Summary
Denne protokol beskriver en CRISPR-Cas-medieret, multianalyt syntetisk urinbiomarkørtest, der muliggør kræftdiagnostik på behandlingsstedet gennem ex vivo-analyse af tumorassocierede proteaseaktiviteter.
Abstract
Oprettelse af syntetiske biomarkører til udvikling af præcisionsdiagnostik har muliggjort påvisning af sygdom gennem veje ud over dem, der anvendes til traditionelle biofluidmålinger. Syntetiske biomarkører gør generelt brug af reportere, der giver læsbare signaler i biofluidet for at afspejle de biokemiske ændringer i det lokale sygdomsmikromiljø under sygdomsforekomst og progression. Den farmakokinetiske koncentration af indberetterne og biokemisk amplifikation af sygdomssignalet er afgørende for at opnå høj følsomhed og specificitet i en diagnostisk test. Her er en kræftdiagnostisk platform bygget ved hjælp af et format af syntetiske biomarkører: aktivitetsbaserede nanosensorer, der bærer kemisk stabiliserede DNA-reportere, der kan frigøres ved afvigende proteolytiske signaturer i tumormikromiljøet. Syntetisk DNA som sygdomsreporter giver multiplexeringsevne gennem dets anvendelse som stregkode, hvilket giver mulighed for aflæsning af flere proteolytiske signaturer på én gang. DNA-reportere frigivet i urinen detekteres ved hjælp af CRISPR-nukleaser via hybridisering med CRISPR-RNA'er, som igen producerer et fluorescerende eller kolorimetrisk signal ved enzymaktivering. I denne protokol konstrueres DNA-stregkodede, aktivitetsbaserede nanosensorer, og deres anvendelse er eksemplificeret i en præklinisk musemodel af metastatisk kolorektal cancer. Dette system er meget modificerbart i henhold til sygdomsbiologi og genererer flere sygdomssignaler samtidigt, hvilket giver en omfattende forståelse af sygdomsegenskaberne gennem en minimalt invasiv proces, der kun kræver nanosensoradministration, urinindsamling og en papirtest, der muliggør diagnostik på behandlingsstedet.
Introduction
På trods af den betydelige indsats for at identificere tumorbiomarkører såsom skurproteiner og DNA er det kræftdiagnostiske felt blevet belastet af deres lave overflod eller hurtige nedbrydning i cirkulation1. Som en komplementær strategi repræsenterer biomanipulerede syntetiske biomarkører, der selektivt reagerer på sygdomstræk for at generere forstærkede signaler, nye veje mod nøjagtig og tilgængelig diagnostik 2,3. For at hjælpe detektion udnytter disse syntetiske biomarkører tumorafhængige aktiveringsmekanismer såsom enzymatisk amplifikation til at producere analysander med forbedret signal-støj-forhold4. Heri udnyttes en klasse af kræftassocierede enzymer, proteaser, til at aktivere injicerbare nanoskalasensorer for at frigive sygdomsrapporterere, der kan påvises fra biofluiderne såsom blod eller urin 5,6. I lyset af tumorheterogenitet giver udviklingen af et panel af proteaseaktiverede sensorer mulighed for multianalyttest, der kombinerer forskellige proteasespaltningshændelser til en 'sygdomssignatur' for at vurdere kræftforekomst og progression på en mere specifik, multiplekset måde.
Proteaseaktiverede syntetiske biomarkører er blevet udviklet, der omfatter peptidsubstrater konjugeret til overfladen af en inert bærer7. Når de injiceres in vivo, transporteres disse peptider til tumoren, hvorefter enzymatisk spaltning af tumorproteaser frigiver reportere i blod eller urin til påvisning. Multiplexed detektion med proteaseaktiverede syntetiske biomarkører kræver, at hver syntetisk biomarkør i en cocktail mærkes med en unik molekylær stregkode. Til dette formål er der udviklet forskellige tilgange, herunder massestregkoder og ligandkodede reportere 8,9,10. I modsætning til disse multiplexeringsmetoder, som kan være begrænset til nogle få forskellige signalmuligheder, giver DNA-stregkodning mange flere kombinationer i overensstemmelse med den høje kompleksitet og heterogenitet af menneskelige sygdomstilstande. For at udvide mangfoldigheden af syntetiske biomarkører stregkodes sensorerne ved at mærke hver reporter med en unik DNA-sekvens til detektion via CRISPR-Cas-nuklease for at forstærke det biofluidiske signal ex vivo. Disse enkeltstrengede DNA-stregkoder (ssDNA) er designet til at binde til komplementære CRISPR-guide-RNA'er (crRNA'er) og aktivere den måludløste sikkerhedsnukleaseaktivitet af CRISPR-Cas12a11. Denne nukleaseaktivitet kan anvendes til at spalte en reporter-DNA-streng detekteret gennem fluorescenskinetik eller ved hjælp af papirstrimler.
