Summary
Denne protokollen presenterer en standardisert suturutvidelsesmusemodell og en 3-D-visualiseringsmetode for å studere de mekanobiologiske endringene i suturen og beinremodelleringen under strekkkraftbelastning.
Abstract
Craniofacial suturer spiller en avgjørende rolle utover å være fibrøse ledd som forbinder kraniofacial bein; De tjener også som den primære nisje for calvarial og ansikts bein vekst, boliger mesenkymale stamceller og osteoprogenitorer. Ettersom de fleste kraniofaciale bein utvikler seg gjennom intramembranøs ossifikasjon, fungerer suturenes marginale regioner som initieringspunkter. På grunn av denne betydningen har disse suturene blitt spennende mål i ortopediske terapier som fjærassistert kranialhvelvutvidelse, rask maksillærekspansjon og maksillær protraksjon. Under ortopedisk sporingskraft aktiveres suturstamceller raskt, og blir en dynamisk kilde for beinremodellering under ekspansjon. Til tross for deres betydning, forblir de fysiologiske endringene under beinremodelleringsperioder dårlig forstått. Tradisjonelle snittingsmetoder, først og fremst i sagittaleretningen, fanger ikke opp de omfattende endringene som skjer gjennom hele suturen. Denne studien etablerte en standard musemodell for sagittal suturekspansjon. For fullt ut å visualisere beinremodelleringsendringer etter suturekspansjon, ble PEGASOS-vevsfjerningsmetoden kombinert med helmontert EdU-farging og kalsiumchelaterende dobbeltmerking. Dette tillot visualisering av svært prolifererende celler og ny beindannelse over hele kalvariale bein etter ekspansjon. Denne protokollen tilbyr en standardisert suturutvidelsesmusemodell og en 3-D-visualiseringsmetode, som kaster lys over de mekanobiologiske endringene i suturer og beinremodellering under strekkkraftbelastning.
Introduction
Craniofacial suturer er fibrøst vev som forbinder kraniofacial bein og spiller viktige roller i vekst og remodeling av kraniofacial bein. Suturens struktur ligner en elv, og gir en strøm av celleressurser for å nærme og bygge "elvebredden", kjent som osteogene fronter, som bidrar til dannelsen av kraniofaciale bein via intramembranøs osteogenese1.
Interessen for kraniofacial suturer har blitt drevet av kliniske behov for å forstå for tidlig lukking av kraniale suturer og ansiktssuturdysfunksjon, noe som kan føre til kraniofacial deformiteter og til og med livstruende forhold hos barn. Åpen suturektomi brukes rutinemessig i klinisk behandling, men langtidsoppfølging har vist ufullstendig reossifikasjonsresidiv hos noen pasienter2. Minimalt invasiv kraniotomi assistert av ekspansjonsfjærer eller endoskopisk stripe kraniektomi kan gi en sikrere tilnærming til å bevare potensiell sutur i stedet for å kaste vevet3. På samme måte har ortopediske terapier som ansiktsmasker og ekspansjonsapparater blitt mye brukt til å behandle sagittal eller horisontal maksillær hypoplasi, med noen studier som utvider aldersbegrensningen til å behandle voksne pasienter via miniskrueassisterte palatalutvidere 4,5,6. I tillegg er kranial suturregenerering med mesenkymale stamceller (MSC) kombinert med biologisk nedbrytbare materialer en potensiell terapi i fremtiden, og tilbyr en ny retning for behandling av relaterte sykdommer7. Imidlertid forblir funksjonsprosessen eller reguleringsmekanismen for suturer unnvikende.
Benremodellering består hovedsakelig av en balanse mellom beindannelse utført av osteoblaster og benresorpsjon utført av osteoklaster, hvor osteogen differensiering av stamceller stimulert av mekaniske signaler spiller en viktig rolle. Etter flere tiår med forskning har det blitt funnet at kraniofaciale suturer er svært plastiske mesenkymale stamcellenisjer8. Suturstamceller (SuSC) er en heterogen gruppe stamceller som tilhører mesenkymale stamceller (MSC) eller benstamceller (SSC). SuSC er merket in vivo med fire markører, inkludert Gli1, Axin2, Prrx1 og Ctsk. Spesielt Gli1+ SuSC har strengt verifisert de biologiske egenskapene til stamceller, ikke bare med høyt uttrykk av typiske MSC-markører, men også demonstrert utmerket osteogent og kondrogent potensial9. Tidligere forskning har vist at Gli1+ SuSCs aktivt bidrar til ny beindannelse under strekkkraft, og identifiserer dem som suturstamcellekilden som støtter distraksjonosteogenese 10.
