhäsionsbedingungen moduliert werden. Ob die Verwendung anderer überlegener, wenn auch teurer Matrizen wie Matrigel dieses Protokoll weiter verbessern könnte, muss getestet werden. Schwankungen in der Ausbeute zwischen einzelnen Proben können dazu führen, dass einige Gewebe eine niedrigere Zellzahl erzeugen. In solchen Fällen könnte es vorzuziehen sein, eine größere Länge von Nabelschnurgewebe zu sammeln, die >5 cm beträgt. In diesem Zusammenhang haben nur wenige Berichte 10 cm Nabelschnurgewebe verwendet, um die Ausbeute von uMSCs zu erhöhen. Die Mehrheit der Berichte, die die Isolierung von uMSCs aus Nabelschnurgewebe beschreiben, haben extrazelluläre matrixabbauende Enzyme für die erhöhte Freisetzung von Zellen aus dem Nabelschnurstroma 3,5,7,8 verwendet. Die Verwendung von Explantationskulturen durch einige Studien, einschließlich dieses Berichts, hat kontinuierlich eine erhöhte Zelllebensfähigkeit und -ausbeutegezeigt 6,9,10. Darüber hinaus erhöht das Fehlen der Notwendigkeit, eine Zellsortierung durchzuführen, um Zellpopulationen zu reinigen, die oft bei der Reinigung von uMSCs aus Nabelschnurblut enthalten ist, die Zellzahl und Integrität.
Einschränkungen der Methode
Eine wesentliche Einschränkung der Methode ist die Zeit, die für die vollständige Etablierung von uMSC-Linien aus einzelnen Nabelschnurgewebeproben benötigt wird. In der Regel sind 3 Wochen erforderlich, um jede uMSC-Leitung mit diesem Protokoll zu generieren. Danach sind 2 Wochen für eine vollständige myogene Differenzierung erforderlich. Diese verlängerte Untersuchungsdauer kann in großen Kohorten, die die Differenzierungspotenziale von uMSCs von verschiedenen Teilnehmern untersuchen, umständlich sein, mit der Absicht, Informationen über das intrauterine Milieu zu erhalten oder metabolische Parameter des Nachkommenorgans wie die Körperzusammensetzung vorherzusagen. Eine zweite Einschränkung ist die Heterogenität innerhalb der Nabelschnurgewebematrix, die intrinsische phänotypische Unterschiede zwischen den verschiedenen uMSC-Kompartimenten aufweisen könnte und die für Differenzierungspotentiale zwischen den verschiedenen Quellen verantwortlich sein könnte. Zum Beispiel zeigen uMSCs aus dem WJ ein geringeres osteogenes Potential im Vergleich zu CL-abgeleiteten uMSCs11. Daher beschreibt diese Methode nicht die Unterschiede, die zwischen verschiedenen Kompartimenten innerhalb des Nabelschnurgewebes selbst inhärent sind.
Bedeutung der Methode im Vergleich zu bestehenden Methoden
Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, eine Zellzahl von 1 × 104 bis 1 × 106 uMSCs aus einzelnen Nabelschnurgewebeproben zu erhalten. Diese uMSC-Linien können zuverlässig für Assays für mindestens 6-8 Passagen verwendet werden. Trotz des Ausmaßes der Variation der zellulären Phänotypen, die für menschliche Populationen typisch sind, betrug die durchschnittliche Verdopplungszeit von uMSCs, die in unserer Kohorte von 15 Frauen aus Nordindien beobachtet wurde, weniger als 2 Tage6. Eine Analyse ihrer proliferativen Raten unter Verwendung des Einbaus von 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU) zeigte, dass mindestens 80% der Zellen die S-Phase in einer Zeitspanne von 6 h6 durchlaufen hatten. Darüber hinaus weisen uMSCs aus Nabelschnurgewebe auch niedrige Seneszenzraten auf, was auf die Robustheit dieser Isolationsmethodehinweist 6. Wir haben zuvor den Grad der myogenen Induktion in uMSCs unter Verwendung dieses Protokolls mit dem Protokoll verglichen, das zur Induktion der Myogenese in menschlichen und murinen pluripotentiellen Stammzellen verwendetwird 6,12. Wir fanden heraus, dass dieses Protokoll ein stärkerer Induktor der myogenen Differenzierung ist als bestehende Protokolle.
Bedeutung der Methode und Anwendungen
Erfolgreiche zelluläre und regenerative Therapien hängen von der Zelllebensfähigkeit und -ausbeute ab und erfordern eine große Anzahl von Zellen aus frühen Passagen. Somit bietet diese Methode eine komfortable Alternative für klinische Anwendungen. Das robuste myogene Differenzierungsprotokoll, das in diesem Bericht zur Verfügung gestellt wird, und die eingehende molekulare Charakterisierung der myogenen Progression unter Verwendung dieses Protokolls in unserer Arbeit ergänzen die Bemühungen, die fetale Myogenese zu rekapitulieren und können als Modell verwendet werden, um die intrauterine Umgebung nachzuahmen und den postnatalen Stoffwechsel widerzuspiegeln.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Ojas Tikoo für ihre Hilfe bei den Dreharbeiten und der Videoproduktion. Wir danken auch für die Hilfe der Mitarbeiter von GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India), Krankenschwestern und leitenden Forschungsbeamten am Gurugram Civil Hospital und Dr. Pallavi Kshetrapal für Hilfe bei der Logistik. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse unterstützt, die Suchitra Gopinath vom Department of Biotechnology, Indien, gewährt wurden (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
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