Ud over molekylær amplifikation via proteaser (in vivo) og CRISPR-Cas (ex vivo) involverer et andet centralt designtræk ved proteaseaktiverede syntetiske biomarkører udnyttelse af nanomaterialefarmakokinetik til at øge diagnostisk signalkoncentration i biofluider10. En tilgang er brugen af en nanopartikelbærer til at øge cirkulationstiden for overfladekonjugerede peptidsubstrater. En polyethylenglycol (PEG) dendrimer vælges som en nanocarrier med relativt lille hydrodynamisk diameter og multivalens for at øge leveringen til tumorer. Selvom den er lille nok til at fremme tumorlevering, er størrelsen af PEG-bæreren større end ~ 5 nm-størrelsesafskæringen af nyreglomerulær filtreringsbarriere, således at kun spaltede peptidsubstrater kan ryddes ind i urinen og drage fordel af størrelsesfiltrering af nyrerne12. I denne protokol skitseres flertrinsarbejdsgangen for syntese og anvendelse af DNA-stregkodede aktivitetsbaserede nanosensorer i en præklinisk murinmodel, der fremhæver opsætningen af den CRISPR-Cas-medierede, multianalysand syntetiske urinbiomarkørtest, som er blevet anvendt af denne gruppe til at klassificere sygdomsstatus i murine modeller af flere kræfttyper13. På grund af det alsidige designprincip kan alle tre funktionelle komponenter i nanosensoren - nanobæreren (PEG-polymeren), det stimuli-responsive modul (proteaseaktiveret substrat) og den biofluidiske reporter (DNA-stregkode) - udskiftes præcist i henhold til applikationsspecifikke behov, hvilket giver mulighed for modularitet ved at skræddersy mål- og frigivelsesspecifikationerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på forfatterinstitutionen. Standard dyreplejefaciliteter, herunder boligkamre, sterile hætter, bedøvelse og etisk slutpunktsaflivning, er nødvendige for korrekt udførelse af disse eksperimenter. Alle forsøg udføres i overensstemmelse med institutionelle og nationale retningslinjer og overvåges af institutionens dyrlægepersonale. Kvindelige BALB / c-mus, der anvendes til forsøgene, fås fra en kommerciel kilde (se materialetabel) og varierede i alderen fra 6 til 8 uger ved undersøgelsens start. Sekvenser for specialsyntetiserede DNA-, crRNA-, FRET-baserede peptidsubstratsonder og sensorpeptider er angivet i supplerende tabel 1.
1. Valg af proteaseaktiveret peptidsubstrat
- Indsamle og forberede vævsprøver fra sundt lunge- eller lungevæv med tumorknuder efter en tidligere offentliggjort rapport13.
- Homogeniser væv i forkølet fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,4) (200 mg væv/ml PBS) med vævsdissociationsrør til automatiseret dissociation af væv i enkeltcellesuspensioner.
- Centrifugeringsvævshomogenater ved 6.000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten opbevares i et nyt glas.
- Supernatanten centrifugeres ved 14.000 x g i 25 minutter ved 4 °C.
- Mål proteinkoncentrationen ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA) proteinanalysesæt (se materialetabel).
- Der tilsættes PBS til prøven for at fremstille en 0,33 mg/ml opløsning.
- Vurder den proteolytiske aktivitet ved at følge nedenstående trin.
- I en 384-brønds plade tilsættes 5 μL, 6 μM FRET-baserede peptidsubstratsonder til hvert hul. For hver sonde udføres reaktionen i tre eksemplarer.
BEMÆRK: FRET-baseret peptidsubstratsonde indeholder en kort peptidsekvens (6-8 aminosyrer, designet til at være specifik for en målprotease eller gruppe af proteaser) afsluttet med et fluorofor- og slukningspar. To FRET-sonder er beskrevet i supplerende tabel 1 som eksempel. Det fulde bibliotek af sonder findes i Hao et al.13. - Brøndpladen centrifugeres i 10 s ved stuetemperatur ved 180 x g for at sikre, at sonderne er i bunden af pladen.
