Summary
Для удовлетворения неотложных потребностей в диагностике лихорадки денге мы представляем интегрированное в приложение для смартфона бумажное аналитическое устройство Dengue NS1 (DEN-NS1-PAD) для количественного определения концентрации антигена Dengue NS1 в клинических образцах сыворотки/крови. Эта инновация повышает эффективность лечения денге, помогая принимать клинические решения в различных медицинских учреждениях, даже в условиях ограниченных ресурсов.
Abstract
Инфекция, вызванная вирусом денге (DENV), которая передается комарами Aedes , является серьезной проблемой общественного здравоохранения в тропических и субтропических странах. С учетом того, что ежегодная заболеваемость составляет около 10 миллионов случаев заболевания и 20 000-25 000 случаев смерти, особенно среди детей, существует острая потребность в практических диагностических инструментах. Присутствие неструктурного белка денге 1 (NS1) во время ранней инфекции было связано с высвобождением цитокинов, сосудистой утечкой и эндотелиальной дисфункцией, что делает его потенциальным маркером тяжелой денге.
Бумажные иммунологические анализы, такие как анализы бокового потока (LFA) и микрофлюидные аналитические устройства на бумажной основе (PAD), завоевали популярность в качестве диагностических тестов благодаря своей простоте, быстроте, дешевизне, специфичности и легкости интерпретации. Тем не менее, традиционные бумажные иммунологические анализы для выявления денге NS1, как правило, основаны на визуальном осмотре, что дает только качественные результаты. Чтобы устранить это ограничение и повысить чувствительность, мы предложили портативный тест на обнаружение денге NS1 на бумажном аналитическом устройстве (PAD), а именно DEN-NS1-PAD, который интегрирует приложение для смартфона в качестве колориметрического и количественного считывателя. Система разработки позволяет проводить прямое количественное определение концентраций NS1 в клинических образцах.
Образцы сыворотки и крови, полученные от пациентов, были использованы для демонстрации работы прототипа системы. Результаты были получены немедленно и могут быть использованы для клинической оценки как в хорошо оборудованных медицинских учреждениях, так и в условиях ограниченных ресурсов. Эта инновационная комбинация бумажного иммунологического анализа с приложением для смартфона предлагает многообещающий подход к улучшенному выявлению и количественному определению антигена денге NS1. Повышая чувствительность, превышающую возможности невооруженного глаза, эта система обладает большим потенциалом для улучшения процесса принятия клинических решений при лечении денге, особенно в отдаленных или недостаточно обслуживаемых районах.
Introduction
Инфекция, вызванная вирусом денге (DENV), является самой быстро распространяющейсяболезнью, переносимой комарами1, и более 390 миллионов человек инфицированы 96 миллионами симптоматических инфекций, 2 миллионами случаев тяжелого течения болезни и более 25 000 смертей в годв мире 1,2. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), примерно 3,9 миллиарда человек подвержены риску заболевания денге; ~70% проживают в странах Азиатско-Тихоокеанского региона и в основном в Юго-Восточной Азии3. В 2019 г. число случаев денге, о которых было сообщено ВОЗ, составило 4,2 миллиона, и на Таиланд пришлось не менее 136 000 случаев заболевания денге и 144 случая смертиот инфекции денге4. Вспышка лихорадки денге в Таиланде происходит в сезон дождей, с апреля по декабрь, как в городских, так и в сельских районах, особенно в северо-восточной части.
Инфекции DENV имеют различные клинические проявления, начиная от субклинических симптомов, легкой лихорадки денге (ДФ) и заканчивая тяжелой геморрагической лихорадкой денге (ДГЧ). Основной характеристикой тяжелого состояния ДГФ является повышенная проницаемость сосудов с последующим шоком и органной дисфункцией1. Понимание молекулярного пути, который может вызвать сосудистую утечку, очень важно для разработки эффективных методов лечения денге. Неструктурный белок денге 1 (NS1) представляет собой секретируемый гликопротеин во время ранней вирусной инфекции 5,6 и функционирует как кофактор репликации вирусной РНК7. NS1 может вызывать высвобождение цитокинов и способствовать утечке из сосудов, связываясь с толл-подобным рецептором 4 (TLR4) и эндотелиальным гликокаликсом 8,9. Исследования in vitro показали, что NS1 взаимодействует с эндотелиальными клетками и индуцирует апоптоз. Это состояние может способствовать эндотелиальной дисфункции и сосудистой утечке10. Уровни антигена NS1, коррелирующие с уровнями сывороточного интерлейкина (ИЛ)-10, были значительно повышены у пациентов с тяжелым клиническим заболеванием11. Денге NS1 также вносит свой вклад в патогенез заболевания, индуцируя IL-10 и подавляя DENV-специфические Т-клеточные ответы12,13. Кроме того, белок денге NS1 ассоциировался с тяжелым клиническим заболеванием, а концентрация NS1 > 600 нг мл-1 в первые 3 дня болезни ассоциировалась с развитием DHF14.
