Summary
该协议描述了一种CRISPR-Cas介导的多分析物合成尿液生物标志物测试，该测试通过对肿瘤相关蛋白酶活性的离体分析来实现即时癌症诊断。
Abstract
为开发精确诊断创建合成生物标志物，可以通过超越传统生物流体测量的途径检测疾病。合成生物标志物通常利用在生物流体中提供可读信号的报告基因来反映疾病发病和进展过程中局部疾病微环境中的生化变化。报告基因的药代动力学浓度和疾病信号的生化扩增对于在诊断测试中实现高灵敏度和特异性至关重要。在这里，使用一种形式的合成生物标志物构建了一个癌症诊断平台：基于活性的纳米传感器携带化学稳定的DNA报告基因，可以通过肿瘤微环境中异常的蛋白水解特征释放出来。合成DNA作为疾病报告基因，通过将其用作条形码提供多重检测能力，允许一次读取多个蛋白水解特征。通过与CRISPR RNA杂交，使用CRISPR核酸酶检测释放到尿液中的DNA报告基因，CRISPR RNA在酶激活时产生荧光或比色信号。在该协议中，构建了DNA条形码，基于活性的纳米传感器，并在转移性结直肠癌的临床前小鼠模型中举例说明了它们的应用。该系统可根据疾病生物学进行高度修改，并同时产生多种疾病信号，通过微创过程提供对疾病特征的全面了解，只需纳米传感器给药、尿液收集和纸质测试即可实现即时诊断。
Introduction
尽管在鉴定脱落蛋白和 DNA 等肿瘤生物标志物方面付出了巨大努力，但癌症诊断领域仍因其在循环中的低丰度或快速降解而备受关注1。作为一种补充策略，选择性地响应疾病特征以产生放大信号的生物工程合成生物标志物代表了实现准确和可及诊断的新途径2,3。为了帮助检测，这些合成生物标志物利用肿瘤依赖性激活机制（如酶扩增）来生产具有改进信噪比的分析物4。本文利用一类癌症相关酶蛋白酶来激活可注射的纳米级传感器，以释放可从生物体液（如血液或尿液）中检测到的疾病报告基因5,6。鉴于肿瘤的异质性，开发一组蛋白酶激活的传感器可以进行多分析物测试，将不同的蛋白酶切割事件组合成一个“疾病特征”，以更特异性、多重的方式评估癌症的发病率和进展。
已经开发了蛋白酶激活的合成生物标志物，其包含偶联到惰性载体表面的肽底物7。当在体内注射时，这些肽被带到肿瘤中，然后肿瘤蛋白酶的酶裂解将报告基因释放到血液或尿液中进行检测。使用蛋白酶激活的合成生物标志物进行多重检测时，混合物中的每种合成生物标志物都必须使用唯一的分子条形码进行标记。为此，已经开发了各种方法，包括质量条形码和配体编码报告基因8,9,10。与这些可能仅限于几种不同信号可能性的多重方法相反，DNA条形码根据人类疾病状态的高度复杂性和异质性提供了更多的组合。为了扩大合成生物标志物的多重性，传感器通过用独特的DNA序列标记每个报告基因来对传感器进行条形码编码，以便通过CRISPR-Cas核酸酶进行检测，以放大离体生物流体信号。这些单链 DNA （ssDNA） 条形码旨在与互补的 CRISPR 向导 RNA （crRNA） 结合，激活 CRISPR-Cas12a11 的靶向触发的侧支核酸酶活性。这种核酸酶活性可用于切割通过荧光动力学或使用纸条检测到的报告基因 DNA 链。
除了通过蛋白酶（体内）和 CRISPR-Cas（离体）进行分子扩增外，蛋白酶激活的合成生物标志物的另一个关键设计特征涉及利用纳米材料药代动力学来增加生物流体中的诊断信号浓度10。一种方法是使用纳米颗粒载体来增加表面共轭肽底物的循环时间。选择聚乙二醇（PEG）树枝状聚合物作为具有相对较小的流体动力学直径和多价的纳米载体，以增加向肿瘤的递送。虽然 PEG 载体足够小以促进肿瘤递送，但其尺寸大于肾小球滤过屏障的 ~5 nm 尺寸截止值，因此只有裂解的肽底物才能清除到尿液中，利用肾脏的大小过滤12。在该协议中，概述了在临床前小鼠模型中合成和应用基于 DNA 条形码活性的纳米传感器的多步骤工作流程，重点介绍了 CRISPR-Cas 介导的多分析物合成尿液生物标志物测试的设置，该小组已采用该测试对多种癌症类型小鼠模型中的疾病状态进行分类 13.由于多功能设计原理，纳米传感器的所有三个功能组件——纳米载体（PEG聚合物）、刺激响应模块（蛋白酶激活底物）和生物流体报告基因（DNA条形码）——都可以根据特定应用需求精确互换，通过定制靶标和释放特异性来实现模块化。
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Protocol
所有动物研究均由作者所在机构的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。需要标准的动物护理设施，包括饲养室、无菌罩、麻醉和伦理终点安乐死，才能正确进行这些实验。所有实验均按照机构和国家指南进行，并由该机构的兽医人员监督。用于实验的雌性BALB / c小鼠是从商业来源获得的（参见 材料表），在研究开始时的年龄范围为6至8周。 补充表1中提供了定制合成的DNA、crRNA、基于FRET的肽底物探针和传感器肽的序列。