- Der tilsættes 25 μL 0,33 mg/ml vævsprøve eller 40 μM rekombinant protease13 til hvert hul.
BEMÆRK: Den endelige koncentration af vævsprøven eller den rekombinante protease skal muligvis optimeres i henhold til deres iboende proteolytiske aktivitet. For eksempel kan stærkt proteolytisk væv såsom tarme kræve højere fortyndingsfaktorer for at muliggøre overvågning af indledende enzymatisk spaltning. - Brøndpladen centrifugeres kortvarigt ved 180 x g (ved stuetemperatur) for at blande sonderne og vævslysaterne.
- Detektering af sondeskaltning påbegyndes straks ved at måle fluorescens med pladelæseren ved 37 °C hvert 2. minut i 1 time (λex: 485 nm; λem: 535 nm) for at overvåge spaltningen.
BEMÆRK: Brug de passende excitations- og emissionsbølgelængder til specifikke fluorofor- og slukningspar. I forbindelse med denne undersøgelse indstilles parametre (λex: 485 nm og λem: 535 nm) for FAM-fluoroforen. - For at analysere fluorescerende måledata skal du bruge Python-pakken (se materialetabel) til enzymkinetisk analyse, der er tilgængelig på https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Dette script beregner den indledende reaktionshastighed (V0) ved hjælp af hældningen af den lineære tilpasning af de første 8-10 indledende tidspunkter.
- I en 384-brønds plade tilsættes 5 μL, 6 μM FRET-baserede peptidsubstratsonder til hvert hul. For hver sonde udføres reaktionen i tre eksemplarer.
2. Sensorformulering og karakterisering
- Syntetiser konjugatet af DNA og proteaseaktiveret peptid (PAP).
- Inkubere 20-mer phosphorotioerede DNA-reportere med 3'-DBCO-gruppe (1,1 ækv., se materialetabel) med azidterminerede PAP'er med C-terminuscysteinende i 100 mM fosfatbuffer (pH 7,0) ved stuetemperatur i >4 timer. Hvis de efterlades natten over, inkuberes ved 4 °C.
- Rens produktet på et højtydende væskekromatografisystem (HPLC) udstyret med en søjle, der er ideel til biomolekyler (se materialetabellen). Indstil HPLC-gradienten til at starte fra 5% A-buffer (0,05% TFA i H2O), hold isokratisk i 20 min, og nå 80% B-buffer (0,05% TFA, 99,95% acetonitril) ved 65 min med en strømningshastighed på 0,3 ml min-1, og opsaml konjugatproduktet med retentionstid på ~ 31 min.
- Validering af de oprensede konjugater ved matrixassisteret laserdesorption/ioniseringstid for flyvning (MALDI-TOF) massespektrometri ved anvendelse af α-cyano-4-hydroxycinnaminsyre som matrix14 (se materialetabel).
- Syntetisere de DNA-kodede aktivitetsbaserede nanosensorer.
- 2 mg multivalent PEG (40 kDa, 8-arm, se materialetabel) opløses med maleimid-reaktiv gruppe i 1 ml 100 mM fosfatbuffer (pH 7,0) og filter (afskæring: 0,2 μm).
- Tilsæt cysteinterminerede DNA-peptidkonjugater (2 eq., se materialetabel) til PEG og reager ved stuetemperatur i >4 timer. Hvis de efterlades natten over, inkuberes ved 4 °C.
- De ukonjugerede materialer fjernes ved hjælp af størrelsesekskluderingskromatografi med en kommercielt tilgængelig dextran-agarose-kompositmatrixkolonne på en hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC) (se materialetabel). Der køres prøver i PBS, og absorbansen overvåges ved 260 nm for DNA og 280 nm for peptid.
- Koncentrer de syntetiserede nanosensorer med centrifugalfilterrør (MWCO = 10 kDa) i henhold til producentens anbefalede hastighed (se materialetabel).
- Kvantificer koncentrationen af DNA ved hjælp af ssDNA-analysesæt (se materialetabel) og en pladelæser ved λex: 485 nm og λem: 535 nm. Nanosensorerne opbevares ved 4 °C.
- Karakterisere de DNA-kodede aktivitetsbaserede nanosensorer.
- Mål den hydrodynamiske partikelstørrelse af DNA-kodede nanosensorer ved dynamisk lysspredning (DLS).
