Summary
Describimos un protocolo para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético.
Abstract
La exploración del potencial terapéutico de las células madre mesenquimales depende de la facilidad de aislamiento, la potencia hacia la diferenciación y la confiabilidad y robustez de la fuente. Describimos aquí un protocolo gradual para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano (uMSC), su inmunofenotipado y la propagación de dichos cultivos en varios pasajes. En este procedimiento, la viabilidad de las uMSCs es alta porque no hay digestión enzimática. Además, la eliminación de los vasos sanguíneos, incluidas las arterias del cordón umbilical y la vena, garantiza que no haya contaminación de las células de origen endotelial. Usando citometría de flujo, las uMSCs tras el aislamiento son CD45−CD34−, lo que indica una ausencia de células del linaje hematopoyético. Es importante destacar que expresan marcadores de superficie clave, CD105, CD90 y CD73. Tras el establecimiento de cultivos, este artículo describe un método eficiente para inducir la diferenciación en estas uMSC en el linaje del músculo esquelético. Un análisis detallado de la progresión miogénica en uMSCs diferenciadas revela que las uMSCs expresan Pax7, un marcador para progenitores miogénicos en las etapas iniciales de diferenciación, seguido de la expresión de MyoD y Myf5, y, finalmente, un marcador de diferenciación terminal, la cadena pesada de miosina (MyHC).
Introduction
Se ha acreditado que el cordón umbilical humano posee un reservorio robusto de células madre mesenquimales, que actualmente se están explorando para terapias regenerativas debido a sus robustas tasas de proliferación y diferenciación, propiedades inmunomoduladoras y capacidad para generar células a partir de las tres capas germinales1. El tejido del cordón umbilical consta de múltiples compartimentos como la sangre del cordón umbilical, el subendotelio de la vena umbilical y la gelatina de Wharton (WJ), que en sí misma abarca tres regiones indistintas: la zona perivascular, la zona intervascular y el subamnio o el revestimiento del cordón umbilical (CL)2. Si bien las uMSC pueden aislarse de todas estas regiones diferentes y expresar ampliamente los marcadores clave de MSC, no hay claridad sobre si estos compartimentos contienen la misma población de uMSC o muestran diferencias en sus potencias de diferenciación3. Por lo tanto, los protocolos para el aislamiento de uMSC requieren una mayor precisión en su modo y región de aislamiento, la caracterización robusta de los potenciales de diferenciación y, finalmente, un análisis comparativo de diferentes compartimentos del cordón.
En este contexto, pocos estudios han demostrado diferencias en los potenciales proliferativos y diferenciativos de uMSC entre las diferentes partes del cordón. De estos, los análisis comparativos entre uMSCs aislados de las regiones CL y WJ revelaron un mayor potencial proliferativo en uMSCs derivados de CL 3,4. En un estudio separado, las uMSC derivadas de WJ tuvieron un mejor desempeño en los ensayos de proliferación en comparación con las células perivasculares (HUCPV)5. Al examinar las diferencias entre las uMSC derivadas de la sangre del cordón umbilical y las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical desprovistas de contaminación vascular, se informó la expresión diferencial de los marcadores clave de MSC entre los dos compartimentos, así como el aumento de las tasas de proliferación en las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical6.
De los varios estudios que examinan los potenciales de diferenciación de las uMSC principalmente en tejidos del linaje mesodermo, como los linajes osteogénicos, adipogénicos y condrogénicos, muy pocos han proporcionado protocolos detallados para la diferenciación miogénica y la caracterización posterior, así como análisis comparativos entre varios compartimentos del cordón umbilical. En este contexto, hemos desarrollado un protocolo robusto de diferenciación muscular y hemos observado que las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical muestran capacidades de diferenciación miogénica superiores en comparación con la sangre del cordón umbilical6. Aquí, se detalla un protocolo paso a paso para el aislamiento de uMSC de todo el tejido del cordón umbilical desprovisto de células asociadas con la vasculatura, su caracterización y su diferenciación en el linaje miogénico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El uso de tejido del cordón umbilical en este estudio fue aprobado por el Comité Institucional para la Investigación con Células Madre (IC-SCR), el Comité de Ética Institucional, el Instituto traslacional de Ciencia y Tecnología de la Salud (IEC-THSTI), el Comité de Ética Institucional del Hospital Civil, Gurugram, Haryana, y el Comité Institucional de Bioseguridad, THSTI. Las muestras de tejido del cordón humano se recolectaron de partos a término en el momento del nacimiento. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos. Todos los métodos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices y reglamentos pertinentes.