Персистенция антигена денге NS1 у пациентов с ДГФ может быть использована в качестве маркера тяжелой денге6. Существует несколько методов обнаружения NS1 в клинических образцах, таких как иммуноферментный анализ (ИФА) и экспресс-тест15. Золотым стандартом измерения концентрации белков NS1 в клинических условиях является метод ИФА. Однако метод ИФА является дорогостоящим и требует квалифицированного персонала и лабораторного оборудования16. Таким образом, разработка технологии обнаружения и количественного определения белков NS1 в тесте на месте оказания медицинской помощи (POCT) все еще продолжается. В последнее десятилетие бумажные иммунологические анализы, такие как анализы бокового потока (LFA) и микрофлюидные аналитические устройства на бумажной основе (μPA), стали популярными в качестве диагностических тестов из-за их простоты, быстроты, дешевизны и специфичности 17,18,19. В бумажном иммуноанализе для генерации сигналов было использовано несколько меток, таких как наночастицы золота (AuNPs)20, магнитные наночастицы21,22, квантовые точки23 и флуоресцентные материалы24,25. AuNP являются наиболее распространенными этикетками, используемыми в бумажных иммунологических анализах, из-за их недорогой стоимости производства, простоты изготовления, стабильности и простоты считывания. В настоящее время анализы латерального потока (LFA) на денге NS1 широко используются в клинических условиях26,27. Тем не менее, обычное распознавание этикеток LFA обычно выполняется невооруженным глазом и дает только качественные результаты.
За последнее десятилетие во всем мире широко использовалось более 5 миллиардов смартфонов, и есть потенциал для разработки портативных систем обнаружения28,29. Смартфоны обладают многофункциональными возможностями, такими как встроенные физические датчики, многоядерные процессоры, цифровые камеры, USB-порты, аудиопорты, беспроводное и прикладное программное обеспечение, что делает их пригодными для использования в различных биосенсорных платформах30. Кроме того, беспроводные технологии позволяют быстро передавать данные и могут использоваться для мониторинга в режиме реального времени и на месте31. Mudanyali et al. объединили бумажный иммунологический анализ и смартфоны для разработки портативной, не требующей оборудования, быстрой, недорогой и удобной в использовании платформы POCT для малярии, туберкулеза иВИЧ-32. Ling et al. сообщили об анализе бокового потока в сочетании с камерой смартфона для количественного определения активности щелочной фосфатазы в молоке33. Hou et al. также разработали двухмодальную систему визуализации на основе смартфона для количественных сигналов от цвета или флуоресценции в анализе бокового потока34. Кроме того, использование смартфона в качестве колориметрического и количественного считывателя может улучшить чувствительность, в то время как невооруженный глаз не может уверенно сообщить о присутствии цели35.
Представляя собой прорыв в диагностике денге, DEN-NS1-PAD 36,37,38 (далее именуемый устройством) предлагает портативное и эффективное решение. Используя технологию микрофлюидной бумаги с восковой печатью, это устройство количественно определяет NS1 с высокой чувствительностью и специфичностью за счет обработки изображений. Чтобы еще больше повысить его полезность, мы разработали удобное приложение для смартфона для колориметрического и количественного считывания. Клиническая валидация с использованием образцов пациентов из тайских больниц подчеркивает его непосредственное влияние на оценку состояния пациента в режиме реального времени. Наша инновация знаменует собой важнейший прогресс в области оптимизированного ведения денге в местах оказания медицинской помощи, обещая произвести революцию в диагностике в условиях ограниченных ресурсов здравоохранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Комитет по этике Институционального наблюдательного совета, Медицинский департамент Королевской армии Таиланда, больница Пхрамонгкутклао, Бангкок, Таиланд (IRBRTA 1218/2562), дал одобрение. При проведении этого исследования мы соблюдали все необходимые этические нормы.
