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Immunology and Infection

पोर्टेबल पेपर-आधारित इम्यूनोसे डेंगू NS1 एंटीजन के वर्णमिति और मात्रात्मक पहचान के लिए स्मार्टफोन एप्लिकेशन के साथ संयुक्त

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/66130
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 4,5
1Department of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Islam Indonesia, 2School of Bioresources and Technology, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 3Department of Otolaryngology, Phramongkutklao Hospital and College of Medicine, 4Sensor Technology Laboratory, Pilot Plant Development and Training Institute, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 5Biosciences and Systems Biology Research Team, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Sciences and Technology Development Agency at King Mongkut's University of Technology Thonburi

Summary

डेंगू डायग्नोस्टिक की तत्काल जरूरतों को पूरा करते हुए, यहां हम क्लिनिकल सीरम/रक्त के नमूनों में डेंगू एनएस1 एंटीजन सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्मार्टफोन ऐप-एकीकृत डेंगू एनएस1 पेपर-आधारित विश्लेषणात्मक उपकरण (डीईएन-एनएस1-पीएडी) पेश कर रहे हैं। यह नवाचार विभिन्न स्वास्थ्य देखभाल सेटिंग्स, यहां तक कि संसाधन-सीमित लोगों में नैदानिक निर्णय लेने में सहायता करके डेंगू प्रबंधन को बढ़ाता है।

Abstract

डेंगू वायरस (DENV) संक्रमण, जो एडीज मच्छरों द्वारा फैलता है, उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय देशों में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता है। लगभग 10 मिलियन मामलों और 20,000-25,000 मौतों की वार्षिक घटनाओं के साथ, विशेष रूप से बच्चों के बीच, व्यावहारिक नैदानिक उपकरणों की तत्काल आवश्यकता है। प्रारंभिक संक्रमण के दौरान डेंगू गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 1 (एनएस 1) की उपस्थिति को साइटोकिन रिलीज, संवहनी रिसाव और एंडोथेलियल डिसफंक्शन से जोड़ा गया है, जिससे यह गंभीर डेंगू के लिए एक संभावित मार्कर बन गया है।

पेपर-आधारित इम्यूनोएसे जैसे लेटरल फ्लो एसेज़ (एलएफए) और माइक्रोफ्लुइडिक पेपर-आधारित विश्लेषणात्मक उपकरण (पीएडी) ने अपनी सादगी, रैपिडिटी, सस्तीता, विशिष्टता और व्याख्या में आसानी के कारण नैदानिक परीक्षणों के रूप में लोकप्रियता हासिल की है। हालांकि, डेंगू एनएस 1 का पता लगाने के लिए पारंपरिक पेपर-आधारित इम्यूनोएसे आमतौर पर दृश्य निरीक्षण पर भरोसा करते हैं, केवल गुणात्मक परिणाम देते हैं। इस सीमा को संबोधित करने और संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए, हमने पेपर-आधारित विश्लेषणात्मक डिवाइस (पीएडी), अर्थात् डीईएन-एनएस 1-पैड पर एक अत्यधिक पोर्टेबल एनएस 1 डेंगू डिटेक्शन परख का प्रस्ताव दिया, जो एक वर्णमिति और मात्रात्मक पाठक के रूप में एक स्मार्टफोन एप्लिकेशन को एकीकृत करता है। विकास प्रणाली नैदानिक नमूनों में एनएस 1 सांद्रता की प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव सक्षम बनाती है।

रोगियों से प्राप्त सीरम और रक्त के नमूनों का उपयोग सिस्टम प्रोटोटाइप प्रदर्शन को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। परिणाम तुरंत प्राप्त किए गए थे और नैदानिक मूल्यांकन के लिए नियोजित किए जा सकते हैं, दोनों अच्छी तरह से सुसज्जित स्वास्थ्य सुविधाओं और संसाधन-सीमित सेटिंग्स में। स्मार्टफोन एप्लिकेशन के साथ पेपर-आधारित इम्यूनोसे का यह अभिनव संयोजन डेंगू एनएस 1 एंटीजन का पता लगाने और मात्रा का ठहराव बढ़ाने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है। नग्न आंखों की क्षमताओं से परे संवेदनशीलता को बढ़ाकर, यह प्रणाली डेंगू प्रबंधन में नैदानिक निर्णय लेने में सुधार के लिए काफी क्षमता रखती है, विशेष रूप से दूरस्थ या कम सेवा वाले क्षेत्रों में।

Introduction

डेंगू वायरस (DENV) संक्रमण सबसे तेजी से फैलने वाला मच्छर जनित रोगहै 1, और 390 मिलियन से अधिक लोग 96 मिलियन रोगसूचक संक्रमणों से संक्रमित हैं, गंभीर बीमारी के 2 मिलियन मामले हैं, और प्रति वर्ष 25,000 से अधिक मौतें दुनिया मेंहोती हैं 1,2. विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के अनुसार, अनुमानित 3.9 बिलियन लोग डेंगू के लिए जोखिम में हैं; ~ 70% एशिया प्रशांत देशों में रहते हैं और मुख्य रूप से दक्षिण पूर्व एशियामें 3. 2019 में, डब्ल्यूएचओ को रिपोर्ट किए गए डेंगू के मामलों की संख्या 4.2 मिलियन थी, और थाईलैंड नेडेंगू के कम से कम 136,000 मामलों और डेंगू संक्रमण से 144 मौतों के मामलों का योगदान दिया। थाईलैंड में डेंगू का प्रकोप बरसात के मौसम के दौरान, अप्रैल से दिसंबर तक, शहरी और ग्रामीण दोनों क्षेत्रों में, विशेष रूप से पूर्वोत्तर क्षेत्र में होता है।