1. Aislamiento de las MSC del tejido del cordón umbilical
- En el momento del parto, corte al menos 5 cm de cordón, preferiblemente más cerca de la placenta, y esterilize el cordón frotando la superficie externa con etanol al 70%. Transfiera el pedazo de tejido del cordón umbilical secuencialmente de un tubo de recolección de 50 ml que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) a otro que contiene el mismo. Transportar el tubo de recolección que lleva el nombre del sujeto en hielo al laboratorio dentro de 1 h.
NOTA: Para un estudio más amplio, podría ser útil codificar las muestras para permitir su seguimiento a lo largo del estudio. Es importante destacar que a todo el personal que maneja tejidos humanos se le debe ofrecer el régimen completo de la vacuna contra la hepatitis B. - En el laboratorio, encienda los rayos UV durante 25 minutos en la campana BSL-2 para esterilizar los instrumentos y pipetas en autoclave antes de su uso.
- Transfiera la pieza de tejido del cordón umbilical del tubo de recolección a un plato tratado con cultivo de tejido de 10 cm2 que contenga PBS enriquecido con 5 g/L de glucosa, 50 μg/ml de gentamicina, 2,5 μg/ml de anfotericina B, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (esquemático de la Figura 1).
- Usando un bisturí, corte el tejido del cordón verticalmente a lo largo de su eje longitudinal para obtener dos piezas medio cilíndricas. Debido a la torsión del cordón umbilical y la superficie mucoide, fije el tejido con un par de fórceps sostenidos en la otra mano.
- En este punto, observe las arterias umbilicales y la vena y retire los vasos sanguíneos usando un bisturí para rasparlos en una dirección desde la superficie. Enjuague el tejido del cordón umbilical una vez más en PBS para eliminar toda la sangre residual asociada con el tejido. Asegúrese de que el raspado sea suave para preservar la integridad de las células en el WJ que rodea los vasos.
- Picar cada mitad del tejido del cordón en fragmentos de 0,5 cmde tamaño 3 y colocar los fragmentos con la superficie luminal hacia abajo en el plato. Incubar el plato brevemente durante 10 min en una cámara humidificada a 37 °C que contenga un 5% de CO2.
- Después de la incubación, inunde el plato que contiene los trozos de tejido del cordón umbilical con 20 ml de medio que contenga MEM Alpha Modification sin L-glutamina, ribo- y desoxirribonucleósidos, suero bovino fetal al 15% (no inactivado por calor) y 50 μg / ml de gentamicina. Agregue el medio de crecimiento suavemente a lo largo de los lados para evitar que los explantes de tejido se desalojen de su orientación. Agregue el exceso de medio para dar cuenta de una fracción que será absorbida por los explantes de tejido durante la incubación.
- Después de 3 días de incubación, agregue medio fresco a los cultivos. Asegúrese de que los cultivos estén protegidos de los golpes y el movimiento de los explantes mientras manipula los platos.
- Después de 1 semana, retire los fragmentos de tejido individualmente usando fórceps estériles y deseche usando bolsas de riesgo biológico apropiadas para su eliminación. Conserve el medio existente y agregue 10 ml de medio de crecimiento fresco. Reemplace el medio de crecimiento cada 4 días hasta que las colonias individuales alcancen una confluencia del 70%.
NOTA: Es probable que las células no se distribuyan uniformemente en todo el plato, ya que habrá colonias proliferativas individuales que deben ser monitoreadas para la confluencia con el tiempo. Generalmente, dentro de un mes, un plato de 10 cm2 genera suficientes células para dividirse en un plato separado. - Cosechar las células adherentes usando solución de tripsina/EDTA (1x 0.25% de tripsina y 0.02% de EDTA en Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugar la suspensión celular a 470 × g durante 5 min a 25 °C y resuspendir el pellet celular en medio de crecimiento.