1. Изготовление прибора для иммуноанализа на бумажной основе
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство для иммунологического анализа на бумажной основе было изготовлено в соответствии с ранее установленными методами36,37 и заявкой на патент Таиланда No 19010081638.
- Дизайн и чертеж: Спроектируйте бумажное аналитическое устройство (Рисунок 1A, B) с 18 восковыми шаблонами PAD на компьютере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дизайн специфичен и предназначен для бумаги формата А5. Количество PAD зависит от размера бумаги в соответствии с требованиями пользователя. - Распечатайте разработанный рисунок на целлюлозной бумаге с помощью воскового принтера (Таблица материалов).
- Растопите бумагу с вощеной печатью в лабораторной печи в течение 75 с при 150 °C. Затем храните его в коробке из-под силики до тех пор, пока он не понадобится для последующих этапов.
- Нанесите 0,5 мкл 0,025% поли-L-лизина (ФАПЧ) на тестовую и контрольную зоны. Инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 2 минут в силикатной камере, а затем нагревайте в духовке при температуре 65 °C в течение 5 минут.
- Нанести 0,5 мкл 1 мкл-1 козьего антитела IgG против мышей на контрольную область и 0,5 мкл 1 мкг мкл-1 антитела захвата на область исследования. Дайте каплям высохнуть в коробке с силикагелем при RT в течение 30 минут.
- Нанесите 2 мкл блокирующего буфера на область образца, 3 мкл на сопряженную область и 2 мкл на область детектирования. Дайте каплям высохнуть в коробке из-под силикагеля в течение 30 минут.
- Нанесите 2 мкл раствора комплекса наночастиц-антитела золота (AuNPs-Ab) на область конъюгата и дайте ему высохнуть в силикагелевом боксе при RT в течение 30 мин.
2. Сборка бумажного иммуноферментного анализа
- Осторожно снимите защитную пленку с обратной стороны клейкой пластиковой подложки, чтобы обнажить клей.
- Совместите обработанную целлюлозную бумагу с клейкой пластиковой подложкой и плотно прижмите два слоя друг к другу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения к гидрофильному полю, чтобы свести к минимуму риск загрязнения или повреждения устройства. - Нанесите полиэтиленовую пленку, чтобы покрыть бумагу, и прижмите их друг к другу.
- Вырежьте нужный кусок приборов с помощью ножниц из листов полностью собранных устройств.
- Теперь DEN-NS1-PAD (рис. 1C) готовы к использованию. Для длительной стабильности храните их при температуре 4 °C.
3. Приготовление конъюгата AuNPs-Ab
ПРИМЕЧАНИЕ: AuNPs-Ab был подготовлен, как описано ранее Prabowo et al.36.
- Смешайте 10 мкл 1 мг мл−1 антитела к NS1 в PBS, 1 мл коллоида AuNPs 40 нм и 0,1 мл 0,1 М боратного буфера (pH 8,5).
- Вращайте смесь при 50 об/мин в течение 60 мин и инкубируйте при RT.
- Применяют 0,1 мл 10 мг мл−1 БСА в BBS, вращают при 50 об/мин и инкубируют при RT в течение 15 мин.
- Центрифугируют раствор при 20,187 × г и 4 °С в течение 30 мин.
- Осторожно пипетку и отделите надосадочную жидкость от осажденного AuNPs-Ab.
- Ресуспендируйте AuNPs-Ab в 500 мкл BBS и диспергируйте его с помощью ультразвука.
- Центрифугирование повторяют при 20,187 × г и 4 °C в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите процессы диспергирования и центрифугирования 3 раза. - Добавьте 50 мкл конъюгированного буфера в суспензию, сделав ее готовой к нанесению на область сопряжения.
4. Разработка мобильных приложений
- Обработка изображений и разработка машинного обучения
- Соберите набор данных для модели контролируемого изображения, собрав более 900 изображений DEN-NS1-PAD с автофокусировкой, фиксирующих различные условия, такие как различные концентрации, марки камер (12–13 мегапикселей), повороты (90° и 180°) и настройки освещения. Стремитесь к 30 изображениям при каждом конкретном условии.