DENV संक्रमणों में उपनैदानिक लक्षणों, हल्के डेंगू बुखार (DF) से लेकर गंभीर डेंगू रक्तस्रावी बुखार (DHF) तक की अलग-अलग नैदानिक अभिव्यक्तियाँ होती हैं। गंभीर डीएचएफ स्थिति की मुख्य विशेषता सदमे और अंग की शिथिलता के बाद संवहनी पारगम्यता में वृद्धि हुई है1. प्रभावी डेंगू उपचार विकसित करने में संवहनी रिसाव का कारण बनने वाले आणविक मार्ग को समझना बहुत महत्वपूर्ण है। डेंगू गैर संरचनात्मक प्रोटीन 1 (NS1) प्रारंभिक वायरस संक्रमण 5,6 के दौरान एक स्रावित ग्लाइकोप्रोटीन है, और यह वायरल शाही सेना प्रतिकृति7 के लिए एक कोफ़ेक्टर के रूप में कार्य करता है. NS1 साइटोकिन रिलीज को ट्रिगर कर सकता है और टोल-लाइक रिसेप्टर 4 (TLR4) और एंडोथेलियल ग्लाइकोकैलिक्स 8,9 से बंधकर संवहनी रिसाव में योगदान कर सकता है। इन विट्रो अनुसंधान से पता चला है कि एनएस 1 एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ बातचीत करता है और एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है। यह स्थिति एंडोथेलियल डिसफंक्शन और संवहनी रिसाव10 में योगदान कर सकती है। एनएस 1 एंटीजन स्तर, सीरम इंटरल्यूकिन (आईएल) -10 के स्तर के साथ सहसंबद्ध, गंभीर नैदानिक रोग11 के साथ रोगियों में काफी वृद्धि हुई थी। डेंगू NS1 भी आईएल-10 उत्प्रेरण और DENV विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं12,13 को दबाने से रोग रोगजनन के लिए योगदान देता है. इसके अलावा, डेंगू एनएस 1 प्रोटीन गंभीर नैदानिक बीमारी से संबंधित था, और बीमारी के पहले 3 दिनों में एनएस 1 > 600 एनजी एमएल -1 की एकाग्रता डीएचएफ14 के विकास से जुड़ी थी।

डीएचएफ के रोगियों में डेंगू एनएस 1 एंटीजन की दृढ़ता को गंभीर डेंगू6 के मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। नैदानिक नमूनों में NS1 का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं जैसे एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) और रैपिड टेस्ट15। नैदानिक सेटिंग में NS1 प्रोटीन की एकाग्रता को मापने के लिए स्वर्ण मानक एलिसा विधि है। हालांकि, एलिसा विधि महंगी है और कुशल कर्मियों, और प्रयोगशाला सुविधाओं16 की आवश्यकता है. इसलिए, पॉइंट-ऑफ-केयर टेस्ट (POCT) में NS1 प्रोटीन का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रौद्योगिकी का विकास अभी भी जारी है। पिछले दशक में, पार्श्व प्रवाह परख (एलएफए) और माइक्रोफ्लुइडिक पेपर-आधारित विश्लेषणात्मक उपकरणों (μPADs) जैसे पेपर-आधारित इम्यूनोएसे उनकी सादगी, तीव्रता, सस्तीता और विशिष्टता 17,18,19के कारण नैदानिक परीक्षणों के रूप में लोकप्रिय हो गए हैं। एक कागज आधारित immunoassay में, कई लेबल इस तरह के सोने नैनोकणों (AuNPs) 20, चुंबकीय नैनोकणों 21,22, क्वांटम डॉट्स23, और प्रतिदीप्ति सामग्री24,25 के रूप में संकेत, उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. AuNPs उत्पादन की सस्ती लागत, निर्माण में आसानी, स्थिरता और सरल रीडआउट के कारण पेपर-आधारित इम्यूनोएसे में उपयोग किए जाने वाले सबसे आम लेबल हैं। वर्तमान में, डेंगू एनएस 1 के लिए पार्श्व प्रवाह परख (एलएफए) प्रसिद्ध नैदानिक सेटिंग26,27 में उपयोग किया जाता है। हालांकि, पारंपरिक एलएफए लेबल डिटेक्शन आमतौर पर नग्न आंखों का उपयोग करता है और केवल गुणात्मक परिणाम प्रदान करता है।

पिछले दशक में, वैश्विक स्तर पर 5 बिलियन से अधिक स्मार्टफोन का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, और पोर्टेबल डिटेक्शन28,29 विकसित करने की क्षमता है। स्मार्टफ़ोन में अंतर्निहित भौतिक सेंसर, मल्टी-कोर प्रोसेसर, डिजिटल कैमरा, यूएसबी पोर्ट, ऑडियो पोर्ट, वायरलेस और एप्लिकेशन सॉफ़्टवेयर जैसी बहु-कार्यात्मक क्षमताएं होती हैं, जो उन्हें विभिन्न बायोसेंसरप्लेटफार्मों में उपयोग के लिए उपयुक्त बनाती हैं। इसके अलावा, वायरलेस प्रौद्योगिकियां डेटा को जल्दी से भेजने की अनुमति देती हैं और इसका उपयोग वास्तविक समय और ऑन-साइट निगरानीके लिए किया जा सकता है। मुदन्याली एट अल ने मलेरिया, तपेदिक और एचआईवी32 के लिए एक पोर्टेबल, उपकरण-मुक्त, तेजी से, कम लागत वाले और उपयोगकर्ता के अनुकूल पीओसीटी प्लेटफॉर्म विकसित करने के लिए पेपर-आधारित इम्यूनोसे और स्मार्टफोन को जोड़ा। लिंग एट अल मात्रात्मक33 दूध में क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि का पता लगाने के लिए एक स्मार्टफोन कैमरा के साथ संयुक्त एक पार्श्व प्रवाह परख की सूचना दी. होउ एट अल भी पार्श्व प्रवाह परख34 में रंग या प्रतिदीप्ति से मात्रात्मक संकेतों के लिए एक स्मार्टफोन आधारित, दोहरी साधन इमेजिंग प्रणाली विकसित. इसके अलावा, स्मार्टफोन को वर्णमिति और मात्रात्मक पाठक के रूप में उपयोग करने से संवेदनशीलता में सुधार हो सकता है, जबकि नग्न आंखें आत्मविश्वास से लक्ष्य35 की उपस्थिति की रिपोर्ट नहीं कर सकती हैं।

डेंगू डायग्नोस्टिक्स में एक सफलता पेश करते हुए, डीईएन-एनएस 1-पैड 36,37,38 (अब से डिवाइस के रूप में संदर्भित) एक पोर्टेबल और कुशल समाधान प्रदान करता है। मोम-मुद्रित माइक्रोफ्लुइडिक पेपर-आधारित तकनीक का उपयोग करते हुए, यह उपकरण छवि प्रसंस्करण के माध्यम से उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ एनएस 1 को निर्धारित करता है। इसकी उपयोगिता को और बढ़ाने के लिए, हमने वर्णमिति और मात्रात्मक पढ़ने के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल स्मार्टफोन ऐप विकसित किया है। थाई अस्पतालों से रोगी के नमूनों का उपयोग करके नैदानिक सत्यापन वास्तविक समय रोगी मूल्यांकन पर इसके तत्काल प्रभाव को रेखांकित करता है। हमारा नवाचार सुव्यवस्थित, पॉइंट-ऑफ-केयर-डेंगू प्रबंधन में एक महत्वपूर्ण प्रगति को चिह्नित करता है, जो संसाधन-सीमित स्वास्थ्य देखभाल परिदृश्यों में निदान में क्रांति लाने का वादा करता है।

