Summary
يصف هذا البروتوكول اختبار العلامات الحيوية للبول الاصطناعي متعدد التحليلات بوساطة كريسبر-كاس والذي يتيح تشخيص السرطان في نقطة الرعاية من خلال التحليل خارج الجسم الحي لأنشطة الأنزيم البروتيني المرتبطة بالورم.
Abstract
وقد مكن إنشاء مؤشرات حيوية اصطناعية لتطوير التشخيص الدقيق من الكشف عن المرض من خلال مسارات تتجاوز تلك المستخدمة في قياسات السوائل الحيوية التقليدية. تستخدم المؤشرات الحيوية الاصطناعية عموما المراسلين الذين يقدمون إشارات قابلة للقراءة في السائل الحيوي لتعكس التغيرات الكيميائية الحيوية في البيئة المكروية المحلية للمرض أثناء حدوث المرض وتطوره. يعد التركيز الدوائي للمراسلين والتضخيم الكيميائي الحيوي لإشارة المرض أمرا بالغ الأهمية لتحقيق حساسية وخصوصية عالية في الاختبار التشخيصي. هنا ، يتم بناء منصة تشخيص السرطان باستخدام شكل واحد من المؤشرات الحيوية الاصطناعية: أجهزة استشعار نانوية قائمة على النشاط تحمل مراسلي الحمض النووي المستقر كيميائيا والتي يمكن تحريرها بواسطة التوقيعات المحللة للبروتين الشاذة في البيئة المكروية للورم. يوفر الحمض النووي الاصطناعي كمراسل للمرض إمكانية تعدد الإرسال من خلال استخدامه كرمز شريطي ، مما يسمح بقراءة التوقيعات المحللة للبروتين المتعددة في وقت واحد. يتم الكشف عن مراسلي الحمض النووي الذين يتم إطلاقهم في البول باستخدام نوكلياز كريسبر عن طريق التهجين مع الحمض النووي الريبي كريسبر ، والذي بدوره ينتج إشارة فلورية أو لونية عند تنشيط الإنزيم. في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء مستشعرات نانوية قائمة على النشاط مشفرة بالحمض النووي ويتم تجسيد تطبيقها في نموذج فأر قبل السريري لسرطان القولون والمستقيم النقيلي. هذا النظام قابل للتعديل بدرجة كبيرة وفقا لبيولوجيا المرض ويولد إشارات مرضية متعددة في وقت واحد ، مما يوفر فهما شاملا لخصائص المرض من خلال عملية طفيفة التوغل تتطلب فقط إدارة أجهزة الاستشعار النانوية ، وجمع البول ، واختبار ورقي يتيح التشخيص في نقطة الرعاية.
Introduction
على الرغم من الجهد الكبير لتحديد المؤشرات الحيوية للورم مثل البروتينات المتساقطة والحمض النووي ، فقد تم إجهاد مجال تشخيص السرطان بسبب وفرتها المنخفضة أو تدهورها السريع في الدورةالدموية 1. كاستراتيجية تكميلية ، تمثل المؤشرات الحيوية الاصطناعية المهندسة بيولوجيا التي تستجيب بشكل انتقائي لميزات المرض لتوليد إشارات مضخمة طرقا جديدة نحو تشخيصات دقيقة ويمكن الوصول إليها 2,3. للمساعدة في الكشف ، تسخر هذه المؤشرات الحيوية الاصطناعية آليات التنشيط المعتمدة على الورم مثل التضخيم الأنزيمي لإنتاج تحليلات مع تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء4. هنا ، يتم الاستفادة من فئة من الإنزيمات المرتبطة بالسرطان ، البروتياز ، لتنشيط أجهزة الاستشعار النانوية القابلة للحقن لإطلاق مراسلي الأمراض الذين يمكن اكتشافهم من السوائل الحيوية مثل الدم أو البول 5,6. في ضوء عدم تجانس الورم ، يسمح تطوير لوحة من أجهزة الاستشعار التي يتم تنشيطها بالبروتياز بإجراء اختبارات متعددة التحليلات تجمع بين أحداث انقسام البروتياز المختلفة في "توقيع المرض" لتقييم حدوث السرطان وتطوره بطريقة أكثر تحديدا ومتعددة.
تم تطوير المؤشرات الحيوية الاصطناعية المنشطة بالبروتياز والتي تشتمل على ركائز الببتيد المترافقة على سطح حامل خامل7. عند حقنها في الجسم الحي ، يتم نقل هذه الببتيدات إلى الورم حيث يقوم الانقسام الأنزيمي بواسطة البروتياز السرطاني بإطلاق المراسلين في الدم أو البول للكشف عنهم. يتطلب الكشف المتعدد باستخدام المؤشرات الحيوية الاصطناعية المنشطة بالبروتياز أن يتم تمييز كل علامة حيوية اصطناعية داخل كوكتيل برمز شريطي جزيئي فريد. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير مناهج مختلفة ، بما في ذلك الرموز الشريطية الجماعية والمراسلين المشفرينبالليجند 8،9،10. على عكس طرق تعدد الإرسال هذه التي قد تقتصر على عدد قليل من إمكانيات الإشارة المختلفة ، يوفر التشفير الشريطي للحمض النووي العديد من المجموعات وفقا للتعقيد العالي وعدم التجانس لحالات الأمراض البشرية. لتوسيع تعدد إرسال المؤشرات الحيوية الاصطناعية ، يتم ترميز المستشعرات عن طريق تسمية كل مراسل بتسلسل فريد من الحمض النووي للكشف عبر نوكلياز CRISPR-Cas لتضخيم إشارة الموائع الحيوية خارج الجسم الحي. تم تصميم هذه الرموز الشريطية أحادية الحمض النووي (ssDNA) لترتبط بالحمض النووي الريبي المكمل لكريسبر (crRNAs) ، مما ينشط نشاط النيوكلياز الجانبي الذي يسببه الهدف ل CRISPR-Cas12a11. يمكن استخدام نشاط النيوكلياز هذا لشق شريط الحمض النووي للمراسل المكتشف من خلال حركية التألق أو باستخدام شرائط الورق.