Tidligere ble omfattende mekaniske egenskaper av stamceller studert in vitro via Flexcell, firepunkts bøying, mikromagnetlastesystem og andre. Selv om mesenkymale celler fra musekraniale suturer har blitt identifisert in vitro11, og mesenkymale stamceller fra human sutur også har blitt isolert nylig12, er den biomekaniske responsen av suturceller fortsatt uklar i in vitro-systemet. For å undersøke beinremodelleringsprosessen ytterligere, er det etablert en suturekspansjonsmodell basert på isolert organkultur av calvaria, som baner vei for å etablere en nyttig in vivo suturutvidelsesmodell 1,13. Kaniner14 og rotter15 har vært de mest brukte dyrene i grunnforskning for suturutvidelse. Imidlertid er mus foretrukne dyremodeller for å utforske menneskelig sykdom på grunn av deres svært homologe genom med mennesker, mange genmodifikasjonslinjer og sterk reproduktiv hybridiseringsevne. Eksisterende musemodeller av kranial suturutvidelse er vanligvis avhengige av ortodontiske fjærtråder i rustfritt stål for å påføre strekkkraft til sagittal sutur16,17. I disse modellene er det laget to hull i hver side av parietalbenene for å fikse ekspansjonsanordningen, og ledningene er innebygd under huden, noe som kan påvirke celleaktiveringsmodus.
Når det gjelder visualiseringsmetoden, har den todimensjonale observasjonen av skiver i sagittalretningen blitt generelt vedtatt i flere tiår. Imidlertid, med tanke på at beinremodellering er en kompleks tredimensjonal dynamisk prosess, har det blitt et presserende behov å skaffe fullstendig tredimensjonal informasjon. PEGASOS vevsgjennomsiktighetsteknikk dukket opp for å oppfylle dette kravet 18,19. Det gir unike fordeler for gjennomsiktigheten av hardt og bløtvev, slik at hele beinremodelleringsprosessen kan reproduseres i tredimensjonalt rom.
For å få en dypere og mer omfattende forståelse av de fysiologiske endringene i beinremodelleringsperiodene, ble det etablert en standard sagittal suturekspansjonsmusemodell med en fjærinnstilling mellom de håndlagde holderne10. Med en standardisert syreetsnings- og bindingsprosedyre kunne ekspansjonsanordningen bindes fast til kraniebenet, og generere en strekkkraft vinkelrett på sagittalsuturen. Videre ble PEGASOS-vevsfjerningsmetoden anvendt etter dobbeltmerking av det mineraliserte beinet etter ekspansjon for fullt ut å visualisere beinmodelleringsendringene etter suturekspansjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer beskrevet her ble godkjent av dyrepleiekomiteen ved Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB). 4 uker gamle C57BL/6 hannmus ble brukt i denne studien. Alle instrumentene som ble brukt ble sterilisert før prosedyren.
1. Utarbeidelse av suturekspansjonsmodellen
- Utarbeidelse av to oppbevaringshavere.
- Bruk 0.014'' australsk wire eller rustfritt ståltråd (se materialfortegnelse) for å lage en spiralformet sløyfe med lett trådtang. Diameteren på løkken er 2 mm, og 1 mm hale er reservert på to sider (figur 1A).
- Steriliser ledningene og holderne for operasjonen i en autoklav, plasmasterilisator eller egnet kaldsterilant (f.eks. glutaraldehyd).
- Forberedelse av fjærene.
- Forbered tilpassede fjærer i rustfritt stål.
MERK: Trykkfjæren med 0,2 mm tråddiameter, 1,5 mm utvendig diameter, 1 mm intervallrom og 7 mm lengde brukes i denne studien (figur 1B). Hver 1 mm fjærkompresjon oppnådde en skyvekraft på ca. 30 g. - Skjær fjæren i en ledig lengde før du setter den. Bekreft kraften for den spesialiserte våren før forsøket.
MERK: Størrelsen på fjærene er varierte så lenge kraftstørrelsen er den samme i parallelle eksperimenter. Kraften måles av et uniaxialt testinstrument på bordplaten eller et lite elektronisk dynamometer (se materialfortegnelse) hvis tilstanden er begrenset. Lengdeendringen vurderes til kraftstørrelsen (figur 1C-E). Spesielt er det nødvendig å endre fjærkraftbelastningsverdien basert på alder, musens beintilstand og forskningsobjektene. - Forbered en rett australsk ledning eller rett ståltråd med 7 mm lengde, og lag to papirstykker med 2 mm diameter som skal brukes som barrierer (figur 1F).