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Protocol

संस्थागत समीक्षा बोर्ड की आचार समिति, रॉयल थाई सेना चिकित्सा विभाग, फ्रामोंगकुटक्लाओ अस्पताल, बैंकॉक, थाईलैंड (आईआरबीआरटीए 1218/2562) ने अनुमोदन प्रदान किया। इस अध्ययन को करने में, हमने सभी आवश्यक नैतिक नियमों का अनुपालन किया।

1. कागज आधारित Immunoassay के उपकरण निर्माण

नोट: कागज आधारित immunoassay डिवाइस पहले से स्थापित तरीकों 36,37, और थाई पेटेंट अनुरोधसंख्या 19010081638 के बाद गढ़ा गया था.

  1. डिजाइन और पैटर्न ड्राइंग: कंप्यूटर पर 18 पैड मोम पैटर्न के साथ पेपर विश्लेषणात्मक उपकरण(चित्रा 1ए, बी)को डिजाइन करें।
    नोट: डिजाइन विशिष्ट है और A5-आकार के कागज के लिए अभिप्रेत है। पीएडी की संख्या कागज के आकार से संबंधित है, जैसा कि उपयोगकर्ता की आवश्यकता होती है।
  2. एक मोम प्रिंटर (सामग्री की तालिका) का उपयोग सेलूलोज़ कागज पर डिजाइन पैटर्न प्रिंट.
  3. 150 डिग्री सेल्सियस पर 75 एस के लिए एक प्रयोगशाला ओवन में मोम मुद्रित कागज पिघला. इसके बाद, इसे सिलिका बॉक्स में स्टोर करें जब तक कि बाद के चरणों के लिए आवश्यक न हो।
  4. परीक्षण और नियंत्रण दोनों क्षेत्रों में 0.025% पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) के 0.5 माइक्रोन लागू करें। सिलिका बॉक्स में 2 मिन के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट करें और फिर 5 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में गरम करें।
  5. नियंत्रण क्षेत्र पर बकरी विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी के 1 माइक्रोग्राम μL-1 के 0.5 माइक्रोन और परीक्षण क्षेत्र में कैप्चर एंटीबॉडी के 1 माइक्रोग्राम μL-1 के 0.5 माइक्रोन लागू करें। बूंदों को 30 मिनट के लिए आरटी पर सिलिका जेल बॉक्स में सूखने दें।
  6. नमूना क्षेत्र में अवरुद्ध बफर के 2 माइक्रोन, संयुग्म क्षेत्र में 3 माइक्रोन और पता लगाने वाले क्षेत्र में 2 माइक्रोन लागू करें। बूंदों को 30 मिनट के लिए सिलिका जेल बॉक्स में आरटी पर सूखने दें।
  7. संयुग्म क्षेत्र में सोने के नैनोकण-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स (एयूएनपीएस-एबी) समाधान के 2 माइक्रोन लागू करें और इसे 30 मिनट के लिए आरटी पर सिलिका जेल बॉक्स में सूखने दें।

2. कागज आधारित Immunoassay की विधानसभा

  1. चिपकने वाला बेनकाब करने के लिए चिपकने वाला प्लास्टिक बैकिंग कार्ड के रिवर्स साइड पर सुरक्षात्मक फिल्म को सावधानी से हटा दें।
  2. चिपकने वाला प्लास्टिक बैकिंग कार्ड के साथ इलाज सेलूलोज़ पेपर को संरेखित करें और दो परतों को एक साथ मजबूती से दबाएं।
    नोट: डिवाइस को संदूषण या क्षति के जोखिम को कम करने के लिए हाइड्रोफिलिक क्षेत्र को छूने से बचें।
  3. कागज को कोट करने के लिए एक प्लास्टिक की फिल्म लागू करें और उन्हें एक साथ दबाएं।
  4. पूरी तरह से इकट्ठे उपकरणों की चादरों से कैंची का उपयोग करके उपकरणों के वांछित टुकड़े को काटें।
  5. डेन-एनएस 1-पीएडी (चित्रा 1 सी) अब उपयोग के लिए तैयार हैं। दीर्घकालिक स्थिरता के लिए, उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. एयूएनपी-एबी संयुग्म की तैयारी

नोट: AuNPs-Ab Prabowo एट अल.36द्वारा पहले वर्णित के रूप में तैयार किया गया था.

  1. पीबीएस में 1 मिलीग्राम एमएल-1 एंटी-एनएस 1 एंटीबॉडी के 10 माइक्रोन, 40 एनएम एयूएनपी कोलाइड के 1 एमएल, और 0.1 एम बोरेट बफर (पीएच 8.5) के 0.1 एमएल को मिलाएं।
  2. मिश्रण को 60 मिनट के लिए 50 आरपीएम पर घुमाएं और आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  3. बीबीएस में 10 मिलीग्राम एमएल-1 बीएसए के 0.1 एमएल लागू करें, 50 आरपीएम पर घुमाएं, और 15 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  4. 30 मिनट के लिए 20,187 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान अपकेंद्रित्र।
  5. ध्यान से विंदुक और सतह पर तैरनेवाला अवक्षेपित AuNPs-एबी से अलग.
  6. बीबीएस के 500 माइक्रोन में एयूएनपीएस-एबी को फिर से निलंबित करें और सोनिकेशन का उपयोग करके इसे फैलाएं।
  7. 30 मिनट के लिए 20,187 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं।
    नोट: फैलाव और सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रियाओं को 3x दोहराएं।
  8. निलंबन के लिए संयुग्म बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें, जिससे यह संयुग्म क्षेत्र पर आवेदन के लिए तैयार हो जाता है।