BEMÆRK: Det forventede størrelsesområde for nanosensorer er 15-50 nm, med en gennemsnitlig størrelse på 20-30 nm. Hvis der ønskes et begrænset størrelsesområde, kan FPLC (i trin 2.3) bruges til at isolere smallere fraktioner med forskellige molekylvægte. - Koncentrer nanosensorerne til 0,5 mg/ml (ved DNA-koncentration) med centrifugalfilterrør (MWCO = 10 kDa), og læg prøverne på et kulstoffilmbelagt kobbergitter monteret på en kryoholder. Morfologien observeres ved hjælp af kryogen transmissionselektronmikroskopi (200 kV, forstørrelse på 10.000-60.000)14.
- Mål den hydrodynamiske partikelstørrelse af DNA-kodede nanosensorer ved dynamisk lysspredning (DLS).
3. Sensorinjektion og urinopsamling
- Opsaml urin til baseline måling.
- Anbring musen i et brugerdefineret huskammer (se supplerende figur 1) med en 96-brøndplade som base.
- Fasthold musen og tryk forsigtigt på blæren for at tømme eventuel resterende urin på pladen.
- Den opsamlede urin (~100-200 μL) pipetteres fra 96-brøndpladen ind i et 1,5 ml rør efter udskiftning af musen til det normale hus.
- Etablere præklinisk murine tumor model.
- Pod 6 til 8 uger gamle BALB/c hunmus ved intravenøs injektion med luciferase-ekspresserende MC26-Fluc-cellelinje (100k celler/mus) (se materialetabel). Overvåg tumorprogression ugentligt ved hjælp af et in vivo fluorescensbilleddannelsessystem.
BEMÆRK: Synlig tumorbyrde indikeret af selvlysende signal forekommer ca. i uge 2 efter injektion af denne særlige cellelinje. Kontroller omhyggeligt tumorbærende dyr under tumorprogressionen regelmæssigt.
- Pod 6 til 8 uger gamle BALB/c hunmus ved intravenøs injektion med luciferase-ekspresserende MC26-Fluc-cellelinje (100k celler/mus) (se materialetabel). Overvåg tumorprogression ugentligt ved hjælp af et in vivo fluorescensbilleddannelsessystem.
- Injicer nanosensorer på forskellige tidspunkter efter tumorimplantation.
- Der fremstilles en injektionsopløsning (maksimalt 200 μL volumen) indeholdende nanosensorer i en koncentration på 1 nmol ved hjælp af DNA-stregkode i steril PBS.
- Injicer 200 μL sensoropløsning i PBS intravenøst i hver eksperimentel mus.
- Der indsamles urinprøver fra raske kontrolmus og tumorbærende mus 1 time efter sensorinjektion som beskrevet i trin 1.1-1.3.
BEMÆRK: Friske urinprøver kan behandles til DNA-stregkodeanalyse direkte eller fryses straks på is.
4. CRISPR-påvisning af DNA-stregkoder: fluorescensbaseret
- Brug friske urinprøver eller optø frosne prøver på is. Centrifuger urinprøver ved 800 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Reagenserne i supplerende tabel 2 kombineres, Cas12a-enzymet tilsættes sidst (se materialetabellen), og reaktionen blandes forsigtigt ved pipettering op og ned. Reaktionen inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
- Kør indberetterreaktionen, som vist i supplerende tabel 3, i tre eksemplarer ved hjælp af produktet fra trin 2. Tilføj reaktionen fra trin 2 sidst og bring hurtigt til pladelæseren.
- Detekter LbaCas12a-aktivering ved at måle fluorescens med en pladelæser ved 37 °C hvert 2. minut i 3 timer (λex: 485 nm og λem: 535 nm) for at overvåge DNA-reporterens spaltningskinetik.
- For at analysere de fluorescerende måledata skal du bruge Python-pakken til enzymkinetisk analyse, der er tilgængelig på https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Dette script beregner den indledende reaktionshastighed (V0) ved hjælp af hældningen af den lineære tilpasning af de første 8-10 indledende tidspunkter.
5. CRISPR-påvisning af DNA-stregkoder: papirbaseret
- Centrifuger urinprøver ved 800 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Kør urinprøverne til fluorescensbaseret og papirbaseret CRISPR-detektion parallelt. - Reagenserne i supplerende tabel 2 kombineres. Der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
BEMÆRK: Dette inkubationstrin er identisk med det for fluorescensbaseret CRISPR-detektion. - Kør reporterreaktionen ved hjælp af FAM-biotinmærket DNA-reporter til lateral flowanalyse på en papirstrimmel (se materialetabel). Reagenserne i supplerende tabel 4 kombineres i en plade med 96 brønde ved hjælp af produktet fra trin 2. Dæk med aluminiumsfolie og inkuber ved 37 °C i 1 time.