- Обозначьте достоверную информацию, определив и аннотировав две интересующие области в качестве тестовой и контрольной областей в собранных изображениях для контролируемого обучения.
- Разработайте алгоритм для идентификации фоновой полосы. Найдите осевую линию между тестовой и контрольной областями, вычислите ее среднюю точку и установите квадратную область, пропорциональную среднему размеру двух основных областей, сохраняя при этом одинаковую ориентацию вращения.
- Создайте модель сегментации изображений, используя набор данных и наземные метки из шагов 4.1.1 и 4.1.2, чтобы обучить модель сегментации изображений для определения областей интереса.
- Алгоритм применения
- Примените обученную модель сегментации изображений к новым изображениям, чтобы автоматически найти тестовую, контрольную и фоновую области.
- Используйте основные методы обработки изображений, чтобы получить одно значение интенсивности для каждой из трех областей интереса (тестовой, контрольной и фоновой).
- Преобразуйте изображение в 3D-представление массива (y, x channel) для доступа к значениям пикселей.
- Преобразуйте изображение в оттенки серого путем усреднения значений RGB и примените инверсию по формуле (255-x).
- Нормализуйте значения тестовой и контрольной областей путем вычитания значения фоновой области.
- Используйте предварительно установленную калибровочную кривую для расчета концентрации NS1.
- Классифицируйте результаты как положительные или отрицательные на основе предельного значения 0,1103, полученного из нормализованной интенсивности оттенков серого37.
5. Калибровочная кривая и чувствительность
- Готовят образец NS1 в сыворотке крови человека для калибровки с концентрациями 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 мкг мл-1.
- Капните по 50 мкл каждой концентрации на область образца и выполните измерения в трех экземплярах.
- Дайте образцам полностью впитаться в устройство, что может занять 20-30 минут для получения результатов.
- Сделайте снимки устройства с помощью цифровой камеры или смартфона через 5 минут инкубации.
- Анализ тестовых и контрольных зон с помощью ImageJ и пользовательского мобильного приложения.
- Постройте калибровочную кривую на основе данных из ImageJ и мобильного приложения.
- Рассчитайте предел пустого места (LOB), предел обнаружения (LOD) и предел количественной оценки (LOQ), используя уравнения (1-3) ниже:
LOB = Среднее значение пустых данных + 1:645* ð (стандартное отклонение пустых данных) (1)
LOD = LOB +1:645*р (стандартное отклонение данных о наименьшей концентрации) (2)
LOQ = Среднее значение пустых данных + 10*ð (стандартное отклонение пустых данных) (3)
6. Проведение бумажного иммуноферментного анализа с клиническими образцами
- Соберите и обработайте 300 мкл периферической крови 30 пациентов в первый день госпитализации в пробирки ЭДТА с фиолетовым верхом, следуя надлежащей клинической практике.
- Центрифугируют кровь при 2,884 × г и 4 °C в течение 20 мин.
- Переложите жидкий компонент (плазму) в чистую полипропиленовую пробирку с помощью пипетки.
- Немедленно храните плазму в морозильной камере при температуре −20 °C для последующего анализа.
- Нанесите 20 мкл плазмы на область образца в верхней части устройства. Затем добавьте 30 мкл буфера для промывки (0,05% v/v Tween 20 в 1x фосфатном буферном солевом буфере).
- Дайте образцу полностью впитаться в устройство, что может занять 20-30 минут для получения результатов.
- Сделайте снимки устройства с помощью цифровой камеры или смартфона после 5 минут инкубации при комнатной температуре.
- Анализ тестовых и контрольных зон с помощью ImageJ и пользовательского мобильного приложения.
7. Количественная оценка с помощью мобильного приложения
ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность бумажного иммуноферментного анализа анализируется в мобильном приложении (рис. 2).
- Откройте разработанное мобильное приложение на смартфоне.
- Выберите Использовать камеру или Загрузить из галереи, чтобы выбрать или отправить источник данных. Это можно сделать с помощью захвата камеры или выбрав изображение из галереи устройства.
- Перейдите в раздел аналитики и нажмите кнопку Анализ на экране.