- Forbered tilpassede fjærer i rustfritt stål.
2. Sagittal sutur ekspansjon kirurgi
- Bedøvelse: Bedøv musene med tiletamin (25 mg/kg), zolazepam (25 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg). På samme tid, bruk steril oftalmisk salve til øynene for å forhindre tørking av hornhinnen. Døm dybden av anestesi av musene via en tåklemme.
MERK: Følgende egenskaper indikerer at musen er bedøvet riktig: langsom og jevn pust, svakhet i lemmer, muskelavslapping, forsvunnelse av hudakupunkturrefleks og øyelokkrefleks, samt svakere hornhinnerefleks. - Pelsfjerning og desinfeksjon: Fjern forsiktig pelsen på toppen av hodet med hårfjerningskrem; Unngå å berøre øynene. Kort tid etterpå, bruk vekslende runder med jodophor og 75% alkohol for å desinfisere operasjonsstedet. Gi meloksikam (1 mg/kg) som analgesi til musene ved subkutan injeksjon.
- Fiksering av kroppsstilling: Sett musen liggende på forsiden og bruk kirurgisk tape for å fikse lemmer på operasjonsbordet.
- Åpen hodebunnsklaff: Bruk kirurgisk saks til å utføre en buet klaff langs hodebunnen nær musens hals, og blottlegg den sagittale suturen og den omkringliggende skallen. Deretter fester du hodebunnsklaffen med en 6-0 sutur på operasjonsbordet.
- Bind retensjonsholderne etter syreetsing.
- Tørk skallen og ets den med 37% fosforsyre i 20 s, og bruk vanlig saltvann for å rense opp syreetsingen (figur 2A). En kalkaktig rest vil være tydelig etter tørking av skallen med gummipipettepæren.
- Sement de to holderne (fremstilt i trinn 1.1) på begge sider av parietalbenene 3 mm fra sagittalsuturene med et lysherdet lim (figur 2B).
- Tilbakestill hodebunnsklaffen.
- Sett hodebunnslappen manuelt tilbake (figur 2C). Merk holderens posisjon, kutt to små hull i hodebunnen i den tilsvarende posisjonen til de bilaterale retensjonsholderne, og tilbakestill deretter den flappede hodebunnen.
- På samme tid, pass de små løkkene gjennom hullene for å avsløre hudens overflate. Sutur det buede snittet med en 6-0 sutur (figur 2D). En til tre dager er tillatt for hudgjenoppretting. Administrer meloksikam (1 mg/kg) til mus ved subkutan injeksjon hver 24. time i 1 til 3 dager.
MERK: Etter operasjonen, sjekk daglig aktiviteten til musens hodebunn og om holderne faller av. Det finnes ulike typer hud når det gjelder farge og tykkelse; Den sunne hudhodebunnen vil opprettholde den opprinnelige fargen, og hudkantene vil gradvis smelte sammen etter suturering. Hvis en infeksjon i hodebunnen er funnet, eller hvis kirurgisk enhet har falt av, fjern musen fra studien og avlive den.
- Monter fjæren og ledningstråden.
- Klipp fjæren 1 mm lenger enn avstanden mellom de to holderne.
- Komprimer den valgte trykkfjæren og plasser den mellom de små spolene på begge sider.
- Før den rustfrie ståltråden gjennom de små spolene og fjæren, og slipp fjæren for å oppnå en startkraft på ca. 30 g.
- Sjekk at hodebunnen under fjærområdet av musen er uten komprimering.
- Etter å ha bekreftet at bindingen er fast uten løshet, bind to papirlapper mellom fjæren og holderne med et lysherdet lim for å sette opp barrierer i begge ender av fjæren (figur 2E, F).
3. Dobbel merking av mineraliserte bein
- Fremstilling av stamløsningen.
- Forbered en fortynningsløsning med destillert vann som inneholder 0,9% NaCl og 2% NaHCO3.
- Bruk oppløsningsvæsken til å tilberede 20 mg/ml alizarinkompleksdihydrat og 10 mg/ml kalcein (se materialfortegnelse).
- Juster pH til 7,4 ved hjelp av en pH-måleenhet. Skyll pH-sonden mellom målingene for å sikre nøyaktige avlesninger.
- Ha fargestoffet i en steril beholder og oppbevar det i kjøleskap ved 4 °C. Folie brukes til å holde lyset ute.