BEMÆRK: Vælg den optimale inkubationstid i henhold til realtidskinetisk overvågning i det fluorescensbaserede CRISPR-detektionsassay beskrevet ovenfor. - Til en frisk brønd med en plade med 96 brønde tilsættes 80 μL PBS. Der tilsættes 20 μL prøve fra trin 3 til dette hul.
- Placer en lateral strømningspapirstrimmel til hvert hul, og vent, indtil væsken når toppen af strimlen (<5 min). Se efter udseendet af kontrol- og/eller prøvebåndene på papirstrimlen.
- Tag et billede af den laterale strømningsstrimmel, og kvantificer båndintensiteten ved hjælp af ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nominering af proteaseaktiverede peptidsubstrater
For at designe sensorer, der afspejler ændringer i vævets proteolytiske aktivitet, karakteriseres proteaseaktivitet i vævet først ved hjælp af et bibliotek af peptidprober13 (figur 1). Friske og frosne vævsprøver kan give væsentlig information om tumormikromiljøets proteolytiske aktivitet ved at kombinere vævsprøver med FRET-sonder designet til at detektere substratspaltning. Et bibliotek af FRET-sonder med en FAM-fluorofor og en CPQ-2-quencher inkuberes med vævsprøver. Sonder med den største forskel i spaltningshastighed mellem skinvæv og tumorvæv, målt ved fluorescensspektrofotometri, vælges som peptidlinkere til brug i in vivo-nanosensorerne (figur 1A). For bedre at forstå tumormiljøets fysiologi og effektivt sammenligne proteaseekspressionsprofiler med aktivitetsprofiler kan FRET-sonderne inkuberes med rekombinante proteaser for at forbinde substratspaltning med specifik proteaseaktivitet, som demonstreret med to eksempelsonder i figur 1B.
Sensorformulering og karakterisering
Nanosensorerne består af en polymer kerne, peptider og enkeltstrengede DNA-stregkoder, som afbildet i figur 2A. De polymere kerner er 40 kDa, PEG-dendrimerer, der fungerer som bærere for op til 8 peptid-DNA-konjugater (figur 2B). Peptiderne, ~ 1,4 kDa, forbinder kernen og DNA'et med en aminosyresekvens designet til at blive spaltet gennem proteolytisk aktivitet. Den enkeltstrengede DNA-stregkode er 20 basepar i længden, ~ 6,8 kDa, og kemisk modificeret for forbedret stabilitet in vivo. Efter konjugering renses peptid-DNA-konstruktionen via HPLC, hvilket muliggør adskillelse af de konjugerede og frie bestanddele (figur 2C). Massespektrometrianalyse indikerer, at konjugatet har en molekylvægt på 8,283 kDa, hvilket forventes givet de konstituerende molekylvægte for peptid- og DNA-stregkoden på henholdsvis 1,4 kDa og 6,8 kDa. Peptid-DNA-konjugatet konjugeres yderligere til PEG-dendrimeren. Den resulterende sensor renses ved hjælp af FPLC for at fjerne frit peptid-DNA, som udviser en forlænget retentionstid sammenlignet med de PEGylerede (figur 2D). Sensorens størrelse kan karakteriseres via dynamisk lysspredning og kryogen transmissionselektronmikroskopi, hvilket indikerer en stigning i diameter efter peptid-DNA-tilsætning til kernen fra ~8 nm til ~20 nm (figur 2B). Varians i partikelstørrelse kan skyldes fleksibiliteten af de sammensatte kæder og et variabelt antal peptid-DNA-arme konjugeret til hver PEG-dendrimer.
Præklinisk murine sygdomsmodel
In vivo-arbejde med at teste sensorerne involverer etablering af tumorer i 3 uger i lungerne hos BALB / c-mus, injektion af nanosensorerne og opsamling af urin 1 time efter sensorinjektion (figur 3A). En baseline urinprøve tages også før tumorinokulation for at sammenligne med prøver efter sygdomsinduktion. For at vurdere sensorens effektivitet til påvisning af malignitet injiceres luciferase-ekspression kolorektal cancercellelinje MC26 (MC26-Fluc) intravenøst, hvilket resulterer i lungetumorknuder, der er synlige i in vivo luminescensbilleddannelse. Hæmatoxylin og eosinfarvning13 afslører histopatologi af lungevævet fra henholdsvis tumorbærende mus og skinkontrolmus og tegn på tumordannelse 11- og 21-dages efter injektion, som angivet med sorte pile i figur 3B.