- Подождите, пока приложение проанализирует данные и отобразит результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выбор метода изготовления имеет решающее значение для обеспечения воспроизводимых результатов анализа в устройствах для иммуноанализа на бумажной основе. В нашем исследовании мы изучили различные производственные процессы и материалы в контексте демонстрации бумажного иммуноанализа. Выбранный нами метод использует систему восковой печати для создания гидрофобных барьеров внутри микрофлюидных устройств на бумажной основе. Этот подход отличается простотой, скоростью и стабильными результатами. Следует отметить, что его преимущество заключается в том, что он позволяет избежать использования фоторезистных химикатов, которые могут препятствовать адсорбции белка и увеличивать гидрофобность целлюлозной бумаги. Кроме того, восковая печать обеспечивает одинаковые размеры жидкостных каналов, способствуя воспроизводимости анализа.
После образования гидрофобных барьеров на поверхность целлюлозной бумаги наносились необходимые реагенты для иммуноферментного анализа. С помощью электростатической адсорбции ФАПЧ способствовала иммобилизации биомолекул, взаимодействуя как с положительным зарядом функциональных групп аминов, так и с отрицательно заряженным антителом. Этот этап облегчает модификацию и иммобилизацию антител и нанесение конъюгатов меток-антител в процессе изготовления. Важно, что этот этап можно проводить параллельно. Сборка бумажных устройств иммунологического анализа (DEN-NS1-PAD, как показано на рисунке 1A) завершается укладкой модифицированной бумаги на клейкую пластиковую подложку и ламинированием ее пластиковой пленкой.
Основной целью данного исследования является разработка удобного для пользователя метода измерения концентраций NS1 с использованием смартфона. Этот подход может быть использован в качестве устройства для тестирования в месте оказания медицинской помощи (POCT) как в домашних, так и в клинических условиях. Учитывая широкий диапазон концентраций NS1 в сыворотке крови пациентов, по результатам этих экспериментов были использованы простые линейные модели. Для каждой концентрации NS1 был подготовлен набор данных, состоящий из трех тестовых устройств. Фотографии устройств были сделаны с помощью смартфона при стандартных настройках и оптимальных условиях освещения, что исключало необходимость в темном ящике. Тестовая зона ЗПА содержит моноклональное антитело NS1 к лихорадке денге мышей, в то время как контрольная зона содержит антитела IgG к козам против мышей. При формате сэндвич-анализа более высокие концентрации NS1 в образцах соответствуют повышенной интенсивности красного цвета в зоне тестирования. Напротив, интенсивность цвета в контрольной зоне остается относительно постоянной. На рисунке 1B показаны необработанные изображения со смартфона, которые обеспечивают выгодное визуальное наблюдение, не требуя специального оборудования.
С помощью специального мобильного приложения мы нормировали интенсивности и рассчитали простые линейные модели для спайковых концентраций NS1 в образцах сыворотки крови — коэффициентную корреляцию (r2), полученную из мобильного приложения. Корреляция коэффициентов (r2), полученная с помощью мобильного приложения, составила 0,92 (рис. 3), что соответствует ожиданиям. Этот подход с помощью смартфона превзошел наблюдение невооруженным глазом, значительно повысив чувствительность на 178%. Кроме того, для нормализованных интенсивностей были рассчитаны предел холостого (LoB), предел обнаружения (LoD) и предел количественной оценки (LoQ), как показано в таблице 1.
Для демонстрации практической функциональности DEN-NS1-PAD в клинических условиях были использованы реальные клинические образцы. Бумажный иммуноферментный анализ давал качественные цветные показания в течение 20-30 минут, что позволяло визуально определять отрицательные или положительные результаты. Образцы сыворотки крови пациентов с подозрением на лихорадку денге подвергались воздействию устройства. На рисунке 4 показаны и сравниваются результаты, полученные как с помощью прибора, так и с помощью коммерческого диагностического экспресс-теста (РДТ). В таблице 2 обобщены результаты визуального считывания показаний и системы на основе смартфона. Коммерческий ДЭТ и устройство дали схожие результаты: 7 положительных и 23 отрицательных результата визуального чтения. В отличие от этого, считывающая система на основе смартфона, используемая исключительно для устройства, сообщила о девяти положительных и 21 отрицательном исходе клинических образцов.