- Forbered arbeidsløsningen. Før injeksjon fortynnes stamoppløsningen til 1 mg/ml for kalsium og 2 mg/ml for alizarinkompleksdihydrat ved bruk av en oppløsningsoppløsning.
- Intraperitonealt injiser 5 mg / kg Calcein grønn og 20 mg / kg Alizarin rød på to tidspunkter for å merke de mineraliserte beinene og analysere endringene mellom to ganger. Vanligvis samles prøvene 12-14 timer etter injeksjon.
MERK: Varm fargestoffene før injeksjon, og sørg for at injeksjonstiden ikke er mindre enn 3 minutter. Injeksjonsintervallet avhenger av ekspansjonstidspunktet. I denne studien ble alizarinrød og kalceingrønn injisert over natten (O/N) før henholdsvis ekspansjon og O/N før innsamling. - Samle hele calvarial bein forberedt på vevsryddingsprosedyre en dag etter den andre injeksjonen.
4. EdU farging
- Intraperitoneal injeksjon: Injiser EdU 2 timer intraperitonealt før avliving av musene (etter institusjonelt godkjente protokoller). Dosen er 1 mg/10 g kroppsvekt.
- Merking av cocktailtilberedning: Bland Tris-bufret saltvann (100 mmol / L final, pH 7,6), CuSO4 (4 mmol / L finale), sulfo-cyanin 3 azid (2-5 μmol / L final) og natriumaskorbat (100 mmol / L final, laget fersk hver bruk) (se materialfortegnelse).
- EdU helmontert farging: Etter avfargingstrinnet for vev i PEGASOS-vevsfjerningsmetoden (trinn 7), legg prøver i merkingscocktailen i 1 dag ved romtemperatur (RT).
5. Mikro-computertomografi bildebehandling
- Vevsfiksering og lagring: Fest de kalvariale beinene i 4 % paraformaldehyd (PFA) ved 4 °C O/N og oppbevar dem i 0,5 % PFA før skanning.
- Skanning og analyse: Skann prøvene med et mikrocomputertomografi (μCT) bildebehandlingssystem med høy oppløsning og en voxelstørrelse på 7 μm.
6. Forberedelse av arbeidsløsning for PEGASOS vevsfjerning
- 4% polyformaldehyd (PFA): Løs opp 4 g PFA pulver i 1× PBS til 100 ml.
- Hjerteperfusjonsløsning: 0,02% Heparin, det vil si 20 mg heparinpulver oppløst i 1× PBS til 100 ml; alternativt kan du bruke 0,05 mol/l EDTA, det vil si 0,05 mol etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (se materialtabell), oppløst i en avionisert vandig oppløsning til et totalt volum på 1 L.
- Avkalkingsløsning: 0,5 mol / l EDTA, det vil si 0,5 mol etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), oppløst i en avionisert vandig løsning til et totalt volum på 1 L.
- Avfargingsløsning: 25% Quadrol, som er 250 ml Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-hydroksypropyl) etylendiamin) (se materialtabell) oppløst i avionisert vann til et totalt volum på 1 l.
MERK: På grunn av viskositeten til Quadrol kan den varmes opp til 60 °C for å øke fluiditeten før konfigurasjon. - Avfettingsløsning: 30%, 50%, 70% tert-Butanol (tB) (se materialtabell), fremstilt med vann etter volumfraksjon.
MERK: Tatt i betraktning at ren tB er krystallinsk ved romtemperatur, må den varmes opp til 60 °C til den oppløses før den kan brukes. Deretter tilsettes 3% til 5% (v / v) trietanolamin (TEA) for å regulere pH i løsningen >9,5. - Dehydreringsløsning: TB-PEG-løsning, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v / v), karakterisert ved at PEG-MMA er poly (etylenglykol) metyletermetakrylat med en gjennomsnittlig molekylvekt på 500 (Poly (etylenglykol) metakrylat 500, PEG-MMA 500) (se materialtabell).
- Transparent løsning: BB-PEG løsning, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v / v), hvor BB er benzylbenzoat (BB).
7. Gjennomsiktighet av kalvariale bein med PEGASOS-metoden
- Bedøv musen ved intraperitoneal injeksjon av anestetika (trinn 2.1), og bedøm dybden av anestesi av musen gjennom klemmereaksjonen for å sikre at det ikke er noen motstandsreaksjon før hjerteperfusjon.
- Utfør hjerteperfusjon og fiksering.
- Hold magen på musen oppover, fest lemmer med tape, og kutt forsiktig langs brystets omkrets for å avsløre den helt.