4. मोबाइल एप्लिकेशन विकास

  1. इमेज प्रोसेसिंग और मशीन लर्निंग डेवलपमेंट
    1. DEN-NS900-PADs की 1 से अधिक ऑटो-फ़ोकसिंग छवियों को एकत्रित करके, विभिन्न सांद्रताओं, कैमरा ब्रांड (12-13 मेगापिक्सेल), रोटेशन (90° और 180°), और प्रकाश व्यवस्था सेटिंग्स जैसी विभिन्न स्थितियों को कैप्चर करके पर्यवेक्षित छवि मॉडल के लिए डेटासेट इकट्ठा करें। प्रत्येक विशिष्ट हालत के तहत 30 छवियों के लिए निशाना लगाओ.
    2. पर्यवेक्षित सीखने के लिए एकत्रित छवियों के भीतर परीक्षण और नियंत्रण क्षेत्रों के रूप में ब्याज के दो क्षेत्रों की पहचान और एनोटेट करके जमीनी सच्चाई को लेबल करें।
    3. पृष्ठभूमि पट्टी की पहचान करने के लिए एक एल्गोरिथ्म डिज़ाइन करें। परीक्षण और नियंत्रण क्षेत्रों के बीच केंद्र रेखा का पता लगाएँ, इसके मध्य बिंदु की गणना करें, और समान घूर्णी अभिविन्यास बनाए रखते हुए दो मुख्य क्षेत्रों के औसत आकार के अनुपात में एक वर्ग क्षेत्र स्थापित करें।
    4. ब्याज के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक छवि विभाजन मॉडल को प्रशिक्षित करने के लिए चरण 4.1.1 और 4.1.2 से डेटासेट और जमीनी सच्चाई लेबल का उपयोग करके एक छवि विभाजन मॉडल बनाएं।
  2. अनुप्रयोग एल्गोरिथ्म
    1. स्वचालित रूप से परीक्षण, नियंत्रण और पृष्ठभूमि क्षेत्रों का पता लगाने के लिए नई छवियों के लिए प्रशिक्षित छवि विभाजन मॉडल लागू करें।
    2. ब्याज के तीन क्षेत्रों (परीक्षण, नियंत्रण और पृष्ठभूमि) में से प्रत्येक के लिए एक एकल तीव्रता मूल्य प्राप्त करने के लिए बुनियादी छवि प्रसंस्करण तकनीकों का उपयोग करें।
    3. पिक्सेल मानों तक पहुँचने के लिए छवि को 3D सरणी प्रतिनिधित्व (y, x चैनल) में रूपांतरित करें।
    4. आरजीबी मूल्यों के औसत से छवि को ग्रेस्केल में बदलें और सूत्र (255-x) के साथ उलटा लागू करें।
    5. पृष्ठभूमि क्षेत्र मान घटाकर परीक्षण और नियंत्रण क्षेत्र के मूल्यों को सामान्य करें।
    6. NS1 की एकाग्रता की गणना करने के लिए पूर्वस्थापित अंशांकन वक्र का उपयोग करें।
    7. सामान्यीकृत ग्रेस्केल तीव्रता37 से प्राप्त 0.1103 के कट-ऑफ मान के आधार पर परिणामों को सकारात्मक या नकारात्मक के रूप में वर्गीकृत करें।

5. अंशांकन वक्र और संवेदनशीलता

  1. 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, और 1.0 माइक्रोग्राम एमएल-1 की सांद्रता के साथ अंशांकन के लिए मानव सीरम में एनएस 1 नमूना तैयार करें।
  2. नमूना क्षेत्र पर प्रत्येक एकाग्रता के 50 माइक्रोन ड्रॉप करें और तीन प्रतियों में माप करें।
  3. नमूने डिवाइस में पूरी तरह से बाती करने के लिए जो परिणाम प्राप्त करने के लिए 20-30 मिनट लग सकते हैं की अनुमति दें.
  4. इनक्यूबेशन के 5 मिनट के बाद एक डिजिटल कैमरा या स्मार्टफोन का उपयोग कर डिवाइस की छवियों पर कब्जा.
  5. ImageJ और एक कस्टम मोबाइल एप्लिकेशन का उपयोग करके परीक्षण और नियंत्रण क्षेत्रों का विश्लेषण करें।
  6. ImageJ और मोबाइल एप्लिकेशन के डेटा के आधार पर अंशांकन वक्र का निर्माण करें।
  7. नीचे दिए गए समीकरणों (1-3) का उपयोग करके रिक्त (LOB), पता लगाने की सीमा (LOD), और परिमाणीकरण की सीमा (LOQ) की गणना करें:
    LOB = रिक्त डेटा का माध्य + 1:645* ð (रिक्त डेटा का मानक विचलन) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (न्यूनतम सांद्रता डेटा का मानक विचलन) (2)
    LOQ = रिक्त डेटा का माध्य + 10*ð (रिक्त डेटा का मानक विचलन) (3)

6. नैदानिक नमूनों के साथ एक कागज आधारित Immunoassay प्रदर्शन

  1. अच्छी नैदानिक प्रथाओं के बाद, बैंगनी शीर्ष EDTA ट्यूबों में अस्पताल में भर्ती होने के पहले दिन 30 रोगियों से परिधीय रक्त के 300 μL को इकट्ठा और संसाधित करें।
  2. 20 मिनट के लिए 2,884 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर रक्त अपकेंद्रित्र.
  3. एक विंदुक का उपयोग कर एक साफ polypropylene ट्यूब में तरल घटक (प्लाज्मा) स्थानांतरण.
  4. बाद के विश्लेषण के लिए प्लाज्मा को तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में स्टोर करें।
  5. डिवाइस के शीर्ष पर नमूना क्षेत्र में प्लाज्मा के 20 माइक्रोन लागू करें। फिर, वॉश बफर के 30 माइक्रोन (0.05% वी/वी ट्विन 20 इन 1x फॉस्फेट बफर सलाइन) जोड़ें।
  6. नमूना पूरी तरह से डिवाइस में wick करने के लिए अनुमति दें, जो परिणाम प्राप्त करने के लिए 20-30 मिनट लग सकते हैं.
  7. कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन के 5 मिनट के बाद एक डिजिटल कैमरा या स्मार्टफोन का उपयोग कर डिवाइस की छवियों पर कब्जा.
  8. ImageJ और एक कस्टम मोबाइल एप्लिकेशन का उपयोग करके परीक्षण और नियंत्रण क्षेत्रों का विश्लेषण करें।

7. मोबाइल एप्लिकेशन के साथ परिमाणीकरण

नोट: कागज आधारित immunoassay की तीव्रता मोबाइल आवेदन (चित्रा 2) में विश्लेषण किया है.