بالإضافة إلى التضخيم الجزيئي عبر البروتياز (في الجسم الحي) و CRISPR-Cas (خارج الجسم الحي) ، تتضمن ميزة التصميم الرئيسية الأخرى للمؤشرات الحيوية الاصطناعية المنشطة بالبروتياز تسخير الحرائك الدوائية للمواد النانوية لزيادة تركيز الإشارة التشخيصية في السوائل الحيوية10. يتمثل أحد الأساليب في استخدام حامل الجسيمات النانوية لزيادة وقت دوران ركائز الببتيد المقترنة السطحية. يتم اختيار شجيرة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) كحامل نانوي بقطر هيدروديناميكي صغير نسبيا وتعدد التكافؤ لزيادة التوصيل إلى الأورام. على الرغم من صغر حجمها بما يكفي لتعزيز توصيل الورم ، إلا أن حجم حامل PEG أكبر من قطع حجم ~ 5 نانومتر لحاجز الترشيح الكبيبي الكلوي بحيث يمكن إزالة ركائز الببتيد المشقوقة فقط في البول ، مع الاستفادة من ترشيح الحجم بواسطة الكلى12. في هذا البروتوكول ، تم تحديد سير العمل متعدد الخطوات لتوليف وتطبيق أجهزة الاستشعار النانوية القائمة على النشاط المشفر بالحمض النووي في نموذج الفئران قبل السريري ، مما يسلط الضوء على إعداد اختبار العلامات الحيوية للبول الاصطناعي متعدد التحليلات بوساطة CRISPR-Cas ، والذي تم استخدامه من قبل هذه المجموعة لتصنيف حالة المرض في نماذج الفئران لأنواع متعددة من السرطان13. نظرا لمبدأ التصميم متعدد الاستخدامات ، يمكن تبادل جميع المكونات الوظيفية الثلاثة للمستشعر النانوي - الناقل النانوي (بوليمر PEG) ، والوحدة المستجيبة للمحفزات (الركيزة المنشطة بالبروتياز) ، ومراسل الموائع الحيوية (الباركود DNA) - بدقة وفقا للاحتياجات الخاصة بالتطبيق ، مما يسمح بالنمطية من خلال تكييف خصائص الهدف والإطلاق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الدراسات على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في مؤسسة المؤلفين. مطلوب مرافق رعاية القياسية بما في ذلك غرف السكن ، والأغطية المعقمة ، والتخدير ، والقتل الرحيم الأخلاقي لنقطة النهاية لإجراء هذه التجارب بشكل صحيح. يتم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية ويشرف عليها الطاقم البيطري في المؤسسة. تم الحصول على إناث الفئران BALB / c ، المستخدمة في التجارب ، من مصدر تجاري (انظر جدول المواد) وتراوحت أعمارها من 6 إلى 8 أسابيع في بداية الدراسة. وترد في الجدول التكميلي 1 تسلسلات الحمض النووي المركب حسب الطلب، والحمض النووي الريبوزي الريبوزي (crRNA)، ومجسات الركيزة الببتيدية القائمة على الحوت النقطي، وببتيدات المستشعر.
1. اختيار الركيزة الببتيد المنشط بالبروتياز
- جمع وإعداد عينات الأنسجة من أنسجة الرئة أو الرئة السليمة مع عقيدات الورم بعد تقرير نشرسابقا 13.
- تجانس الأنسجة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات مبرد مسبقا (PBS ، درجة الحموضة 7.4) (200 مجم من الأنسجة / مل PBS) مع أنابيب تفكك الأنسجة للتفكك الآلي للأنسجة إلى معلقات أحادية الخلية.
- تجانس أنسجة الطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. احتفظ بالمادة الطافية في أنبوب جديد.
- جهاز طرد مركزي طاف عند 14000 × جم لمدة 25 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة البروتين بحمض البيسينتشونينيك (BCA) (انظر جدول المواد).
- أضف برنامج تلفزيوني إلى العينة لتحضير محلول 0.33 ملغم / مل.
- قم بتقييم النشاط المحلل للبروتين باتباع الخطوات أدناه.
- في صفيحة 384 بئرا ، أضف 5 ميكرولتر ، 6 ميكرومتر من مجسات الركيزة الببتيد القائمة على FRET إلى كل بئر. لكل مسبار ، قم بإجراء التفاعل في ثلاث نسخ.
ملاحظة: يحتوي مسبار الركيزة الببتيد القائم على الحنق على تسلسل ببتيد قصير (6-8 أحماض أمينية ، مصممة لتكون خاصة بالبروتياز المستهدف أو مجموعة من البروتياز) تنتهي بزوج من الفلوروفور والمروي. تم وصف مجسين FRET في الجدول التكميلي 1 كمثال. يمكن العثور على المكتبة الكاملة للتحقيقات في Hao et al.13. - أجهزة الطرد المركزي لوحة البئر لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة عند 180 × جم لضمان وجود المجسات في الجزء السفلي من اللوحة.