2. Inmunofenotipado y propagación de uMSCS
- Proceder al inmunofenotipado una vez que las células adherentes hayan alcanzado un 50%-60% de confluencia y estén bien diseminadas. No realice análisis de marcadores MSC en cultivos totalmente confluentes, ya que esto tiende a causar una regulación a la baja de los marcadores MSC clave.
- Después de la tripsinización, distribuya una suspensión celular de 1 × 106 células/ml en tubos FACS (1 × 105 células/tubo) y tiñe con anticuerpos adecuados ligados a fluoróforos (todos dilución 1:50) en combinación: sin teñir; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluoróforo común); controles de isotipo para cada fluoróforo. Registre un número total de eventos de al menos 10,000 en el citómetro de flujo para su posterior análisis.
NOTA: Dado que las celdas se analizan para cada marcador de superficie por separado, no es necesario cerrar los subconjuntos de celdas. - Además de los marcadores anteriores, confirme la presencia de marcadores de superficie positivos y negativos en las líneas uMSC creadas a partir de muestras individuales de tejido del cordón umbilical (Tabla 1).
- Analizar las células marcadas por citometría de flujo y determinar el porcentaje de células CD105+CD90+ y CD105+CD73+ . Analice las células CD105+ y CD34−CD45− por separado.
3. Diferenciación de uMSCs en músculo esquelético
- Recubrir las placas de cultivo de tejidos con 0,01% de colágeno y 20 μg/ml de laminina en PBS. Cubra estas placas durante un mínimo de 4 h a temperatura ambiente.
- Placa uMSCs a una densidad de 10.000 células/cm2 en medio de crecimiento.
- Cuando las células sean 70% confluentes, aspire el medio de crecimiento y enjuague los cultivos 2x con PBS. Añadir medio de diferenciación miogénica (M1) compuesto por DMEM + 5% de suero de caballo + 0,1 μM de dexametasona + 50 μM de hidrocortisona a las uMSCs. Para la determinación de la cinética de la progresión miogénica, agregue medio M1 cada dos días a los cultivos.
- Para determinar la cinética de la progresión miogénica, analice las uMSC para la expresión de Pax7, MyoD, Myogenin y MyHC a los 2 días, 4-5 días, 6-7 días y 10-14 días, respectivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El éxito del aislamiento de las uMSC del tejido del cordón umbilical es del >95%, a diferencia de las bajas tasas de éxito de la sangre total del cordón umbilical. Tras el aislamiento exitoso de las uMSC, el análisis FACS revela que todas las células son CD34−CD45−CD105+CD90+. Sin embargo, en el análisis comparativo, las uMSC aisladas de la sangre del cordón umbilical muestran poblaciones heterogéneas, en las que una proporción de células muestra CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%). Además, los CD105 + CD90 + doble positivos son menos en número (~ 5%) (Figura suplementaria S1). Esto da como resultado niveles reducidos de diferenciación miogénica entre las uMSC de la sangre del cordón umbilical, ya que se requiere la expresión de CD105 y CD90 para la inducción de la miogénesis. Los uMSC también muestran la expresión de los marcadores enumerados en la Tabla 1. Si hay contaminación de las uMSC derivadas de la sangre del cordón umbilical, también habrá una presencia de células CD34 + CD45 +. Esto da como resultado recuentos de células falsas para el recubrimiento para la diferenciación miogénica. Una indicación de que >90% de las células son doblemente positivas para la expresión de CD105 y CD90 es que las uMSC no se han comprometido con ningún linaje mesodérmico y continúan siendo multipotentes, ya que tanto la expresión de CD105 como la de CD90 están reguladas a la baja tras la diferenciación. Es imperativo utilizar múltiples marcadores para la confirmación de fenotipos uMSC, ya que no existe un único marcador uMSC definitivo. En este análisis, se evaluó la presencia de todos los marcadores enumerados en la Tabla 1 para cada una de las líneas uMSC establecidas en el laboratorio. Además, determinamos el estado de doble positivo de CD105 y CD90 (Figura 2A), así como de CD105 y CD73 (Figura 2B), asegurando que los uMSC expresen múltiples marcadores clave. Esto es necesario para evitar contaminar células monopositivas que están presentes en números inferiores al 0,05%.