  1. स्मार्टफोन पर विकसित मोबाइल एप्लिकेशन खोलें।
  2. डेटा स्रोत चुनने या अपलोड करने के लिए कैमरा का उपयोग करें या गैलरी से अपलोड करें का चयन करें. कैमरा कैप्चरिंग के माध्यम से या डिवाइस की गैलरी से एक छवि का चयन करके ऐसा करें।
  3. विश्लेषणात्मक अनुभाग पर नेविगेट करें और स्क्रीन पर विश्लेषण बटन स्पर्श करें।
  4. डेटा का विश्लेषण करने और परिणाम प्रदर्शित करने के लिए आवेदन की प्रतीक्षा करें।

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Representative Results

कागज-आधारित इम्यूनोसे उपकरणों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परख प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए एक निर्माण विधि का चयन करना महत्वपूर्ण है। हमारे अध्ययन में, हमने पेपर-आधारित इम्यूनोसे के प्रदर्शन के संदर्भ में विभिन्न विनिर्माण प्रक्रियाओं और सामग्रियों का पता लगाया। हमारी चुनी हुई विधि कागज-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के भीतर हाइड्रोफोबिक बाधाओं को बनाने के लिए एक मोम प्रिंटिंग सिस्टम का उपयोग करती है। यह दृष्टिकोण अपनी सादगी, गति और लगातार परिणामों के कारण अलग है। ध्यान दें, यह फोटोरेसिस्ट रसायनों के उपयोग से बचने का लाभ प्रदान करता है, जिसमें प्रोटीन सोखना में हस्तक्षेप करने और सेलूलोज़ पेपर की हाइड्रोफोबिसिटी को बढ़ाने की क्षमता होती है। इसके अलावा, मोम मुद्रण द्रव चैनलों के लगातार आयाम सुनिश्चित करता है, दोहराने योग्य परख प्रदर्शन में योगदान देता है।

हाइड्रोफोबिक बाधाओं के गठन के बाद, इम्यूनोसे के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को सेलूलोज़ पेपर सतह पर लागू किया गया था। इलेक्ट्रोस्टैटिक सोखना के साथ, पीएलएल ने अमाइन कार्यात्मक समूहों के सकारात्मक चार्ज और नकारात्मक चार्ज एंटीबॉडी दोनों के साथ बातचीत करके बायोमोलेक्यूल स्थिरीकरण में सहायता की। यह कदम एंटीबॉडी के संशोधन और स्थिरीकरण और निर्माण प्रक्रियाओं के दौरान लेबल-एंटीबॉडी संयुग्मों के आवेदन की सुविधा प्रदान करता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह कदम समानांतर में आयोजित किया जा सकता है। पेपर इम्यूनोसे उपकरणों (डीईएन-एनएस 1-पीएडी, जैसा कि चित्रा 1 ए में दिखाया गया है) की असेंबली संशोधित पेपर को चिपकने वाले प्लास्टिक बैकिंग कार्ड पर ढेर करके और प्लास्टिक की फिल्म के साथ टुकड़े टुकड़े करके पूरा किया जाता है।

इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य एनएस 1 सांद्रता को मापने के लिए स्मार्टफोन का उपयोग करने वाली उपयोगकर्ता के अनुकूल विधि विकसित करना है। इस दृष्टिकोण का उपयोग घर और नैदानिक सेटिंग्स दोनों में पॉइंट-ऑफ-केयर टेस्टिंग (POCT) डिवाइस के रूप में किया जा सकता है। रोगी सीरम में एनएस 1 सांद्रता की विस्तृत श्रृंखला को देखते हुए, इन प्रयोगों के परिणामों के आधार पर सरल रैखिक मॉडल नियोजित किए गए थे। प्रत्येक NS1 एकाग्रता के लिए, तीन परीक्षण उपकरणों वाला एक डेटासेट तैयार किया गया था। उपकरणों की तस्वीरें मानक सेटिंग्स और इष्टतम प्रकाश व्यवस्था की स्थिति के तहत स्मार्टफोन का उपयोग करके कैप्चर की गईं, जिससे एक अंधेरे बॉक्स की आवश्यकता समाप्त हो गई। पीएडी के परीक्षण क्षेत्र में माउस डेंगू एनएस 1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी होता है, जबकि नियंत्रण क्षेत्र में बकरी विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी होता है। सैंडविच परख प्रारूप के साथ, नमूनों में उच्च एनएस 1 सांद्रता परीक्षण क्षेत्र में लाल रंग की तीव्रता में वृद्धि के अनुरूप है। इसके विपरीत, नियंत्रण क्षेत्र में रंग की तीव्रता अपेक्षाकृत स्थिर रहती है। चित्रा 1 बी असंसाधित स्मार्टफोन छवियों को दिखाता है, जो विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना एक लाभप्रद दृश्य अवलोकन प्रदान करते हैं।

एक समर्पित मोबाइल एप्लिकेशन का उपयोग करके, हमने तीव्रता को सामान्यीकृत किया और सीरम नमूनों में नुकीले NS1 सांद्रता के लिए सरल रैखिक मॉडल की गणना की- मोबाइल एप्लिकेशन से प्राप्त गुणांक सहसंबंध (आर2)। मोबाइल एप्लिकेशन से प्राप्त गुणांक सहसंबंध (आर2) 0.92 (चित्रा 3) था, जो अपेक्षाओं के साथ संरेखित था। इस स्मार्टफोन-आधारित दृष्टिकोण ने नग्न आंखों के अवलोकन से बेहतर प्रदर्शन किया, संवेदनशीलता में 178% की वृद्धि की। इसके अतिरिक्त, रिक्त (एलओबी) की सीमा, पता लगाने की सीमा (एलओडी), और मात्रा का ठहराव की सीमा (एलओक्यू) की गणना सामान्यीकृत तीव्रता के लिए की गई थी, जैसा कि तालिका 1में प्रस्तुत किया गया है।

नैदानिक सेटिंग्स में DEN-NS1-PADs की व्यावहारिक कार्यक्षमता प्रदर्शित करने के लिए वास्तविक दुनिया के नैदानिक नमूनों का उपयोग किया गया था। कागज आधारित immunoassay नकारात्मक या सकारात्मक परिणामों के दृश्य निर्धारण की अनुमति देता है, 20-30 मिनट के भीतर गुणात्मक रंग readouts का उत्पादन किया. डेंगू के संदिग्ध रोगियों के सीरम नमूने डिवाइस के अधीन थे। चित्रा 4 डिवाइस और एक वाणिज्यिक रैपिड डायग्नोस्टिक टेस्ट (आरडीटी) दोनों से प्राप्त परिणामों को दिखाता है और तुलना करता है। तालिका 2 दृश्य रीडिंग और स्मार्टफोन आधारित प्रणाली के परिणामों को सारांशित करता है। वाणिज्यिक आरडीटी और डिवाइस ने दृश्य पढ़ने से सात सकारात्मक और 23 नकारात्मक परिणामों के साथ समान परिणाम प्राप्त किए। इसके विपरीत, स्मार्टफोन आधारित रीडर सिस्टम ने विशेष रूप से डिवाइस पर लागू नैदानिक नमूनों से नौ सकारात्मक और 21 नकारात्मक परिणामों की सूचना दी।