CRISPR-aktivering ved kemisk stabiliseret DNA
For at optimere Cas12a-aktivering via ssDNA-stregkoder og komplementær crRNA-parring er forskellige oligonukleotidsekvenser og længder blevet testet. Aktivering af Cas12a vurderes ved at måle stigningen i fluorescens over tid på grund af Cas12a-spaltning af tilskuer-DNA-reporter med en FRET-parring. En stigning i spaltningshastigheden er forbundet med højere koncentrationer af kemisk modificeret ssDNA-stregkode, som vist med et repræsentativt crRNA/stregkodepar (figur 4B). Det er vigtigt, at et lineært forhold mellem koncentration og aktivering, som vist i figur 4B, gør det muligt for aflæsningen at afspejle DNA-stregkodetilstedeværelse i urinen og indirekte reflektere proteolytisk aktivitet in vivo. Desuden kan flere forskellige crRNA-sekvenser, som beskrevet i supplerende tabel 1, bruges til Cas12a-aktivering, hvilket er afgørende for at muliggøre multiplexing. DNA-aktivatorer er blevet udvalgt til konstruktion af in vivo-sensorer baseret på deres lighed i analyseydelse. Det kemisk modificerede ssDNA, som er kritisk for in vivo-stabiliteten af den syntetiske biomarkør, viste Cas12a-aktivering sammenlignet med umodificeret dsDNA og ssDNA (figur 4C).
Multiplexed urindetektion af kemisk stabiliserede DNA-stregkoder
Flere crRNA-modificerede enkeltstrengede DNA-aktivatorpar (ssDNA) er blevet verificeret for deres ortogonalitet mellem forskellige sekvenser. Dette giver mulighed for samtidig aflæsning i flere brøndanalyser, som vist i figur 5A. Derudover kan modificerede DNA-molekyler i uforarbejdet urin detekteres ved hjælp af en kolorimetrisk aflæsning på laterale papirstrimler, som vist i figur 5B. Tilstedeværelsen af det førende 'prøvebånd' indikerer frigivelsen af detekterbar FAM gennem reporterspaltning, efter at Cas12a er udløst af urin-DNA'et. Når Cas12a aktiveres af DNA-aktivatoren i museurinen, spalter den fluorescein (FAM)-biotinparrede oligonukleotidreporter og frigiver FAM-molekylet, som derefter kan detekteres på 'prøvebåndet'. Onkelerede journalister er fanget på 'kontrolbåndet' på grund af bindingen af biotin til streptavidin. Nanosensorer udvælges til in vivo-eksperimenter og konstrueres ved hjælp af proteaseaktiverbare peptider og forskellige DNA-stregkoder. Peptider nomineres gennem ex vivo vævsprofilering (figur 1A), og DNA-stregkoder vælges baseret på lignende Cas12a-aktivering (figur 4B).
Figur 1: Identifikation af peptidsubstrater aktiveret af dysregulerede proteaser i kolorektal cancer til sensorkonstruktion. A) FRET-parrede peptidsubstrater, der hver består af en peptidsekvens flankeret af en FAM-fluorofor og en CPQ-2-dæmper, screenes mod rekombinante proteolytiske enzymer eller vævshomogenater. (B) Repræsentativ proteasespaltningskinetik af FRET-parrede peptidsubstrater (sonde 1 & 2). Figuren er tilpasset fra Hao et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Karakterisering af DNA-stregkodet aktivitetsbaseret nanosensor med en polymer PEG-kerne. (A) DNA-stregkodede nanosensorer omfatter polymer nanocarrier (8-arm PEG) funktionaliseret med proteaseaktiverede peptider stregkodet med oligonukleotider. (B) Dynamisk lysspredningsanalyse viser en stigning i partikelstørrelsen fra 8,3 nm (kun PEG-kerne) og 13 nm (funktionaliseret sensor). C) HPLC-oprensning af peptid-DNA-konjugat. Konjugatet analyseres i massespektrometri og viser forventet molekylvægt. (D) FPLC-oprensning af sensoren viser adskillelse af funktionaliseret sensor og ubegrænset peptid-DNA-konjugat. Figuren er tilpasset fra Hao et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: In vivo sygdomsinduktion og sensorudnyttelse. (A) Tidslinje for langsgående tumorovervågning med nanosensor på forskellige tidspunkter over tumorudvikling. (B) Histologisk lungefarvning af BALB/c-mus med CRC-lungetumorer 11 og 21 dage efter tumorpodning og saltvandsinjicerede skinkontrolmus. Skalabjælke = 200 μm. Organer blev fikseret, indlejret i paraffin, og farvet med hæmatoxylin og eosin. Undersøgelsen blev udført med n = 3 mus pr. Tidspunkt, og billeder fra et repræsentativt