Figura 1: Esquema que muestra el aislamiento paso a paso y la caracterización de uMSCs del tejido del cordón umbilical. Abreviatura: uMSCs = células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de marcadores MSC en uMSCs derivadas del tejido del cordón umbilical. (A) Las uMSC muestran la expresión de CD105 y CD90 y no expresan marcadores hematopoyéticos, CD34 y CD45. Se muestran gráficos FACS representativos de tres líneas uMSC (UCT15, UCT18 y UCT26) (N = 16). La fila superior de paneles muestra celdas en las tres líneas uMSC en el cuadrante Q2 positivo para la expresión CD105 y CD90. La fila inferior de paneles muestra las celdas en el cuadrante Q1 positivas para la expresión de CD105 y negativas para la expresión de CD34 y CD45. (B) Las uMSC muestran la expresión del marcador MSC, CD73 (N = 16). Abreviatura: uMSCs = células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Marcadores positivos de uMSC | Marcadores negativos uMSC |
| CD105 | CD34 |
| CD90 | CD45 |
| CD73 | CD106 |
| CD29 | HLA DR |
| CD44 | CD31 |
| HLA ABC | CD14 |
| CD49e | CD49e |
| CD54 | |
| CD13 |
Tabla 1: Lista de marcadores positivos y negativos para uMSCs. Abreviatura: uMSCs = células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano.
Para la diferenciación de las uMSC en el linaje miogénico, las uMSCs suelen expresar Pax7, un marcador para las células precursoras dentro de los primeros 2 días de la adición de M1, seguido de MyoD dentro de los primeros 4 días de la adición de M1 (Figura 3). A los 6 días de diferenciación, las células expresan la proteína miogenina, seguida de la expresión de la cadena pesada de miosina (MyHC) entre 10 días y 14 días de la inducción de la diferenciación. Caracterizamos con más detalle la cinética de la expresión miogénica mediante secuenciación de ARN, citometría de flujo, inmunocitoquímica, RT-PCR y análisis de western blot para documentar la expresión por etapas de marcadores miogénicos, confirmando la robustez de este protocolo. La secuenciación transcriptómica del genoma completo entre uMSC indiferenciadas y uMSC que se diferenciaron en músculo esquelético reveló la regulación ascendente de 907 genes en respuesta a la inducción de la diferenciación miogénica (Figura 4).
Figura 3: Diferenciación de uMSCs en músculo esquelético. Las uMSCs se cultivaron en medio M1 durante 2 días, 4 días, 7 días y 10 días y se evaluaron para (A) Pax7 después de 2 días, (B) MyoD después de 4 días, (C) Expresión de miogenina de diferentes líneas de uMSC, denotadas por T8, T12, T14 y T25 después de 7 días, y (D) MyHC después de 10 días. Barras de escala = (B, D) 50 μm. Abreviaturas: uMSCs = células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano; GAPDH = gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; MyoD = proteína de determinación de mioblastos 1; MyHC = cadena pesada de miosina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; Mb = mioblasto; MT = miotubo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Perfil transcriptómico comparativo de uMSCs derivados de la sangre del cordón umbilical y el tejido del cordón umbilical diferenciados en músculo esquelético. Mapa de calor de recuentos normalizados de 907 genes entre uMSCs de control y uMSCs diferenciados en músculo esquelético durante 7 días a partir de la sangre del cordón umbilical y el tejido del cordón umbilical. El diagrama de Venn (izquierda) muestra un mayor número de genes miogénicos regulados al alza en las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical en comparación con las uMSC derivadas de la sangre del cordón umbilical. La siguiente tabla muestra los genes miogénicos comunes regulados al alza tanto en el tejido del cordón umbilical como en la sangre del cordón umbilical. Esta cifra es de Mishra et al.6. Abreviaturas: 1, 2 = réplicas biológicas; CB1,2 = células miogénicas derivadas de uMSCs de sangre del cordón umbilical; CT1, 2 = células miogénicas derivadas de uMSCs del tejido del cordón umbilical; coB1,2 = controlar las uMSC indiferenciadas de la sangre del cordón umbilical; coT1, 2 = controlar las uMSC indiferenciadas del tejido del cordón umbilical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para realizar un análisis comparativo, se compararon las uMSC aisladas de la sangre del cordón umbilical y el tejido del cordón