Figure 1
चित्रा 1: डिजाइन और गढ़े डीईएन-एनएस 1-पैड की छवियां। (ए, बी) मोम-पैटर्न वाले हाइड्रोफोबिक बाधा से एक एकल चैनल को निर्दिष्ट क्षेत्र में नमूना समाधान पेश करने और क्रमशः (डी) नकारात्मक और (ई) सकारात्मक परिणाम दिखाने के बाद तीन राज्यों (सी) और (डी, ई) में चित्रित किया गया है। नमूना समाधान चैनल के माध्यम से विक्स (तीर लेबल देखें), प्रमुख स्थानों पर घटकों के साथ बातचीत-संयुग्म क्षेत्र में AuNPs-Ab, परीक्षण क्षेत्र में विरोधी NS1 एंटीबॉडी (एक सकारात्मक डेंगू NS1 परिणाम का संकेत), और नियंत्रण क्षेत्र में विरोधी माउस IgG. परिणाम नग्न आंखों द्वारा आसानी से देखे जा सकते हैं और फ्लैटबेड स्कैनर या स्मार्टफोन कैमरा का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण द्वारा मात्रा निर्धारित की जा सकती है। संक्षिप्तीकरण: AuNPs-Ab = सोने के नैनोकणों-एंटीबॉडी संयुग्म। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: मोबाइल ऐप से फोन की स्क्रीन का स्क्रीनशॉट। (ए) मोबाइल फोन डिवाइस पर चल रहे एंड्रॉइड एप्लिकेशन की उपयोगकर्ता स्क्रीन, (बी) एप्लिकेशन स्क्रीन का प्रदर्शन, (सी) एप्लिकेशन का मुख्य मेनू जिसे उपयोगकर्ता कैमरा का उपयोग करने या गैलरी से छवि अपलोड करने के लिए चुन सकते हैं, (डी) परीक्षण के लिए संबंधित छवि का प्रदर्शन, (ई) विश्लेषण करने के लिए उलटी गिनती समय का प्रदर्शन, (एफ) परीक्षण और नियंत्रण क्षेत्र की तीव्रता, संक्रमण का निर्णय (सकारात्मक/नकारात्मक), और नमूने में एनएस 1 की एकाग्रता सहित परीक्षण के परिणामों का प्रदर्शन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सीरम में एनएस 1 का पता लगाने के लिए रैखिक अंशांकन वक्र। डिवाइस का उपयोग किया गया था और स्मार्टफोन डेटा के आधार पर एक एप्लिकेशन के माध्यम से प्रसंस्करण द्वारा छवियों की व्याख्या की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ ±1 मानक विचलन, n = 3 दिखाती हैं। संक्षिप्ताक्षर: टी = परीक्षण क्षेत्र; C = नियंत्रण क्षेत्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नैदानिक नमूना परख से डेन-एनएस 1-पैड की छवि। सीरम (50 μL) का उपयोग पेपर-आधारित इम्यूनोसे में किया गया था। (ए) नकारात्मक परिणाम उदाहरण, (बी) सकारात्मक परिणाम, (सी) समग्र परिणाम और आरडीटी बनाम पेपर-आधारित इम्यूनोसे की तुलना। संक्षिप्ताक्षर: आरडीटी = रैपिड डायग्नोस्टिक टेस्ट; Pos = सकारात्मक; नेग = ऋणात्मक। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राचल नंगी आँखें मोबाइल एप्लिकेशन
रिक्त की सीमा (LoB) - 43.15 एनजी एमएल -1
पता लगाने की सीमा (एलओडी) 200 एनजी एमएल -1 112.19 एनजी एमएल -1
परिमाणीकरण की सीमा (LoQ) - 373.58 एनजी एमएल -1

तालिका 1: ImageJ से LoB, LoD, और LoQ और सीरम में डेटा अंशांकन मानक NS1 पर मोबाइल एप्लिकेशन। संक्षिप्ताक्षर: LoB = रिक्त की सीमा; LoD = पता लगाने की सीमा; LoQ = परिमाणीकरण की सीमा।

रोगी क्र. नंगी आँखें स्मार्टफोन ऐप इमेजजे
आरडीटी कागज आधारित इम्यूनोसे
1 - - - -
2 - - - -
3 - - - -
4 - - - -
5 - - - -
6 - - - -
7 - - - -
8 - - - -
9 + + + +
10 - - + +
11 - - - -
12 + + + +
13 - - - -
14 - - - -
15 - - - -
16 + + + +
17 + + + +
18 - - - -
19 - - - -
20 - - - -
21 + + + +
22 + + + +
23 - - - -
24 + + + +
25 - - - -
26 - - - -
27 - - - -
28 - - - -
29 - - - -
30 - - + +

तालिका 2: सीरम नमूनों के लिए दृश्य पढ़ने और स्मार्टफोन आधारित रीडर सिस्टम परिणामों की तुलना। (+) और (-) क्रमशः परिणामों की सकारात्मक और नकारात्मक व्याख्या दर्शाते हैं।

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Discussion

स्मार्टफोन-आधारित रीडर सिस्टम के लिए महत्वपूर्ण डिजाइन मापदंडों में से एक नमूनों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इमेजिंग प्रसंस्करण प्रदान करने की क्षमता है। इस अध्ययन में, सादगी और सुविधा के लिए, इमेजिंग बॉक्स या एक्सेसरीज़ का उपयोग किए बिना 12-13 एमपी कैमरों के साथ तीन अलग-अलग स्मार्टफोन ब्रांडों से छवियों को कैप्चर किया गया था। छवि कैप्चरिंग की परिवर्तनशील स्थितियां, जैसे कैमरे का रिज़ॉल्यूशन, छवि कैप्चर करने का समय, प्रकाश की स्थिति और वातावरण, परीक्षण की रंग तीव्रता को प्रभावित कर सकते हैं और डिवाइस पर स्पॉट को नियंत्रित कर सकते हैं। उपकरणों की सिग्नल तीव्रता पर प्रकाश और पैड के सुखाने पर विभिन्न छवि कैप्चर समय के प्रभाव को सामान्यीकृत सिग्नल तीव्रता का उपयोग करके कम से कम किया गया था, जो विभिन्न समय36 पर कैप्चर की गई छवियों में लगातार बना रहा। पृष्ठभूमि संकेत घटाव रंग तीव्रता माप की सटीकता को बढ़ाने के लिए एक रणनीति के रूप में उभरा, प्रभावी रूप से प्रकाश की स्थिति के प्रभाव को कम करना। हमारी खोज पर्यावरणीय प्रभाव39,40 को कम करने में आधारभूत या पृष्ठभूमि घटाव तकनीकों की प्रभावकारिता को उजागर पिछले शोध के साथ संरेखित करती है।