- أضف 25 ميكرولتر 0.33 مجم / مل عينة أنسجة أو 40 ميكرومتر بروتياز مؤتلف13 إلى كل بئر.
ملاحظة: قد يلزم تحسين التركيز النهائي لعينة الأنسجة أو البروتياز المؤتلف وفقا لنشاطهما المحلل للبروتين الداخلي. على سبيل المثال ، قد تتطلب الأنسجة المحللة للبروتين مثل الأمعاء عوامل تخفيف أعلى للسماح بمراقبة الانقسام الأنزيمي الأولي. - أجهزة الطرد المركزي لوحة البئر لفترة وجيزة في 180 × غرام (في درجة حرارة الغرفة) لخلط المجسات و lysates الأنسجة.
- ابدأ فورا في اكتشاف انشقاق المسبار عن طريق قياس التألق باستخدام قارئ اللوحة عند 37 درجة مئوية كل دقيقتين لمدة 1 ساعة (λعلى سبيل المثال: 485 نانومتر ؛ λem: 535 نانومتر) لمراقبة الانقسام.
ملاحظة: استخدم الأطوال الموجية المناسبة للإثارة والانبعاث لأزواج الفلوروفور والتبريد المحددة. في حالة هذه الدراسة ، تم تعيين المعلمات (λعلى سبيل المثال: 485 نانومتر و λem: 535 نانومتر) لفلوروفور FAM. - لتحليل بيانات قياس الفلورسنت ، استخدم حزمة Python (انظر جدول المواد) لتحليل حركية الإنزيم المتاح في https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. يحسب هذا البرنامج النصي سرعة التفاعل الأولي (V0) باستخدام ميل الملاءمة الخطية لأول 8-10 نقاط زمنية أولية.
- في صفيحة 384 بئرا ، أضف 5 ميكرولتر ، 6 ميكرومتر من مجسات الركيزة الببتيد القائمة على FRET إلى كل بئر. لكل مسبار ، قم بإجراء التفاعل في ثلاث نسخ.
2. صياغة المستشعر والتوصيف
- توليف اقتران الحمض النووي والببتيد المنشط بالبروتياز (PAP).
- احتضان مراسلي الحمض النووي الفسفوري 20 مير مع مجموعة 3'-DBCO (1.1 مكافئ ، انظر جدول المواد) مع PAPs المنتهية بالأزيد مع نهاية السيستين C-terminus في 100 mM فوسفات عازلة (درجة الحموضة 7.0) في درجة حرارة الغرفة لمدة >4 ساعة. في حالة المغادرة طوال الليل ، احتضان عند 4 درجات مئوية.
- قم بتنقية المنتج على نظام كروماتوغرافيا سائلة عالي الأداء (HPLC) مزود بعمود مثالي للجزيئات الحيوية (انظر جدول المواد). اضبط تدرج HPLC ليبدأ من 5٪ A buffer (0.05٪ TFA في H2O) ، وحافظ على متساوي القراط لمدة 20 دقيقة ، ووصل إلى 80٪ B buffer (0.05٪ TFA ، 99.95٪ acetonitrile) عند 65 دقيقة بمعدل تدفق 0.3 مل min-1 ، واجمع المنتج المترافق مع وقت الاحتفاظ عند ~ 31 دقيقة.
- التحقق من صحة الاتحادات المنقاة بواسطة مطياف الكتلة بالليزر بمساعدة المصفوفة / وقت التأين للطيران (MALDI-TOF) باستخدام حمض α-cyano-4-hydroxycinnamic كمصفوفة14 (انظر جدول المواد).
- توليف أجهزة الاستشعار النانوية القائمة على النشاط المشفرة بالحمض النووي.
- قم بإذابة 2 ملغ من PEG متعدد التكافؤ (40 كيلو دالتون ، 8 أذرع ، انظر جدول المواد) مع مجموعة تفاعل ماليميد في 1 مل من 100 مللي متر فوسفات عازلة (درجة الحموضة 7.0) ومرشح (قطع: 0.2 ميكرومتر).
- أضف اتحادات ببتيد الحمض النووي المنتهي بالسيستين (2 مكافئ ، انظر جدول المواد) إلى PEG وتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة >4 ساعات. في حالة المغادرة طوال الليل ، احتضان عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المواد غير المقترنة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع عمود مصفوفة مركب ديكستران - أغاروز متاح تجاريا على كروماتوغرافيا سائلة سريعة البروتين (FPLC) (انظر جدول المواد). قم بتشغيل العينات في PBS ومراقبة الامتصاص عند 260 نانومتر للحمض النووي و 280 نانومتر للببتيد.
- ركز المستشعرات النانوية المركبة بأنابيب ترشيح الطرد المركزي (MWCO = 10 كيلو دالتون) وفقا للسرعة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- حدد تركيز الحمض النووي باستخدام مجموعة مقايسة ssDNA (انظر جدول المواد) وقارئ لوحة عند λعلى سبيل المثال: 485 نانومتر و λem: 535 نانومتر. قم بتخزين المستشعرات النانوية في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- توصيف أجهزة الاستشعار النانوية القائمة على النشاط المشفرة بالحمض النووي.