umbilical. Los datos de secuenciación de ARN revelaron que había más genes miogénicos regulados al alza en las uMSC de las células miogénicas derivadas del tejido del cordón umbilical que de las derivadas de la sangre del cordón umbilical (Figura 4). Los datos de secuenciación de ARN utilizados para apoyar este estudio se cargan en NCBI (la adhesión de SRA es GSE147114). Brevemente, el análisis transcriptómico específico del tejido utilizando la base de datos PANTHER GO-slim identificó proteínas citoesqueléticas asociadas con la unión a actina y el ensamblaje de sarcómeros (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) transportadores asociados con la función contráctil (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), mantenimiento de la masa muscular ( FBXO32, TRIM16L, GHR), señalización de calcio (FKBP5) y función enzimática (COX7A1, PDK4) (Figura 4). En conjunto, estos datos demuestran que las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical representan un compartimento que muestra un potencial miogénico robusto.
Debido a la variación individual entre las líneas de uMSC que podrían surgir de las eficiencias en el aislamiento, la heterogeneidad dentro del compartimento de uMSC, la edad de la madre y el estado de salud de la madre, incluidos sus niveles de nutrientes, podría haber diferencias en las tasas de proliferación y los potenciales miogénicos entre las líneas de uMSC establecidas. Sin embargo, a pesar de las diferencias en la cinética de expresión, se mantiene la tendencia general de aumento de la miogenicidad con la expresión por etapas de los marcadores miogénicos.
Figura suplementaria S1: Análisis de marcadores MSC en uMSC derivadas de la sangre del cordón umbilical. Las uMSC muestran la expresión de CD105 y marcadores hematopoyéticos, CD34 y CD45. El análisis de la población CD105+ muestra que sólo una pequeña proporción de estas células co-expresa CD90 (N = 5). Abreviatura: uMSCs = células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pasos críticos
Un paso crítico en este protocolo es la recolección de tejido en condiciones asépticas, desde el momento de la entrega hasta el mantenimiento de cultivos estériles, durante toda la propagación. Durante la recolección del cordón, es esencial que el cordón no toque ninguna superficie no esterilizada y se frote externamente con etanol al 70% antes de la recolección en tubos que contengan PBS suplementado con antibióticos. Es importante limitar el tiempo entre la recolección del cordón umbilical y el procesamiento del tejido para el aislamiento de uMSC. En caso de que sea necesario transportar tejido desde el sitio de recolección hasta el laboratorio, se debe tener cuidado de mantener el tejido en tampones que contengan antibióticos y almacenarlo en hielo.
Modificaciones y solución de problemas del método
La modificación clave en este protocolo para inducir la diferenciación miogénica de las uMSC es el recubrimiento de platos con 0,01% de colágeno tipo 1 y 20 μg/ml de laminina. Observamos que la progresión miogénica en uMSCs en presencia de medio M1 se potencia cuando también se modulan las condiciones de adhesión. Es necesario probar si el uso de otras matrices superiores, aunque costosas, como Matrigel podría mejorar aún más este protocolo. Las variaciones en el rendimiento entre muestras individuales pueden dar lugar a que algunos tejidos generen un recuento de células más bajo. En tales casos, podría ser preferible recolectar una mayor longitud de tejido del cordón umbilical que esté >5 cm. En este contexto, pocos informes han utilizado 10 cm de tejido del cordón umbilical para aumentar el rendimiento de las uMSC. La mayoría de los informes que describen el aislamiento de las uMSC del tejido del cordón umbilical han hecho uso de enzimas que degradan la matriz extracelular para el aumento de la liberación de células del estroma del cordón umbilical 3,5,7,8. El uso de cultivos explantados por algunos estudios, incluido este informe, ha demostrado continuamente un aumento de la viabilidad celular y un rendimientode 6,9,10. Además, la ausencia de la necesidad de realizar la clasificación celular para purificar las poblaciones celulares, que a menudo se incluye en la purificación de uMSC de la sangre del cordón umbilical, aumenta el número celular y la integridad.