एक इमेजिंग बॉक्स या एक सहायक मुक्त विधि का उपयोग कर की श्रेष्ठता के आसपास चल रही बहस छवि प्रसंस्करण39,41 के लिए निहितार्थ है. एक इमेजिंग बॉक्स इमेजिंग शर्तों 41,42,43 में बदलाव को कम करके इमेजिंग प्रसंस्करण परिणामों की मजबूती को बढ़ा सकते हैं. इस अध्ययन में, हमने इमेज प्रोसेसिंग के लिए क्लाउड मशीन लर्निंग पर आधारित एक मोबाइल एप्लिकेशन का उपयोग किया। यह दृष्टिकोण क्लाउड-आधारित प्लेटफ़ॉर्म के भीतर मशीन लर्निंग का लाभ उठाता है ताकि छवि डेटा को स्वचालित रूप से वर्गीकृत किया जा सके, निकाला जा सके और समृद्ध किया जा सके। एप्लिकेशन ने छवियों के भीतर रुचि के क्षेत्र को प्रभावी ढंग से पहचाना और संसाधित किया, जिसमें पृष्ठभूमि, परीक्षण और नियंत्रण क्षेत्र शामिल थे। यह कदम इन क्षेत्रों38 के बीच अंतर करने में महत्वपूर्ण था। पूर्व शोध से पता चलता है कि मशीन सीखने से जुड़े छवि प्रसंस्करण नियंत्रण और परीक्षण नमूने43,44,45 के लिए परिणामों के बीच बेहतर वर्गीकरण पैदावार. इस अध्ययन में, निश्चित स्थान और पृष्ठभूमि घटाव को नियोजित सेलूलोज़ μPADs से एक सुसंगत पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न, स्थिरता और वर्गीकरण सटीकता मोबाइल आवेदन40,43 द्वारा प्रदान की रीडिंग की सटीकता को बढ़ाने.

पेपर-आधारित इम्यूनोसे के प्रदर्शन में लगातार प्रदर्शन के संबंध में, निर्माण विधि एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। पिछले अध्ययन36 में, डीईएन-एनएस 1-पैड के डिजाइन और निर्माण विधि के लिए कई अनुकूलन शर्तों, जैसे पीएलएल की सांद्रता, अवरुद्ध पदार्थ और एनएस 1 एंटीबॉडी का अध्ययन किया गया था। डिवाइस ने गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से बफर, सेल कल्चर और मानव सीरम में एनएस 1 का सफलतापूर्वक परीक्षण किया।

सीरम घटकों से उपजी मैट्रिक्स प्रभाव सीरम नमूनों का परीक्षण करते समय डिवाइस की पहचान सीमा में हस्तक्षेप कर सकते हैं। हालांकि, परिणाम बताते हैं कि विकसित इम्यूनोसे सीरम नमूनों में एनएस 1 सांद्रता का सफलतापूर्वक पता लगा सकता है, जो वाणिज्यिक आरडीटी(तालिका 2)के बराबर परिणाम उत्पन्न करता है। दृश्य निरीक्षण और मोबाइल एप्लिकेशन (चित्रा 4) का उपयोग करके स्पष्ट परिणाम देखे गए, सीरम परीक्षण के लिए परख की प्रभावशीलता को रेखांकित किया गया। जबकि सीरम की उच्च चिपचिपाहट विश्लेषण समय को प्रभावित कर सकती है, यह परिणाम व्याख्या36 में बाधा नहीं डालती है। एक मोबाइल आवेदन का उपयोग नमूना परख के लिए और अधिक सकारात्मक परिणाम प्रदान कर सकते हैं क्योंकि एक मोबाइल आवेदन का उपयोग काफी नमूना परीक्षण46 की संवेदनशीलता में सुधार. यह ध्यान देने योग्य है कि डेंगू एनएस 1 के लिए आरटी-पीसीआर 15,47,48 जैसे आणविक परख के साथ आगे की तुलना संभावित गलत-सकारात्मक या गलत-नकारात्मक परिणामों को निर्धारित करने के लिए आवश्यक है।

इस अध्ययन की एक उल्लेखनीय सीमा रक्त जैसे अधिक जटिल नमूना मैट्रिक्स पर विचार करते समय उत्पन्न होती है। रक्त में मौजूद घटक वास्तव में डिवाइस की पहचान सीमा में हस्तक्षेप कर सकते हैं। ऐसे मामलों में, बफर अवशोषण चलाने को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त शोषक पैड को नियोजित करना एक संभावित समाधान का प्रतिनिधित्व करता है। यह संशोधन रक्त जमावट में सहायता कर सकता है, रक्त प्लेटलेट्स49 को प्रभावित करके सेलूलोज़ के हेमोस्टाइप्टिक गुणों का लाभ उठा सकता है। एक अन्य दृष्टिकोण में रक्त जमावट को बढ़ाने के लिए नमूना पैड पर 4% (डब्ल्यू / पिछले शोध से पता चला है कि कैल्शियम क्लोराइड और सोडियम क्लोराइड जैसे लवण लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) जमावट50,51 प्रेरित करते हैं। Na+ RBC सतह पर विद्युत दोहरी परत को दबाकर और RBC के बीच आवेश प्रतिकर्षण को कम करके रक्त में RBC के निलंबन को अस्थिर कर सकता है। इसके अलावा, नमक की एक उच्च सांद्रता भी रक्त एकत्रीकरण52 लाती है. इसके अलावा, Na+ का काउंटर आयन वैलेंसी चार्ज RBC की चार्ज की चार्ज डबल लेयर की मोटाई को दबा देता है, जिससे डिफ्लेटेड RBC का एकत्रीकरण होता है। 4% (डब्ल्यू / वी) खारा समाधान (एनएसीएल) के अलावा सेलूलोज़ पेपर51 पर प्लाज्मा पृथक्करण की सुविधा देता है। हालांकि, खारा एकाग्रता का सावधानीपूर्वक अनुकूलन रक्त एकत्रीकरण औरसोने नैनोपार्टिकल एकत्रीकरण 53,54 पर अवांछनीय प्रभाव उत्प्रेरण से बचने के लिए आवश्यक है।