dyr vises. Pile angiver tumorknuder i lungen. Figuren er tilpasset fra Hao et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Cas12a-aktivering af kemisk stabiliserede DNA-aktivatorer. (A) Aktivering af Cas12a af en repræsentativ ssDNA-stregkode gennem binding med komplementært crRNA resulterer i transspaltning af tilstedeværende DNA på en dosisafhængig måde, målt ved fluorescensintensitet via spektrofotometer. (B) Startreaktionshastigheden (V0) bestemmes ud fra kurvens hældning ved begyndelsen af en reaktion i (A) og afbildes for at bestemme det lineære område for analyseydelsen. C) Cas12a-aktivering ved hjælp af dobbeltstrengede, enkeltstrengede og kemisk modificerede DNA-aktivatorer. Figuren er tilpasset fra Hao et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Multiplexed CRISPR-Cas12-medieret DNA-stregkodeudlæsning med to detektionsmuligheder. (A) Transspaltningshastigheder af Cas12a efter aktivering af forskellige modificerede ssDNA-aktivator-crRNA-par bestemmes i Cas12a-fluorescerende spaltningsassay. Assays udføres med urinprøver indsamlet fra mus injiceret med 1 nmol modificeret ssDNA-aktivator efter 1 times i.v. administration. Figuren er tilpasset fra Hao et al.13. (B) Papiraflæsning af urinprøveaktiveret Cas12a med kolorimetriske ændringer forekommer forskellige steder på papirstrimlen. Det øverste bånd er fra den kløvede FAM DNA-reporter, og det nederste bånd er fra uncleaved FAM-biotin-reporter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Urinopsamlingskammer til placering over en 96-brøndplade. Musen placeres midlertidigt inde i cylinderen til vandladning i 96-brøndpladen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Oligo- og peptidsekvenser til sensorformulering og CRISPR-analyse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: Reagenser til fluorescensbaseret og papirbaseret Cas12a- og urinprøvereaktion. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 3: Reagenser af reporterreaktion til fluorescensbaseret CRISPR-detektion. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 4: Reagenser af reporterreaktion til papirbaseret CRISPR-detektion. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenteres en meget tilpasselig platform til multiplekset kræftdetektion med en bærbar urintest, der vurderer sygdomsassocieret proteolytisk aktivitet ved hjælp af en minimalt invasiv injiceret sensor. Når det aktiveres af tumorproteaser, forstærkes peptidsubstratspaltning via DNA-stregkodefrigivelse i urinen. De syntetiske DNA-reportere i en urinprøve kan aflæses ved hjælp af en sekundær CRISPR-Cas-medieret enzymatisk amplifikation ved hjælp af fluorometrisk detektion eller en simpel papirbaseret test. DNA-stregkodning er en attraktiv metode til mærkning af syntetiske biomarkører for at give multipleksitet. Forbedring af stabiliteten af DNA-stregkoderne gennem kemisk modifikation er afgørende for at opretholde nanosensorstabilitet in vivo. Specifikt kan DNA-stregkodedetektion via CRISPR-Cas12a aktiveres ved hjælp af fuldt phosphorothioatmodificerede DNA-stregkoder med en stabiliseret rygrad. Den kemiske modifikation reducerer hastigheden af CRISPR-Cas12a-aktivering i forhold til dets oprindelige DNA-modstykke på grund af dets øgede stabilitet. Endvidere kan indsættelse af terminale modifikationer af crRNA'et eller test af forskellige modificerede oligonukleotider i DNA-stregkoderne yderligere øge følsomheden af den CRISPR-medierede DNA-stregkodedetektion15 og derved forbedre detektionsgrænsen (LOD) for kræftdiagnostik.
Ud over molekylær amplifikation involverer en anden nøglestrategi for at opnå den LOD, der kræves til tidlig kræftdetektion, at drage fordel af størrelsesfiltrering af nyrerne til at koncentrere de syntetiske DNA-reportere i urinen. Til dette formål er det afgørende at optimere størrelsen på DNA-stregkoderne. 20-mer crRNA-komplementære DNA'er udviste optimal CRISPR-Cas12a-medieret DNA-stregkodeaflæsning fra urinprøverne. Denne optimale længde kan variere, når den anvendes på forskellige CRISPR-nukleaser eller prækliniske dyremodeller.