Limitaciones del método
Una limitación clave del método es el tiempo requerido para el establecimiento completo de líneas uMSC a partir de muestras individuales de tejido del cordón umbilical. Normalmente, se requieren 3 semanas para generar cada línea uMSC utilizando este protocolo. Después de esto, se requieren 2 semanas para la diferenciación miogénica completa. Esta duración prolongada de la investigación puede ser engorrosa en grandes cohortes que examinan los potenciales de diferenciación de las uMSC de diferentes participantes, con la intención de obtener información sobre el medio intrauterino o predecir los parámetros metabólicos de los órganos de la descendencia, como la composición corporal. Una segunda limitación es la heterogeneidad dentro de la matriz del tejido del cordón umbilical, que podría poseer diferencias fenotípicas intrínsecas entre los diversos compartimentos uMSC y que podría ser responsable de los potenciales de diferenciación entre las diferentes fuentes. Por ejemplo, las uMSC del WJ muestran un menor potencial osteogénico en comparación con las uMSC derivadas de CL11. Por lo tanto, este método no describe las diferencias inherentes entre los diferentes compartimentos dentro del propio tejido del cordón umbilical.
Importancia del método con respecto a los métodos existentes
Usando este protocolo, podemos obtener un recuento de células de 1 × 104 a 1 × 106 uMSCs a partir de muestras individuales de tejido del cordón umbilical. Estas líneas uMSC se pueden usar de manera confiable para ensayos de al menos 6-8 pasajes. A pesar del grado de variación en los fenotipos celulares típicos de las poblaciones humanas, el tiempo promedio de duplicación de las uMSC observadas en nuestra cohorte de 15 mujeres del norte de la India fue inferior a 2 días6. Un análisis de sus tasas proliferativas utilizando la incorporación de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) mostró que al menos el 80% de las células habían pasado por la fase S en un lapso de 6 h6. Además, las uMSC del tejido del cordón umbilical también muestran bajas tasas de senescencia, lo que indica la robustez de este método de aislamiento6. Previamente comparamos el grado de inducción miogénica en uMSCs utilizando este protocolo con el utilizado para inducir la miogénesis en células madre pluripotenciales humanas y murinas 6,12. Encontramos que este protocolo es un inductor más potente de la diferenciación miogénica que los protocolos existentes.
Importancia del método y aplicaciones
Las terapias celulares y regenerativas exitosas dependen de la viabilidad y el rendimiento celular, lo que requiere un gran número de células de los primeros pasajes. Por lo tanto, este método ofrece una alternativa conveniente para aplicaciones clínicas. El robusto protocolo de diferenciación miogénica proporcionado en este informe y la caracterización molecular en profundidad de la progresión miogénica utilizando este protocolo en nuestro trabajo complementan los esfuerzos para recapitular la miogénesis fetal y se pueden utilizar como modelo para imitar el entorno intrauterino y reflejar el metabolismo postnatal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos al Sr. Ojas Tikoo por su ayuda con la filmación y producción de video. También reconocemos la ayuda recibida del personal de GARBH-Ini (Grupo Interdisciplinario sobre Investigación Avanzada y Resultado del Nacimiento-DBT India), enfermeras y oficiales superiores de investigación en el Hospital Civil Gurugram y el Dr. Pallavi Kshetrapal por su ayuda con la logística. Este trabajo fue apoyado por subvenciones otorgadas a Suchitra Gopinath del Departamento de Biotecnología, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