Рисунок 1: Изображения спроектированного и изготовленного DEN-NS1-PAD. (A,B) Один канал от гидрофобного барьера с восковым рисунком спроектирован и изображен в трех состояниях (C) до и (D,E) после введения раствора пробы в назначенную область и отображения (D) отрицательных и (E) положительных результатов соответственно. Раствор образца фититит через канал (см. стрелку), взаимодействуя с компонентами в ключевых местах: AuNPs-Ab в конъюгированной области, антителами к NS1 в тестовой области (что указывает на положительный результат на денге NS1) и антимышиным IgG в контрольной зоне. Результаты легко видны невооруженным глазом и могут быть количественно оценены путем обработки изображений с помощью планшетного сканера или камеры смартфона. Аббревиатура: AuNPs-Ab = конъюгат наночастиц золота с антителом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Скриншоты экрана телефона из мобильного приложения. (A) Пользовательский экран Android-приложения, запущенного на мобильном телефоне, (B) отображение экрана приложения, (C) главное меню приложения, в котором пользователи могут выбрать использование камеры или загрузить изображение из галереи, (D) отображение соответствующего изображения для тестирования, (E) отображение времени обратного отсчета для анализа, (F) отображение результатов теста, включая интенсивность тестовой и контрольной зоны, решение об инфекции (положительный/отрицательный) и концентрацию NS1 в образце. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Линейная градуировочная кривая для детектирования NS1 в сыворотке. Устройство использовалось, а изображения интерпретировались путем обработки через приложение на основе данных смартфона. Столбцы погрешности показывают ±1 стандартное отклонение, n = 3. Сокращения: Т = тестовая зона; C = контрольная зона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изображение DEN-NS1-PAD из анализа клинического образца. Сыворотка (50 мкл) использовалась в бумажном иммуноферментном анализе. (A) Пример отрицательного результата, (B) положительные результаты, (C) общие результаты и сравнение ДЭТ с бумажным иммунологическим анализом. Сокращения: РДТ = диагностический экспресс-тест; Pos = положительный; Neg = отрицательный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Параметр | Невооруженным глазом | Мобильное приложение |
| Лимит пустых мест (LoB) | - | 43,15 нг мл-1 |
| Предел обнаружения (LoD) | 200 нг мл-1 | 112,19 нг мл-1 |
| Предел количественной оценки (LoQ) | - | 373,58 нг мл-1 |
Таблица 1: LoB, LoD и LoQ из ImageJ и мобильного приложения по данным калибровочного стандарта NS1 в сыворотке. Сокращения: LoB = предел пробела; LoD = предел обнаружения; LoQ = предел количественной оценки.
| Пациент No | Невооруженным глазом | Приложение для смартфона | ИзображениеJ | |
| РДТ | Бумажный иммунологический анализ | |||
| 1 | - | - | - | - |
| 2 | - | - | - | - |
| 3 | - | - | - | - |
| 4 | - | - | - | - |
| 5 | - | - | - | - |
| 6 | - | - | - | - |
| 7 | - | - | - | - |
| 8 | - | - | - | - |
| 9 | + | + | + | + |
| 10 | - | - | + | + |
| 11 | - | - | - | - |
| 12 | + | + | + | + |
| 13 | - | - | - | - |
| 14 | - | - | - | - |
| 15 | - | - | - | - |
| 16 | + | + | + | + |
| 17 | + | + | + | + |
| 18 | - | - | - | - |
| 19 | - | - | - | - |
| 20 | - | - | - | - |
| 21 | + | + | + | + |
| 22 | + | + | + | + |
| 23 | - | - | - | - |
| 24 | + | + | + | + |
| 25 | - | - | - | - |
| 26 | - | - | - | - |
| 27 | - | - | - | - |
| 28 | - | - | - | - |
| 29 | - | - | - | - |
| 30 | - | - | + | + |
Таблица 2: Сравнение результатов визуального считывания и считывающей системы на основе смартфона для образцов сыворотки. (+) и (-) указывают на положительную и отрицательную интерпретацию результатов соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одним из важных параметров конструкции считывающей системы на базе смартфона является способность обеспечивать воспроизводимую обработку изображений образцов. В этом исследовании, для простоты и удобства, изображения были получены с трех разных марок смартфонов с камерами 12-13 МП без использования коробки для обработки изображений или аксессуаров. Переменные условия захвата изображения, такие как разрешение камеры, время захвата изображения, условия освещения и окружающая среда, могут влиять на интенсивность цвета тестовых и контрольных пятен на устройстве. Влияние различного времени захвата изображения на освещение и сушку ПАД на интенсивность сигнала устройств было сведено к минимуму за счет использования нормализованных интенсивностей сигнала, которые оставались неизменными на всех изображениях, полученных в разное время36. Вычитание фонового сигнала возникло как стратегия повышения точности измерений интенсивности цвета, эффективно смягчая влияние условий освещения. Наши выводы согласуются с предыдущими исследованиями, подчеркивающими эффективность методов вычитания базового или фонового уровня в минимизации воздействия на окружающую среду39,40.