- Umiddelbart etter å ha gjort et lite kutt i høyre atrium med oftalmisk saks, sett inn en perfusjons 22 G nål på toppen av venstre ventrikel.
MERK: Bare nålespissen er satt inn for å unngå å skade hjerteklaffen ved overdreven innsetting. Ellers vil hjerteperfusjonsvæske komme inn i lungesirkulasjonen, noe som påvirker perfusjonseffekten av den systemiske sirkulasjonen. - Trykk 30-50 ml hjerteperfusjonsvæsken (trinn 6.2) inn i sprøyten. Det kan ses at leveren gradvis blir blek fra lyse rødt.
- Etter at utstrømningsvæsken fra høyre atrium blir helt klar, fyll 4% PFA-oppløsning i like volum. Drift av PFA-perfusjon utføres i en ventilert hette.
- Dissekere og separere vev og organer, og fikse dem over natten med 4% PFA ved 4 ° C.
- Vevsavkalkning: For prøver behandlet ved EdU-farging, legg det faste harde vevet i 0,5 mol / L EDTA (pH 7,0) løsning (10 ml) i en ristetabell ved 37 ° C i ca. 2 dager, og skift væsken daglig.
MERK: Hopp over avkalkningsprosessen i den normaliserte PEGASOS-metoden for kalsiumchelaterende middel merket bein for å bevare signaleringen fullt ut. Avkalkning er nødvendig for å behandle beinene for å visualisere den endogene fluorescensen eller helmonterte immunfargede signaler. - Avfarging av vev: Legg de faste kalkvariale benene i 25 % Quadrol-oppløsning (20 ml) i et ristebord ved 37 °C i 1 dag, og bytt væske én gang.
MERK: Avfargingstiden er relatert til hemeinnholdet i vevet. Vær oppmerksom på fargen på behandlingsvæsken, da fargedybden representerer behovet for å fortsette væskeutskiftningsbehandlingen. - EdU-farging: Skyll prøvene i 1× PBS i 5 min (tre ganger), og senk dem deretter i merkingscocktailen i 1 dag. Skyll deretter prøvene i 1× PBS i 1 time (tre ganger).
- Avfetting av vev og dehydrering
- Plasser vevet i 30 % tB, 50 % tB og 70 % tB oppløsninger i rekkefølge for å utføre gradientreduksjon på et ristebord ved 37 °C. Plasser i hver konsentrasjon i ca 2 timer.
- Deretter dehydrerer du prøvene i TB-PEG-oppløsning i 6 timer på et ristebord ved 37 °C.
MERK: Ovennevnte behandlingstid kan økes eller reduseres avhengig av vevets nummer.
- Vevets gjennomsiktighet: Legg det fullstendig dehydrerte vevet i BB-PEG-oppløsning på et ristebord ved 37 °C (2-4 timer) til det er gjennomsiktig. For tiden kan prøver lagres i opptil 1-2 år.
MERK: Etter nesten fullstendig rydding, åpne rørlokket for å eksponere prøvene og medium til luft med risting vil forbedre gjennomsiktigheten ytterligere. Denne metoden er egnet for å forbedre gjennomsiktigheten til individuelle vev og organer, så vel som hele hodet og kroppen av unge mus. For gjennomsiktigheten av hele kroppen av voksne mus, bør trinnene ovenfor utføres ved hjelp av en fullsyklus perfusjonsmetode.
8. Bildebehandling
MERK: Konfokalmikroskopi ble brukt til 3-D visualisering av gjennomsiktig vev i denne studien. Lysarkmikroskopi er også egnet for denne protokollen. Flere operativsystemer er bekreftet som tilgjengelige før. Her er et laserkonfokalmikroskop-operativsystem tatt som et eksempel (se materialfortegnelse).
- I henhold til brukerhåndboken, følg de riktige trinnene for å åpne laserkonfokal- og LAS AF-operasjonsgrensesnittet. Slå på ønsket laser i forskjellige opptakskanaler, og juster strømmen. Sett den optiske banen og den tilsvarende bølgelengden, 561 nm for Alizarin-rød og 488 nm for Calceingrønn, hvorav noen brukes til EdU-signalet i henhold til merkingscocktailen.
- Plasser de gjennomsiktige prøvene i det konkave glassfatet som kan bære tykke prøver, innebyggingsbokser eller selvlagde plasseringsanordninger som vanntett lim for å fordype de gjennomsiktige prøvene i en gjennomsiktig væske.
- Velg en objektivlinse med lav effekt for raskt å finne prøven. Lag en oversikt over hele det kalvariale vevet med hurtigskanningsfunksjonen, og finn interesseområdet for avbildning.