- قياس حجم الجسيمات الهيدروديناميكية لأجهزة الاستشعار النانوية المشفرة بالحمض النووي عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS).
ملاحظة: نطاق الحجم المتوقع لأجهزة الاستشعار النانوية هو 15-50 نانومتر ، بمتوسط حجم 20-30 نانومتر. إذا كانت هناك رغبة في نطاق حجم محدود ، يمكن استخدام FPLC (في الخطوة 2.3) لعزل الكسور الأضيق ذات الأوزان الجزيئية المختلفة. - ركز المستشعرات النانوية إلى 0.5 مجم / مل (حسب تركيز الحمض النووي) باستخدام أنابيب مرشح الطرد المركزي (MWCO = 10 كيلو دالتون) وقم بتحميل العينات على شبكة نحاسية مغلفة بغشاء الكربون مثبتة على حامل تبريد. راقب التشكل باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ المبرد (200 كيلو فولت ، تكبير 10000-60000)14.
- قياس حجم الجسيمات الهيدروديناميكية لأجهزة الاستشعار النانوية المشفرة بالحمض النووي عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS).
3. حقن الاستشعار وجمع البول
- جمع البول لقياس خط الأساس.
- ضع الماوس في غرفة سكن مخصصة (انظر الشكل التكميلي 1) مع لوحة 96 بئرا كقاعدة.
- قم بتقييد الماوس واضغط برفق على المثانة لإفراغ أي بول متبقي على اللوحة.
- ماصة البول الذي تم جمعه (~ 100-200 ميكرولتر) من لوحة 96 بئر في أنبوب 1.5 مل بعد استبدال الماوس إلى السكن الطبيعي.
- إنشاء نموذج ورم الفئران قبل السريرية.
- تلقيح إناث الفئران BALB / c البالغة من العمر 6 إلى 8 أسابيع عن طريق الحقن في الوريد بخط خلايا MC26-Fluc الذي يعبر عن luciferase (100 ألف خلية / فأر) (انظر جدول المواد). راقب تطور الورم أسبوعيا باستخدام نظام التصوير الفلوري في الجسم الحي .
ملاحظة: يحدث عبء الورم المرئي المشار إليه بإشارة الإنارة تقريبا في الأسبوع 2 من حقن خط الخلية هذا. تحقق بعناية من الحاملة للورم أثناء تطور الورم على أساس منتظم.
- تلقيح إناث الفئران BALB / c البالغة من العمر 6 إلى 8 أسابيع عن طريق الحقن في الوريد بخط خلايا MC26-Fluc الذي يعبر عن luciferase (100 ألف خلية / فأر) (انظر جدول المواد). راقب تطور الورم أسبوعيا باستخدام نظام التصوير الفلوري في الجسم الحي .
- حقن أجهزة الاستشعار النانوية في نقاط زمنية مختلفة بعد زرع الورم.
- تحضير محلول حقن (200 ميكرولتر كحد أقصى) يحتوي على مستشعرات نانوية بتركيز 1 نانومول بواسطة الباركود DNA في PBS المعقم.
- حقن محلول مستشعر 200 ميكرولتر في PBS في كل فأر تجريبي عن طريق الوريد.
- اجمع عينات البول من الفئران الضابطة السليمة والفئران الحاملة للورم في ساعة واحدة بعد حقن المستشعر كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.3.
ملاحظة: يمكن معالجة عينات البول الطازجة لتحليل الباركود الحمض النووي مباشرة أو تجميدها على الفور على الجليد.
4. كشف كريسبر للرموز الشريطية للحمض النووي: قائم على التألق
- استخدم عينات البول الطازجة أو تذويب العينات المجمدة على الجليد. عينات بول الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- ادمج الكواشف في الجدول التكميلي 2 ، وأضف إنزيم Cas12a (انظر جدول المواد) أخيرا واخلط التفاعل برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بتشغيل رد فعل المراسل ، كما هو موضح في الجدول التكميلي 3 ، في ثلاث نسخ باستخدام حاصل ضرب الخطوة 2. أضف رد الفعل من الخطوة 2 أخيرا وانقله بسرعة إلى قارئ اللوحة.
- اكتشف تنشيط LbaCas12a عن طريق قياس التألق باستخدام قارئ لوحة عند 37 درجة مئوية كل دقيقتين لمدة 3 ساعات (λعلى سبيل المثال: 485 نانومتر و λem: 535 نانومتر) لمراقبة حركية الانقسام لمراسل الحمض النووي.
- لتحليل بيانات قياس الفلورسنت ، استخدم حزمة Python لتحليل حركية الإنزيم المتوفرة في https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. يحسب هذا البرنامج النصي سرعة التفاعل الأولي (V0) باستخدام ميل الملاءمة الخطية لأول 8-10 نقاط زمنية أولية.
5. كشف كريسبر للرموز الشريطية للحمض النووي: الورقي
- عينات بول الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: قم بتشغيل عينات البول للكشف عن كريسبر القائم على التألق والورقي بالتوازي. - الجمع بين الكواشف في الجدول التكميلي 2. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: خطوة الحضانة هذه مطابقة لتلك الخاصة باكتشاف كريسبر القائم على التألق. - قم بتشغيل رد فعل المراسل باستخدام مراسل الحمض النووي المسمى FAM-biotin لمقايسة التدفق الجانبي على شريط ورقي (انظر جدول المواد). اجمع الكواشف في الجدول التكميلي 4 في صفيحة من 96 بئرا باستخدام ناتج الخطوة 2. يغطى بورق الألمنيوم ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: حدد وقت الحضانة الأمثل وفقا لمراقبة الحركية في الوقت الفعلي في اختبار الكشف عن كريسبر القائم على التألق الموصوف أعلاه. - إلى بئر جديد من صفيحة 96 بئرا ، أضف 80 ميكرولتر من PBS. أضف 20 ميكرولتر من العينة من الخطوة 3 إلى هذا البئر.