Продолжающиеся дебаты о превосходстве использования фотобокса или метода без вспомогательных принадлежностей имеют последствия для обработки изображений 39,41. Блок визуализации может повысить надежность результатов обработки изображений, сводя к минимуму вариации условий визуализации 41,42,43. В этом исследовании мы использовали мобильное приложение на основе облачного машинного обучения для обработки изображений. Этот подход использует машинное обучение на облачной платформе для автоматической классификации, извлечения и обогащения данных изображений. Приложение эффективно идентифицировало и обрабатывало интересующую область на изображениях, охватывая фоновую зону, тестовую и контрольную зоны. Этот шаг сыграл ключевую роль в разграничении этих зон38. Предыдущие исследования показывают, что обработка изображений с использованием машинного обучения дает превосходную классификацию между результатами для контрольной и тестовой выборок 43,44,45. В этом исследовании использование фиксированного местоположения и вычитания фона генерировало постоянный фоновый сигнал от целлюлозных μPA, повышая согласованность и точность классификации показаний, предоставляемых мобильным приложением40,43.
Что касается стабильных результатов при демонстрации бумажного иммуноанализа, метод изготовления играет важную роль. В предыдущем исследовании36 были изучены несколько условий оптимизации для конструкции и метода изготовления DEN-NS1-PAD, таких как концентрации ФАПЧ, блокирующего вещества и антитела NS1. Прибор успешно протестировал NS1 в буфере, клеточной культуре и сыворотке крови человека как качественно, так и количественно.
Матричные эффекты, возникающие из-за компонентов сыворотки, могут влиять на предел обнаружения прибора при тестировании образцов сыворотки. Тем не менее, результаты показывают, что разработанный иммунологический анализ может успешно обнаруживать концентрации NS1 в образцах сыворотки крови, что дает результаты, сопоставимые с результатами коммерческого ДЭТ (табл. 2). При визуальном осмотре и мобильном приложении (рис. 4) наблюдались очевидные результаты, подчеркивающие эффективность анализа для тестирования сыворотки. Хотя более высокая вязкость сыворотки может повлиять на время анализа, она не препятствует интерпретации результатов36. Использование мобильного приложения может обеспечить более положительные результаты при анализе образцов, поскольку использование мобильного приложения значительно повышает чувствительность тестирования образцов46. Стоит отметить, что для определения потенциальных ложноположительных или ложноотрицательных результатов необходимы дальнейшие сравнения с молекулярными анализами, такими как ОТ-ПЦР 15,47,48 на денге NS1.
Заметное ограничение этого исследования возникает при рассмотрении более сложной матрицы образца, такой как кровь. Компоненты, присутствующие в крови, действительно могут повлиять на предел обнаружения устройства. В таких случаях использование дополнительных впитывающих прокладок для улучшения поглощения буфера представляет собой потенциальное решение. Эта модификация может способствовать свертыванию крови, используя кровоостанавливающие свойства целлюлозы, влияя на тромбоциты49. Другой подход заключается в нанесении 4% (по массе) капель физиологического раствора на прокладку для образца для улучшения свертывания крови. Предыдущие исследования показали, что соли, такие как хлорид кальция и хлорид натрия, вызывают свертывание эритроцитов (эритроцитов) 50,51. Na+ может дестабилизировать суспензию эритроцитов в крови, подавляя электрический двойной слой на поверхности эритроцитов и уменьшая отталкивание заряда между эритроцитами. Кроме того, высокая концентрация соли также индуцирует агрегацию крови52. Кроме того, противоионный ионный валентный заряд Na+ подавляет толщину заряженного двойного слоя эритроцитов, что приводит к агрегации сдутых эритроцитов. Добавление 4%-ного (массового) солевого раствора (NaCl) облегчает разделение плазмы на целлюлозной бумаге51. Тем не менее, необходима тщательная оптимизация концентрации физиологического раствора, чтобы избежать нежелательных эффектов на агрегацию крови и агрегацию наночастиц золота53,54.