- Still inn utgangseffekt, velg skannemodus og juster først opptakskoeffisientene (oppløsning, skannehastighet, zoomfaktor, bildekvalitet, gjennomsnittlig bakgrunnsstøy osv.).
MERK: Generelt varierer Smart Gain fra 500 til 800 (både signal og støyendring); Smart Offset er så nær 0 som mulig, samtidig som bildekvaliteten sikres (for å redusere bakgrunnsstøy). Når PMT-gevinsten er høyere enn 800, eller HyD-gevinsten er større enn 100%, og lysstyrken fortsatt er utilstrekkelig, kan laserintensiteten økes hensiktsmessig, men i prinsippet, jo lavere, jo bedre. - Angi aksial avstand Z-område og Z-trinn, som bores ned fra den grunneste siden av den gjennomsiktige organisasjonen; Det vil si, sett de dypeste og grunneste sidene.
MERK: Bekreft klassifiseringen og arbeidsavstanden for hvert objektiv. Still inn Z-området nøye, og ikke bruk arbeidsavstanden som overskrider grensen for det valgte objektivet. "Z-Galvo" kan velges når finregulering er nødvendig. - Still inn opptaksparametrene igjen, og begynn å skyte. Etter ferdigstillelse, slå sammen og behandle bildene gjennom den multifunksjonelle modulen. Til slutt, lagre og slå av instrumentet i den angitte rekkefølgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen er det etablert en musemodell for sagittal suturekspansjon (figur 1-2). For 3D-visualisering av beinmodelleringsendringer etter suturekspansjon ble PEGASOS-vevsfjerningsmetoden anvendt på hele kalvariale bein etter ekspansjon. Etter perfusjon ble kalkvariale bein separert (figur 3A), og den adekvate PEGASOS-prosessen ble videreført (tab 1 og tabell 2). Bemerkelsesverdig nok ble kalvariale bein nesten gjennomsiktige etter hele PEGASOS-prosessen, uavhengig av om avkalkning ble utført (figur 3B,C).
For raskt å visualisere endringene etter ekspansjon ble μCT brukt på de innsamlede og faste prøvene. Sammenlignet med kontrollgruppen (figur 4A) ekspanderte kranialsuturen gradvis og signifikant etter kraftbruk i 1 dag (figur 4B). Ved den femte dagen oppstod fluffy benete fremspring på beinkanten (figur 4C).
For tredimensjonal visualisering av mineraliseringssammenstillingshastigheten i hele suturen etter ekspansjon ble dobbeltmerkingsmetoden benyttet sammen med den effektive PEGASOS-teknikken, selv på ikke-avkalkede kalvariale bein (figur 5). Under fysiologiske forhold var det små endringer mellom signaler fra tidligere postmerking (figur 5A), mens kraftbelastning signifikant aktiverte osteogenese. Sikksakkmønsteret av nylig mineralisert bein, merket med en enkelt kalsiumgulgrønn markør, utvidet etter utvidelse i 7 dager (figur 5B, C). I høyoppløselig tredimensjonal visualisering indikerte mønsterendringene i marginale bein beinremodelleringsprosessen etter suturekspansjon, og graden av nydannet ben varierte på to sider av suturene (figur 5C).
Videre, for å visualisere proliferasjonshastigheten til celler ved suturekspansjon, ble helmontert EdU-inkorporering forsøkt ved bruk av PEGASOS-vevsfjerningsmetoden med en forkalkningsprosess. Vellykket var merkingen effektiv og godt bevart i ryddet vev. I kontrollgruppen ble flere EdU+-celler diffust fordelt gjennom suturene (figur 6A), noe som kan være viktig for fysiologisk beinremodellering og muligens oversett i 2D-snitting. Ved ekspansjon i 1 dag toppet de prolifererende cellene seg i midten og kantene av suturene (figur 6B). Etter hvert som suturen økte, ble antallet prolifererende celler redusert over tid, og nådde dag 7 (figur 6C). De markerte cellene var små runde celler i benmargen, noe som indikerte blodceller, som skilte seg fra suturcellene EdU+ (figur 6C).