- ضع شريطا ورقيا جانبيا للتدفق على كل بئر وانتظر حتى يصل السائل إلى أعلى الشريط (<5 دقيقة). ابحث عن مظهر شريط (أربطة) التحكم و/أو العينة على شريط الورق.
- التقط صورة لشريط التدفق الجانبي وحدد شدة النطاق باستخدام ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ترشيح ركائز الببتيد المنشط بالبروتياز
لتصميم أجهزة استشعار تعكس التغيرات في النشاط المحلل للبروتين للأنسجة ، يتم تمييز نشاط الأنزيم البروتيني في الأنسجة أولا باستخدام مكتبة من مجسات الببتيد13 (الشكل 1). يمكن أن توفر عينات الأنسجة الطازجة والمجمدة معلومات جوهرية حول النشاط المحلل للبروتين للبيئة المكروية للورم من خلال الجمع بين عينات الأنسجة وتحقيقات FRET المصممة للكشف عن انقسام الركيزة. يتم تحضين مكتبة من مجسات FRET مع فلوروفور FAM و CPQ-2 مع عينات الأنسجة. يتم اختيار المجسات ذات الاختلاف الأكبر في معدل الانقسام بين الأنسجة الوهمية وأنسجة الورم ، كما تم قياسها بواسطة القياس الطيفي الفلوري ، كروابط ببتيد لاستخدامها في أجهزة الاستشعار النانوية في الجسم الحي (الشكل 1 أ). لفهم فسيولوجيا بيئة الورم بشكل أفضل ومقارنة ملفات تعريف تعبير الأنزيم البروتيني بشكل فعال بملفات تعريف النشاط ، يمكن تحضين مجسات FRET بالبروتياز المؤتلف لربط انقسام الركيزة بنشاط بروتياز محدد ، كما هو موضح في مثالين من المجسين في الشكل 1 ب.
صياغة المستشعر وتوصيفه
تتكون المستشعرات النانوية من نواة بوليمرية، وببتيدات، ورموز شريطية أحادية الشريط من الحمض النووي (DNA)، كما هو موضح في الشكل 2 أ. النوى البوليمرية هي 40 كيلو دالتون ، تغصنات PEG التي تعمل كناقلات لما يصل إلى 8 اتحادات الببتيد والحمض النووي (الشكل 2 ب). تربط الببتيدات ، ~ 1.4 كيلو دالتون ، القلب والحمض النووي بتسلسل الأحماض الأمينية المصمم ليتم شقه من خلال النشاط المحلل للبروتين. يبلغ طول الباركود DNA أحادي الشريط 20 زوجا أساسيا ، ~ 6.8 كيلو دالتون ، ويتم تعديله كيميائيا لتحسين الاستقرار في الجسم الحي. بعد الاقتران ، يتم تنقية بنية الببتيد والحمض النووي عبر HPLC ، مما يسمح بفصل المكونات المترافقة والحرة (الشكل 2C). يشير تحليل قياس الطيف الكتلي إلى أن المترافق له وزن جزيئي يبلغ 8.283 كيلو دالتون ، وهو أمر متوقع بالنظر إلى الأوزان الجزيئية المكونة للببتيد والباركود DNA البالغ 1.4 كيلو دالتون و 6.8 كيلو دالتون على التوالي. يقترن اقتران الببتيد والحمض النووي (DNA) أيضا ب PEG dendrimer. يتم تنقية المستشعر الناتج باستخدام FPLC لإزالة الحمض النووي الببتيد الحر الذي يظهر وقت احتفاظ طويل مقارنة بتلك PEGylated (الشكل 2D). يمكن تمييز حجم المستشعر عن طريق تشتت الضوء الديناميكي والمجهر الإلكتروني للانتقال المبرد ، مما يشير إلى زيادة في القطر بعد إضافة الببتيد - الحمض النووي إلى القلب من ~ 8 نانومتر إلى ~ 20 نانومتر (الشكل 2 ب). قد يكون التباين في حجم الجسيمات بسبب مرونة السلاسل المكونة وعدد متغير من أذرع الببتيد والحمض النووي المترافقة مع كل شجيرة PEG.
نموذج مرض الفئران قبل السريري
يتضمن العمل في الجسم الحي لاختبار المستشعرات إنشاء أورام لمدة 3 أسابيع في رئتي الفئران BALB / c ، وحقن المستشعرات النانوية ، وجمع البول بعد 1 ساعة من حقن المستشعر (الشكل 3 أ). يتم أيضا أخذ عينة بول أساسية قبل تلقيح الورم لمقارنتها بالعينات بعد تحريض المرض. من أجل تقييم فعالية المستشعر في الكشف عن الأورام الخبيثة ، يتم حقن خط خلايا سرطان القولون والمستقيم MC26 (MC26-Fluc) عن طريق الوريد ، مما يؤدي إلى ظهور عقيدات ورم الرئة في تصوير التلألؤ في الجسم الحي. يكشف تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين13 عن التشريح المرضي لأنسجة الرئة من الفئران الحاملة للورم والفئران الوهمية ، على التوالي ، ودليل على تكوين الورم في 11 و 21 يوما بعد الحقن ، كما هو موضح بالأسهم السوداء في الشكل 3 ب.