Коммерческие восковые принтеры обеспечивали идеальное сочетание стоимости и простоты прототипирования. Поскольку производство этих принтеров было прекращено в 2016 году, потребовались альтернативные методы изготовления, такие как струйная печать55, трафаретная печать56 и фотолитография57. Офисный тонер-принтер является хорошим кандидатом для изготовления μPAD. Полиэфирная смола, содержащаяся в тонере, создает гидрофобные узоры при 200 °C в течение 60 мин с различным дизайном58.
В данном исследовании использовалось антитело NS1 второго серотипа, как указано в компании. Однако мы обнаружили, что это антитело также взаимодействует со всеми серотипами36,37. Чувствительность к выявлению DENV-4 ниже (87,5%) по сравнению с другими серотипами. Чувствительность DENV-1 и DENV-2 составляет примерно 88,89%, а для DENV-3 — 100%37. Эти результаты согласуются с более ранними исследованиями, в которых также сообщалось о более низкой чувствительности ДЭТ к DENV-4 по сравнению с другими серотипами59. Общая чувствительность прибора составляет ~88,89%, при специфичности примерно 86,67%. Примечательно, что фактическая чувствительность DEN-NS1-PAD может превосходить таковую у коммерческого РДТ. Тем не менее, RDT демонстрирует положительную прогностическую ценность (PPV) 84,62% и точность 87,67%. Примечательно, что DEN-NS1-PAD лучше выявляет инфекцию денге в первые 5-6 дней, в то время как ДЭТ эффективна только в первые 5 дней37.
Таким образом, сочетание портативного бумажного иммуноферментного анализа (DEN-NS1-PAD) с приложением для смартфона имеет большие перспективы для измерения лихорадки денге NS1. Мобильное приложение значительно повышает чувствительность и эффективность количественного определения NS1 в образцах сыворотки крови по сравнению с наблюдением невооруженным глазом. К преимуществам мобильного приложения можно отнести сокращение времени анализа, удобство использования и совместимость с различными устройствами смартфонов, положениями и условиями освещения. Тем не менее, для повышения чувствительности и производительности необходимы дальнейшие улучшения. Между тем, модификация бумажного иммуноферментного анализа необходима для повышения его эффективности при работе с образцами крови. Кроме того, для выявления денге DEN-NS1-PAD требуется всесторонняя оценка с использованием более значительного числа серотипов первичной инфекции и отдельных образцов, взятых у различных пациентов (детей и взрослых).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
M.H.P. выражает благодарность стипендиальному исследовательскому фонду Исламского университета Индонезии (UII). Авторы выражают благодарность г-ну Нутчанону Ниньяви за его ценный опыт и помощь на протяжении всей разработки мобильного приложения, а также за его вклад в рукопись. Кроме того, авторы высоко оценивают финансовую поддержку, предоставленную Таиландским фондом научных исследований и инноваций (TSRI), Фондом фундаментальных исследований: 2023 финансовый год (проект No 2023). FRB660073/0164) в рамках программы «Умное здравоохранение» Технологического университета короля Монгкута в Тхонбури.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10x30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
- Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
- World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
- WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
- Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
- Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570 (2014).
- Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
- Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102 (2015).
- Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673 (2017).
- Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
- Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
- Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409 (2013).
- Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341 (2013).
- Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
- World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
- Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
- Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
- Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
- Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V.
- Hu, J., et al.
- Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
- Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
- Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
- He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
- Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
- Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104 (2018).
- Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
- Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D.
- Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1 (2015).
- Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
- Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678 (2012).
- Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
- Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291 (2017).
- You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
- Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
- Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
- Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. Prabowo, M. H., et al. , 1901000816 (2019).
- Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
- Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800 (2020).
- Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
- Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203 (2017).
- Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84 (2017).
- Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
- Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7 (2019).
- Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391 (2018).
- Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
- Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
- Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
- Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
- Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376 (2014).
- Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
- Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
- Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
- Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
- Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
- Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).