Figur 1 Vitale materialer ble klargjort for kirurgi. Retensjonsholdere ble laget av rustfritt ståltråd. Diameteren var 2 mm, og 1 mm haler var reservert på to sider (A). Trykkfjæren med 0,2 mm ledningsdiameter, 1,5 mm utvendig diameter, 1 mm intervallrom ble påført (B). Strekkkraften ble detektert av et dynameter (C,D). Hver 1 mm fjærkompresjon oppnådde en skyvekraft på ca. 30 g (E) i dette eksperimentet. Papirbiter ble kuttet i form av drager med 2 mm diameter til bruk som barrierer (F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Den kirurgiske prosessen for suturekspanderende musemodell. Etter å ha snudd den kalvariale klaffen, ble syreetsing (A) samt binding (B) gjort i posisjonen der retensjonsholderne ville bli eksponert. Etter tilbakestilling av hodebunnslappen (C) ble holderne eksponert i markert posisjon (D). En fjær ble satt mellom to holdere for å utøve ekspansjonskraft på den kalvariale suturen, og to papirbiter ble festet i begge ender av fjæren som barrierer (E,F) etter å ha bekreftet at holderne var bundet fast. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: PEGASOS vevsclearingprosedyre ble anvendt for to kalvariale bein med eller uten avkalkning. Etter perfusjon ble det separert kalkbein, med noe blodfarget og bløtvev festet (A). Kalvariale bein som har opplevd avkalkningsprosessen (B) eller med ikke-avkalkning (C) var nesten helt gjennomsiktige etter hele prosessen med PEGASOS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Calvarial suturer utvidet seg gradvis etter anstrengelse av strekkkraft. μCT-bilder av sagittal sutur uten kraftbelastning (A) og etter kraftbelastning i 1 dag og 5 dager (B,C). Skala bar: 100 μm. Exp = utvidelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Osteogenese aktivert etter suturekspansjon i 3D-bilder. (A-C) Tredimensjonal visualisering av dobbeltmerkede sagittale suturer fjernet ved PEGASOS-metoden. Alizarinrød og kalceingrønn ble injisert intraperitonealt over natten før ekspansjon og før avliving etter ekspansjon i henholdsvis 7 dager (B,C), sammenlignet med kontrollgruppen uten mekanisk belastning på samme tidspunkt (A). 5x-objektiv ble brukt til å skaffe hele suturbildene effektivt (A,B), og boksbildet i (B) ble forstørret i (C, C', C'') avbildet med et 10x-objektiv. Vektstang i A,B: 100 μm, C: 150 μm. Exp = utvidelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Suturceller spredte seg sterkt ved strekkkraftbelastning i 3D-bilder. Helmonterte inkorporeringsanalyser kombinert med PEGASOS-vevsfjerningsmetoden viste de prolifererende cellene i hele suturen når de var i stillhet (A) eller etter kraftbelastning i 1 dag og 7 dager (B,C). Avbildet med et 10x objektiv. Streklinjer skisserer to kanter for sagittale suturer. Skala bar: 100 μm. Exp = utvidelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Prosesser | Løsninger | Tid og temperatur |
| 1. Intraperitoneal injeksjon | 1 mg/10 g EdU | 2 timer før avliving av musene |
| 2. Perfusjon | 0,02 % heparin & 0,05 mol/l EDTA | / |
| 3. Fiksering | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 4. Avkalkning | 10% EDTA | 2 dager, 37 °C |
| 5. Avfarging | 25% Quadrol | 1 dag, 37 °C |
| 6. EdU farging | Merking Cocktail | 1 dag, RT |
| 7. Avfetting | 30% tert-butanol | 2 timer, 37 °C |
| 50% tert-butanol | 2 timer, 37 °C | |
| 70% tert-butanol | 2 timer, 37 °C | |
| 8. Dehydrering | TB-PEG-løsning | 3 t*2, 37 °C |
| 9. Rydding | BB-PEG-løsning | 2 timer, 37 °C |
Tabell 1: PEGASOS vevsryddingsprosedyre for kalvariale bein med EdU-farging.
| Prosesser | Løsninger | Tid og temperatur |
| 1. Intraperitoneal injeksjon | 20 mg/kg Alizarin rød | Natten før utvidelsen |
| 2. Intraperitoneal injeksjon | 5 mg/kg Calcein | Natten før henting |
| 3. Perfusjon | 0,02 % heparin & 0,05 mol/l EDTA | / |
| 4. Fiksering | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 5. Avfarging | 25% Quadrol | 1 dag, 37 °C |
Tabell 2: PEGASOS vevsclearing prosedyre for calvarial bein med dobbel merking av mineraliserte bein av Calcein grønn og Alizarin rød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi brukte en standard suturekspansjonsmusemodell for å observere de vanlige morfologiske endringene som skjer hver uke i løpet av hele den månedslange ombyggingssyklusen10. Denne modellen er nyttig for å forske på calvarial bein remodellering og regenerering ved å utvide calvarial suturer, samt for å studere ulike suturceller in vivo. For å presentere resultatene av slik forskning fullt ut, er det nødvendig med tredimensjonal visualisering av farget vev. Derfor ble PEGASOS-teknologien, kjent for sin effektivitet i å rydde hardt vev19,20, kombinert med dobbel merking og EdU-farging for å avsløre utvidede mineraliseringshastigheter og prolifererende celler under ekspansjonsprosessen.