تنشيط كريسبر بواسطة الحمض النووي المستقر كيميائيا
لتحسين تنشيط Cas12a عبر الرموز الشريطية ssDNA واقتران crRNA التكميلي ، تم اختبار تسلسلات وأطوال قليلة النوكليوتيدات المختلفة. يتم تقييم تنشيط Cas12a عن طريق قياس الزيادة في التألق بمرور الوقت بسبب انشقاق Cas12a لمراسل الحمض النووي للمارة مع اقتران FRET. ترتبط الزيادة في معدل الانقسام بتركيزات أعلى من الباركود ssDNA المعدل كيميائيا ، كما هو موضح مع زوج crRNA / الباركود التمثيلي (الشكل 4B). الأهم من ذلك ، أن العلاقة الخطية بين التركيز والتنشيط ، كما هو موضح في الشكل 4 ب ، تمكن القراءة من أن تكون انعكاسا لوجود الباركود للحمض النووي في البول وتعكس بشكل غير مباشر النشاط المحلل للبروتين في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام تسلسلات crRNA المختلفة المتعددة ، كما هو مفصل في الجدول التكميلي 1 ، لتنشيط Cas12a ، وهو أمر بالغ الأهمية لتمكين تعدد الإرسال. تم اختيار منشطات الحمض النووي لبناء أجهزة استشعار في الجسم الحي بناء على تشابهها في أداء الفحص. أظهر ssDNA المعدل كيميائيا والذي يعد أمرا بالغ الأهمية لاستقرار العلامة الحيوية الاصطناعية في الجسم الحي تنشيط Cas12a ، مقارنة ب dsDNA و ssDNA غير المعدل (الشكل 4C).
الكشف البولي المتعدد للرموز الشريطية للحمض النووي المستقر كيميائيا
تم التحقق من العديد من أزواج منشط الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) المعدلة بواسطة crRNA من حيث تعامدها بين التسلسلات المختلفة. يسمح هذا بالقراءة المتزامنة في مقايسات الآبار المتعددة ، كما هو موضح في الشكل 5 أ. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن جزيئات الحمض النووي المعدلة في البول غير المعالج باستخدام قراءات لونية على شرائط ورقية ذات تدفق جانبي، كما هو موضح في الشكل 5 ب. يشير وجود "نطاق العينة" الرئيسي إلى إطلاق FAM القابل للكشف من خلال انشقاق المراسل بعد تشغيل Cas12a بواسطة الحمض النووي البولي. عندما يتم تنشيط Cas12a بواسطة منشط الحمض النووي في بول الفأر ، فإنه يشق مراسل قليل النوكليوتيد المقترن بالفلوريسئين (FAM) ، ويطلق جزيء FAM ، والذي يمكن اكتشافه بعد ذلك على "نطاق العينة". يتم التقاط المراسلين غير المشقوق على "شريط التحكم" بسبب ارتباط البيوتين بالستربتافيدين. يتم اختيار أجهزة الاستشعار النانوية للتجارب في الجسم الحي ويتم إنشاؤها باستخدام الببتيدات القابلة للتنشيط بالبروتياز والرموز الشريطية المميزة للحمض النووي. يتم ترشيح الببتيدات من خلال تنميط الأنسجة خارج الجسم الحي (الشكل 1 أ) ويتم اختيار الرموز الشريطية للحمض النووي بناء على تنشيط Cas12a مماثل (الشكل 4 ب).
الشكل 1: تحديد ركائز الببتيد التي تنشطها البروتياز غير المنظمة في سرطان القولون والمستقيم لبناء المستشعر. (أ) يتم فحص ركائز الببتيد المقترنة بالحنق ، والتي يتكون كل منها من تسلسل ببتيد محاط بفلوروفور FAM وجهاز إخماد CPQ-2 ، ضد الإنزيمات المحللة للبروتين المؤتلف أو متجانسات الأنسجة. (ب) حركية انقسام البروتياز التمثيلي لركائز الببتيد المقترنة ب FRET (المسبار 1 و 2). الشكل مقتبس من Hao et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توصيف المستشعر النانوي القائم على النشاط المشفر بالحمض النووي (DNA) مع نواة PEG البوليمرية. (أ) تشتمل المستشعرات النانوية المشفرة بالحمض النووي على حامل نانوي بوليمري (8 أذرع PEG) يعمل مع ببتيدات نشطة بالبروتياز مشفرة بقليل النيوكليوتيدات. (ب) يظهر تحليل تشتت الضوء الديناميكي زيادة في حجم الجسيمات من 8.3 نانومتر (قلب PEG فقط) و 13 نانومتر (مستشعر وظيفي). (ج) تنقية HPLC لاقتران الببتيد والحمض النووي (DNA). يتم تحليل المرافق في قياس الطيف الكتلي ويظهر الوزن الجزيئي المتوقع. (د) تظهر تنقية FPLC للمستشعر انفصال المستشعر الوظيفي واقتران الببتيد والحمض النووي غير المحدود. الشكل مقتبس من Hao et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحريض المرض في الجسم الحي واستخدام المستشعر. (أ) الجدول الزمني لمراقبة الورم الطولي باستخدام مستشعر نانوي في نقاط زمنية مختلفة خلال تطور الورم. (ب) تلطيخ الرئة النسيجي للفئران BALB / c الحاملة لأورام الرئة CRC في 11 و 21 يوما بعد تلقيح الورم والفئران الضابطة الشامية المحقونة بالمحلول الملحي. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. تم إصلاح الأعضاء ، جزءا لا يتجزأ من البارافين ، وملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين. أجريت الدراسة باستخدام n = 3 فئران لكل نقطة زمنية وتم عرض صور من تمثيلي. تشير الأسهم إلى عقيدات الورم في الرئة. الشكل مقتبس من Hao et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تنشيط Cas12a بواسطة منشطات الحمض النووي المستقرة كيميائيا. (أ) يؤدي تنشيط Cas12a بواسطة رمز شريطي ssDNA تمثيلي من خلال الارتباط مع crRNA التكميلي إلى انقسام الحمض النووي للمارة بطريقة تعتمد على الجرعة ، كما تم قياسها بكثافة مضان عبر مقياس الطيف الضوئي. (ب) يتم تحديد سرعة التفاعل الابتدائية (V0) من ميل المنحنى في بداية التفاعل في (A) ويتم رسمها لتحديد النطاق الخطي لأداء الفحص. (ج) تنشيط Cas12a بواسطة منشطات الحمض النووي مزدوجة الشريط وأحادية الشريط والمعدلة كيميائيا. الشكل مقتبس من Hao et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: قراءات الباركود للحمض النووي بوساطة CRISPR-Cas12 متعددة الإرسال مع خيارين للكشف. (أ) يتم تحديد معدلات الانقسام العابر ل Cas12a عند تنشيط أزواج مختلفة من منشط ssDNA المعدل - crRNA في مقايسة الانقسام الفلوري Cas12a. يتم إجراء المقايسات مع عينات البول التي تم جمعها من الفئران المحقونة ب 1 نانومول من منشط ssDNA المعدل بعد 1 ساعة من إعطاء الوريد. الشكل مقتبس من Hao et al.13. (ب) تظهر قراءات الورق لعينة البول المنشطة Cas12a مع تغيرات لونية في مواقع مختلفة من الشريط الورقي. الفرقة العلوية من مراسل الحمض النووي FAM المشقوق والشريط السفلي من مراسل FAM-biotin غير المشقوق . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: غرفة جمع البول لوضعها فوق صفيحة من 96 بئرا. يتم وضع الماوس مؤقتا داخل الأسطوانة للتبول في لوحة 96 بئرا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: تسلسل الأوليغو والببتيد لصياغة أجهزة الاستشعار ومقايسة كريسبر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 2: الكواشف ل Cas12a القائم على التألق والورق وتفاعل عينة البول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 3: كواشف تفاعل المراسل للكشف عن كريسبر القائم على التألق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 4: كواشف رد فعل المراسل للكشف الورقي عن كريسبر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تظهر هنا منصة قابلة للتخصيص بدرجة كبيرة للكشف عن السرطان متعدد الإرسال مع اختبار بول محمول يقيم النشاط المحلل للبروتين المرتبط بالمرض باستخدام مستشعر حقن طفيف التوغل. عند تنشيطه بواسطة البروتياز الورمي ، يتم تضخيم انقسام الركيزة الببتيد عن طريق إطلاق الباركود DNA في البول. يمكن قراءة مراسلي الحمض النووي الاصطناعي في عينة البول عن طريق تضخيم إنزيمي ثانوي بوساطة كريسبر-كاس باستخدام الكشف الفلورومتري أو اختبار ورقي بسيط. يعد الترميز الشريطي للحمض النووي طريقة جذابة لوضع العلامات الحيوية الاصطناعية لتحمل تعدد الإرسال. يعد تحسين استقرار الرموز الشريطية للحمض النووي من خلال التعديل الكيميائي أمرا ضروريا للحفاظ على استقرار أجهزة الاستشعار النانوية في الجسم الحي. على وجه التحديد ، يمكن تنشيط اكتشاف الباركود للحمض النووي عبر CRISPR-Cas12a باستخدام الرموز الشريطية للحمض النووي المعدلة بالكامل بالفوسفورثيوات مع عمود فقري ثابت. يقلل التعديل الكيميائي من سرعة تنشيط CRISPR-Cas12a مقارنة بنظيره الأصلي من الحمض النووي ، نظرا لزيادة ثباته. علاوة على ذلك ، قد يؤدي إدخال تعديلات طرفية على crRNA أو اختبار قليل النيوكليوتيدات المعدلة المختلفة في الرموز الشريطية للحمض النووي إلى زيادة حساسية اكتشاف الباركود DNA بوساطةكريسبر 15 ، وبالتالي تحسين حد الكشف (LOD) لتشخيص السرطان.
بالإضافة إلى التضخيم الجزيئي ، هناك استراتيجية رئيسية أخرى لتحقيق LOD المطلوبة للكشف المبكر عن السرطان تتضمن الاستفادة من ترشيح الحجم عن طريق الكلى لتركيز مراسلي الحمض النووي الاصطناعي في البول. تحقيقا لهذه الغاية ، من الأهمية بمكان تحسين حجم الرموز الشريطية للحمض النووي. أظهر الحمض النووي المكمل ل 20-mer crRNA قراءات الباركود المثلى للحمض النووي بوساطة CRISPR-Cas12a من عينات البول. قد يختلف هذا الطول الأمثل عند تطبيقه على نيوكليازات كريسبر المختلفة أو النماذج الحيوانية قبل السريرية.