For at opretholde reproducerbarheden af dette detektionssystem er det vigtigt at foretage en grundig karakterisering af de injicerbare nanosensorer for at minimere batch-til-batch-variation. Variation i antallet af peptid-DNA-konjugater pr. kerne vil ændre mængden af DNA-stregkoder, der frigives i urinen og derfor påvirke den endelige aflæsning. På samme måde vil omhyggelig injektion af sensoren intravenøst hjælpe konsistensen i sensordoseringen. For at sikre passende urinopsamling af mindst 50 μL urinvolumen fra hvert dyr på et givet tidspunkt er det afgørende at opretholde tumorbærende dyrehydrering. Dette kan understøttes ved at holde musene på ikke-befugtende vandgel eller injicere PBS subkutant en time før urinopsamling16.
Timing af urinopsamlingen og varigheden af CRISPR-Cas-medieret DNA-stregkodeudlæsning er kritiske faktorer for analysekonsistens. Stregkoder i omløb gennemgår karakteristisk enkelteksponentielt koncentrationshenfald efter intravenøs injektion og størrelsesafhængig nyrefiltrering fra blodet og topper 1 time efter administration i musemodeller13. Dette tidspunkt kan variere i en anden dyremodel. For de to udlæsningsformater for CRISPR-Cas-aktiveringsassays (fluorescerende vs. papirbaseret lateral flow-assay) er det vigtigt at spore den fluorescensbaserede kinetik før lateral strømning, hvilket giver mulighed for det optimale slutpunkt til at læse CRISPR-Cas-spaltningsproduktet.
Denne tilgang er fordelagtig på grund af inkorporeringen af dobbelte signalforstærkningstrin fra proteolytisk og CRISPR-Cas-medieret enzymatisk aktivering og multiplexeringsevnen til at fange sygdommens kompleksitet. Udvidelse af sensorernes multipleksitet kræver omhyggelig materialedosering samt udvidelse af aflæsningens gennemstrømning for at opretholde bærbarhed og brugervenlighed. Denne strategi kræver en grundig karakterisering af proteaseaktivitet i flere modeller og specificiteten af den proteolytiske profil mod en bestemt sygdom eller sygdomsstadium. Mens sensorinjektion er mindre invasiv end mange af de diagnostiske alternativer såsom biopsi, kan intravenøs injektion desuden stole på uddannede flebotomister til sensoradministration, hvilket potentielt begrænser brugssagen til sygdomsovervågning snarere end indledende påvisning i kliniske omgivelser. Ud over systemisk injektion kan de DNA-stregkodede nanosensorer konstrueres yderligere med formuleringer, der kan påføres via ikke-invasiv oral, inhaleret og topisk levering for at muliggøre bærbar sygdomsdetektion og nem selvovervågning af sygdomsprogression og terapivurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.N.B., L.H. og RTZ er opført som opfindere på en patentansøgning relateret til indholdet af dette værk. S.N.B. ejer aktier i Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio og er direktør hos Vertex; konsulterer for Moderna og modtager sponsoreret forskningsfinansiering fra Johnson & Johnson, Revitope og Owlstone.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvist støttet af et Koch Institute Support Grant nummer P30-CA14051 fra National Cancer Institute (Swanson Biotechnology Center), et Core Center Grant P30-ES002109 fra National Institute of Environmental Health Sciences, Koch Institute's Marble Center for Cancer Nanomedicine, Koch Institute Frontier Research Program via Kathy og Curt Marble Cancer Research Fund, og Virginia og D. K. Ludwig Fund for Cancer Research. A.E.V.H. støttes af et NIH-finansieret prædoktoralt uddannelsesstipendium (T32GM130546). S.N.B. er en Howard Hughes Medical Institute efterforsker. LH støttes af en K99/R00 Pathway to Independence Award fra National Cancer Institute og opstartsfinansiering fra Boston University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
- Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
- Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities. ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).
- Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).
- Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. Harnessing protease activity to improve cancer care. Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).
- Hanahan, D.
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Kwong, G. A., et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).
- Kirkpatrick, J. D., et al. Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling. Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).
- Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).
- Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Choi, H. S., et al.
- Hao, L., et al. CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics. Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).
- Hao, L., et al.
- Ghanta, K. S., et al. 5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing. Elife. 10, e72216 (2021).
- Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. Dehydration parameters and standards for laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).