Når det gjelder suturekspansjonskirurgi, er et av de viktigste trinnene bindingen av festeringen. For å sikre en fast binding med beinoverflaten, standardiserte vi syreetsnings- og bindingsprosessen nederst på holderringen. De små løkkene på holderringen skal være vinkelrett på beinoverflaten og svare til små hull i hodebunnen. Etter suturering av hodebunnen, bør de små løkkene utsettes for hudoverflaten gjennom små hull i naturlig og balansert tilstand for å unngå at retensjonsringen kollapser under installasjonen av den kraftpåførende fjæren og ledningstråden, noe som kan føre til kirurgisk svikt. I tillegg er det viktig å velge en passende kraftpåførende fjær for vellykket kirurgi, da det gjør installasjonen av fjæren enklere, samtidig som den forhindrer at retensjonsringen faller av og oppnår den tiltenkte kraftapplikasjonen.
Sammenlignet med tidligere modeller gir denne modellen flere fordeler. For det første forhindrer det dannelsen av sirkulære beindefekter i parietalbenet, og opprettholder celleaktiveringsmodus. Videre kan kraften fjernes når som helst ved å demontere fjæren, noe som gjør den egnet til å etablere en gjentakelsesmodell etter stressstrekking. Bekvemmeligheten ved å demontere fjæren sikrer også minimal sekundær skade på forsøksdyrene. Videre kan den mekaniske størrelsen på strekkspenningen enkelt justeres ved å endre fjærkraften. Det er viktig at denne modellen opprettholder det naturlige fysiologiske miljøet rundt kranialsuturen, og sikrer dermed nøyaktigheten av eksperimentelle resultater.
Det er imidlertid noen begrensninger for denne utvidelsesmodellen. For det første er det fare for at retensjonsringen faller av hvis kraften er overdreven. Nybegynnere bør gjennomføre innledende øvelser i vårinstallasjonen for å redusere denne risikoen. For det andre er det en risiko for infeksjon når du åpner hodebunnen og utsetter skallen, så instrumentdesinfeksjon er viktig, og forkortelse av operasjonsvarigheten er gunstig for helbredelse. Over-anestesi kan også føre til musens død.
Når det gjelder den passive PEGASOS-metoden, er den anvendelig for å oppnå åpenhet i individuelle vev og organer, samt hele hodet og kroppen til unge mus. Mens det er effektivt for hele calvarial bein, er det nødvendig med en lengre behandlingstid for større prøver, spesielt for hele beinvev eller bulk lange beinvev med ledd. Det er viktig å merke seg at avkalkning av vev ikke bør utføres når du bruker dobbeltmerkingsprotokollen, da det forstyrrer fargeprosessen. PEGASOS vevsfjerningsmetode er også fleksibel, noe som tillater kombinasjon med forskjellige merkingsmetoder, ikke begrenset til EdU-inkorporering eller kalsiumdobbeltmerking, men også endogen fluorescens i transgene musemodeller eller helmontert fargestoff eller antistofffarging, alle med godt bevart fluorescens.
Med stabile effekter og høy repeterbarhet er denne suturutvidelsesmodellen egnet for forskjellige stammer av transgene mus i forskjellige aldre. Evnen til å justere størrelsen på strekkfasthet og trekke kraft når som helst muliggjør praktisk forskning på tilbakefall etter stressstimulering. Ved å kombinere dobbeltmerkingsmetoden for mineraliserte bein med PEGASOS vevsryddingsteknikk, kan vi observere den tredimensjonale spatiotemporale fordelingen av kraniale suturstamceller under beinremodellering, noe som muliggjør videre utforskning av forholdet mellom SUSC og mekanisk stress, samt dets spesifikke mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker for laboratorieplattformen og assistanse fra Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Dette arbeidet ble støttet av Shanghai Pujiang-programmet (22PJ1409200); National Natural Science Foundation of China (No.11932012); Postdoktor vitenskapelig forskningsstiftelse av Shanghai niende folkesykehus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Grunnleggende forskningsprogram finansiering av niende People's Hospital tilknyttet Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