للحفاظ على قابلية استنساخ نظام الكشف هذا ، من المهم إجراء توصيف شامل لأجهزة الاستشعار النانوية القابلة للحقن لتقليل التباين من دفعة إلى أخرى. سيؤدي الاختلاف في عدد اتحادات الببتيد والحمض النووي لكل نواة إلى تغيير كمية الرموز الشريطية للحمض النووي التي يتم إطلاقها في البول وبالتالي يؤثر على القراءة النهائية. وبالمثل ، فإن الحقن الدقيق للمستشعر عن طريق الوريد سيساعد على الاتساق في جرعات المستشعر. من أجل ضمان جمع البول المناسب لما لا يقل عن 50 ميكرولتر من حجم البول من كل حيوان في نقطة زمنية معينة ، فإن الحفاظ على ترطيب الحيوانات الحاملة للورم أمر بالغ الأهمية. يمكن دعم ذلك عن طريق إبقاء الفئران على هلام ماء غير مبلل أو حقن برنامج تلفزيوني تحت الجلد قبل ساعة واحدة من جمع البول16.
يعد توقيت جمع البول ومدة قراءة الباركود للحمض النووي بوساطة كريسبر-كاس من العوامل الحاسمة لاتساق المقايسة. تخضع الرموز الشريطية المتداولة لتسوس تركيز أسي واحد مميز بعد الحقن في الوريد والترشيح الكلوي المعتمد على الحجم من الدم ، وتبلغ ذروتها بعد 1 ساعة من تناولها في نماذج الفئران13. قد تختلف هذه النقطة الزمنية في نموذج حيواني مختلف. بالنسبة لتنسيقي القراءة لمقايسات تنشيط CRISPR-Cas (مقايسة التدفق الجانبي الفلوري مقابل الورقي) ، من المهم تتبع الحركية القائمة على التألق قبل التدفق الجانبي ، مما يسمح بنقطة النهاية المثلى لقراءة منتج الانقسام CRISPR-Cas.
هذا النهج مفيد بسبب دمج خطوات تضخيم الإشارة المزدوجة من التنشيط الأنزيمي بوساطة CRISPR-Cas والتحليل البروتيني ، والقدرة على تعدد الإرسال لالتقاط تعقيد المرض. سيتطلب توسيع تعدد إرسال المستشعرات جرعات مواد دقيقة بالإضافة إلى توسيع إنتاجية القراءة للحفاظ على قابلية النقل وسهولة الاستخدام. تتطلب هذه الاستراتيجية توصيفا شاملا لنشاط الأنزيم البروتيني في نماذج متعددة وخصوصية الملف الشخصي للبروتين تجاه مرض معين ، أو مرحلة مرض. علاوة على ذلك ، في حين أن حقن المستشعر أقل توغلا من العديد من البدائل التشخيصية مثل الخزعة ، فقد يعتمد الحقن في الوريد على أخصائيي الفصد المدربين لإدارة المستشعر ، مما قد يحد من حالة الاستخدام لمراقبة المرض بدلا من الكشف الأولي في بيئة سريرية. بالإضافة إلى الحقن الجهازي ، يمكن هندسة المستشعرات النانوية المشفرة بالحمض النووي بتركيبات يمكن تطبيقها عن طريق التوصيل الفموي والاستنشاقي والموضعي غير الباضع ، للسماح بالكشف عن الأمراض المحمولة والمراقبة الذاتية السهلة لتطور المرض وتقييم العلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.N.B. ، L.H. ، و R.T.Z. مدرجة كمخترعين في طلب براءة يتعلق بمحتوى هذا العمل. تمتلك S.N.B. أسهما في Glympse Bio و Satellite Bio و Lisata Therapeutics و Port Therapeutics و Intergalactic Therapeutics و Matrisome Bio وهي مديرة في Vertex. يقدم استشارات لشركة Moderna ، ويتلقى تمويلا بحثيا برعاية من Johnson &Johnson و Revitope و Owlstone.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منحة دعم معهد كوخ رقم P30-CA14051 من المعهد الوطني للسرطان (مركز سوانسون للتكنولوجيا الحيوية) ، ومنحة المركز الأساسية P30-ES002109 من المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية ، ومركز الرخام لمعهد كوخ للطب النانوي للسرطان ، وبرنامج أبحاث معهد كوخ الحدودي عبر صندوق كاثي وكيرت ماربل لأبحاث السرطان ، وصندوق فرجينيا ودي كي لودفيج لأبحاث السرطان. يتم دعم A.E.V.H. من خلال زمالة تدريب ما قبل الدكتوراه الممولة من المعاهد الوطنية للصحة (T32GM130546). S.N.B. هو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي. يتم دعم L.H. بجائزة K99 / R00 Pathway to Independence من المعهد الوطني للسرطان وتمويل بدء التشغيل من جامعة بوسطن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
- Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
- Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities. ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).
- Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).
- Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. Harnessing protease activity to improve cancer care. Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).
- Hanahan, D.
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Kwong, G. A., et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).
- Kirkpatrick, J. D., et al. Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling. Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).
- Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).
- Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Choi, H. S., et al.
- Hao, L., et al. CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics. Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).
- Hao, L., et al.
- Ghanta, K. S., et al. 5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing. Elife. 10, e72216 (2021).
- Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. Dehydration parameters and standards for laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).