वाणिज्यिक मोम प्रिंटर ने प्रोटोटाइप की लागत और सादगी का एक आदर्श संयोजन प्रदान किया। चूंकि इन प्रिंटरों को 2016 में बंद कर दिया गया था, इसलिए वैकल्पिक निर्माण विधियों की आवश्यकता थी जैसे कि इंकजेट प्रिंटिंग55, स्क्रीन प्रिंटिंग56 और फोटोलिथोग्राफी57। एक कार्यालय टोनर प्रिंटर μPAD के निर्माण के लिए एक अच्छा उम्मीदवार है। टोनर में पॉलिएस्टर राल विभिन्न डिजाइनों58 के साथ 60 मिनट के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोफोबिक पैटर्न बनाता है।

एंटीबॉडी एनएस 1 सीरोटाइप दो, जैसा कि कंपनी द्वारा निर्दिष्ट किया गया है, का उपयोग इस शोध में किया गया था। हालांकि, हमने पाया कि यह एंटीबॉडी सभी सीरोटाइप36,37 के साथ भी बातचीत करती है। अन्य सीरोटाइप की तुलना में DENV-4 का पता लगाने की संवेदनशीलता कम (87.5%) है। DENV-1 और DENV-2 की संवेदनशीलता लगभग 88.89% है, और DENV-3 के लिए 100%37 है। ये निष्कर्ष पहले के शोध के साथ संरेखित होते हैं, जिसने अन्य सीरोटाइप59 की तुलना में आरडीटी की डीईएनवी -4 की कम संवेदनशीलता की भी सूचना दी। डिवाइस की समग्र संवेदनशीलता ~ 88.89% है, जिसकी विशिष्टता लगभग 86.67% है। यह उल्लेखनीय है कि DEN-NS1-PAD की वास्तविक संवेदनशीलता वाणिज्यिक RDT से अधिक हो सकती है। हालांकि, आरडीटी 84.62% के सकारात्मक भविष्य कहनेवाला मूल्य (पीपीवी) और 87.67% की सटीकता प्रदर्शित करता है। विशेष रूप से, डीईएन-एनएस 1-पीएडी ने पहले 5-6 दिनों में डेंगू संक्रमण का पता लगाने में बेहतर प्रदर्शन किया, जबकि आरडीटी केवल पहले5 दिनों में प्रभावी है।

सारांश में, एक स्मार्टफोन एप्लिकेशन के साथ एक पोर्टेबल पेपर-आधारित इम्यूनोसे (DEN-NS1-PAD) का संयोजन डेंगू NS1 माप के लिए बहुत अच्छा वादा करता है। मोबाइल एप्लिकेशन नग्न आंखों के साथ अवलोकन की तुलना में सीरम नमूनों में एनएस 1 की मात्रा निर्धारित करने में संवेदनशीलता और दक्षता को काफी बढ़ाता है। मोबाइल एप्लिकेशन के लाभों में कम विश्लेषण समय, उपयोगकर्ता-मित्रता और विविध स्मार्टफोन उपकरणों, पदों और प्रकाश व्यवस्था की स्थिति के साथ संगतता शामिल है। हालांकि, संवेदनशीलता और प्रदर्शन में सुधार के लिए और वृद्धि की आवश्यकता है। इस बीच, रक्त के नमूनों से निपटने के दौरान इसके प्रदर्शन में सुधार करने के लिए पेपर-आधारित इम्यूनोसे का संशोधन आवश्यक है। इसके अलावा, प्राथमिक संक्रमण सीरोटाइप और विभिन्न रोगियों (बच्चों और वयस्कों) से एकत्र किए गए चयनित नमूनों की अधिक महत्वपूर्ण संख्या का उपयोग करके डेंगू का पता लगाने के लिए डीईएन-एनएस1-पीएडी के व्यापक मूल्यांकन की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

M.H.P. कृतज्ञतापूर्वक Universitas इस्लाम इंडोनेशिया (UII) से छात्रवृत्ति अनुसंधान कोष को स्वीकार करता है। लेखक मोबाइल एप्लिकेशन के विकास और पांडुलिपि में उनके योगदान के दौरान अपनी बहुमूल्य विशेषज्ञता और सहायता के लिए श्री नुचानोन निन्यावे के प्रति आभार व्यक्त करते हैं। इसके अलावा, लेखक थाईलैंड साइंस रिसर्च एंड इनोवेशन (टीएसआरआई), बेसिक रिसर्च फंड: वित्तीय वर्ष 2023 (परियोजना सं। (क) किंग मोंगकुट के प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय, थोनबुरी के कार्यक्रम स्मार्ट हेल्थकेयर के अंतर्गत (FRB660073/0164) का अध्ययन किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) 
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein   the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA  the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acid Merck 10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)   PAA Lab GmbH (Germany) K41-001 
Casein Merck 9005-46-3
Chromatography paper Grade 2  GE Healthcare 3002-911 
Clear laminate film 3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphate Merck 7558-79-4
Double tape side Stationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody  MyBiosource (USA) MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)   Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody   Merck AG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody  MyBiosource (USA) MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody  MyBiosource (USA) MBS834236
NS1 serotype 2 antigens MyBiosource (USA) MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t elution buffer
Plastic backing card 10x30 cm Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL) Sigma Aldrich P4832
Potassium Chloride Merck 104936
Potassium monophosphate Merck 104877
Sodium Chloride Merck 7647-14-5
Sodium tetraborate  Sigma Aldrich 1303-96-4
Sucrose Merck 57-50-1
Tween 20 Sigma Aldrich 9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode reader BioTek
Mobile phones Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scanner Epson Perfection V30
Oven Memmert
Wax printer  Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentation Google Cloud
ImageJ National Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 203 डेंगू NS1 माइक्रोफ्लुइडिक पेपर-आधारित विश्लेषणात्मक उपकरण स्मार्टफोन एप्लिकेशन वर्णमिति परख
पोर्टेबल पेपर-आधारित इम्यूनोसे डेंगू NS1 एंटीजन के वर्णमिति और मात्रात्मक पहचान के लिए स्मार्टफोन एप्लिकेशन के साथ संयुक्त
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Prabowo, M. H., Chalermwatanachai,… More

Prabowo, M. H., Chalermwatanachai, T., Surareungchai, W., Rijiravanich, P. Portable Paper-Based Immunoassay Combined with Smartphone Application for Colorimetric and Quantitative Detection of Dengue NS1 Antigen. J. Vis. Exp. (203), e66130, doi:10.3791/66130 (2024).

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