1. 蛋白酶激活肽底物选择
- 根据先前发表的报告13，从健康肺或具有肿瘤结节的肺组织中收集和制备组织样本。
- 使用组织解离管在预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）（200mg组织/ mL PBS）中匀浆组织，以将组织自动解离成单细胞悬浮液。
- 离心组织在4°C下以6,000× g 匀浆5分钟。 将上清液保留在新管中。
- 在4°C下以14,000× g 离心上清液25分钟。
- 使用二辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒测量蛋白质浓度（参见 材料表）。
- 向样品中加入 PBS 以制备 0.33 mg/mL 溶液。
- 按照以下步骤评估蛋白水解活性。
- 在 384 孔板中，向每个孔中加入 5 μL、6 μM 基于 FRET 的肽底物探针。对于每个探针，一式三份地进行反应。
注意：基于FRET的肽底物探针包含一个短肽序列（6-8个氨基酸，设计为对靶蛋白酶或一组蛋白酶具有特异性），以荧光团和淬灭剂对终止。 补充表1 中描述了两个FRET探头作为示例。完整的探针库可以在Hao等人中找到。13. - 在室温下以180× g 离心孔板10秒，以确保探针位于板的底部。
- 向每个孔中加入 25 μL 0.33 mg/mL 组织样品或 40 μM 重组蛋白酶 13 。
注意：组织样品或重组蛋白酶的最终浓度可能需要根据其内在的蛋白水解活性进行优化。例如，高度蛋白水解的组织（如肠道）可能需要更高的稀释因子，以便监测初始酶裂解。 - 以180× g （室温）短暂离心孔板，以混合探针和组织裂解物。
- 通过在37°C下每2分钟测量荧光1小时（λex：485nm;λem：535nm）来监测解裂，立即开始检测探针切割。
注意：对特定的荧光团和淬灭剂对使用适当的激发和发射波长。在本研究中，为FAM荧光团设置了参数（λex：485 nm和λem：535 nm）。 - 要分析荧光测量数据，请使用 https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic 提供的 Python（参见 材料表）软件包进行酶动力学分析。此脚本使用前 8-10 个初始时间点的线性拟合斜率计算初始反应速度 （V0）。
- 在 384 孔板中，向每个孔中加入 5 μL、6 μM 基于 FRET 的肽底物探针。对于每个探针，一式三份地进行反应。
2. 传感器配方和表征
- 合成DNA和蛋白酶活化肽（PAP）的偶联物。
- 在室温下，将20-mer硫代磷酸化DNA报告基因与3'-DBCO基团（1.1当量，参见 材料表）与C末端半胱氨酸末端的叠氮化物末端PAP一起在室温下孵育>4小时。如果放置过夜，则在4°C下孵育。
- 在配备生物分子理想色谱柱的高效液相色谱（HPLC）系统上纯化产品（参见材料表）。将HPLC梯度设置为从5%A缓冲液（0.05%TFA在H2O中）开始，保持等度20分钟，并在65分钟达到80%B缓冲液（0.05%TFA，99.95%乙腈），流速为0.3mLmin-1，并收集保留时间为~31分钟的偶联产物。
- 使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质14，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间 （MALDI-TOF） 质谱法验证纯化的偶联物（参见 材料表）。
- 合成DNA编码的基于活性的纳米传感器。
- 将 2 mg 多价 PEG（40 kDa，8 臂，参见 材料表）与马来酰亚胺反应性基团溶解在 1 mL 100 mM 磷酸盐缓冲液 （pH 7.0） 和过滤器（截止值：0.2 μm）中。
- 将半胱氨酸终止的DNA-肽偶联物（2当量，参见 材料表）加入PEG中，并在室温下反应>4小时。如果放置过夜，则在4°C下孵育。
- 在快速蛋白质液相色谱（FPLC）上使用市售的葡聚糖-琼脂糖复合基质柱使用尺寸排阻色谱除去未偶联的材料（参见 材料表）。在PBS中运行样品，并在260nm处监测DNA的吸光度，在280nm处监测肽的吸光度。
- 根据制造商推荐的速度，用离心过滤管（MWCO = 10 kDa）浓缩合成的纳米传感器（参见 材料表）。
- 使用ssDNA检测试剂盒（参见 材料表）和λex：485nm和λem：535nm的酶标仪定量DNA的浓度。将纳米传感器储存在4°C。
- 表征基于DNA编码活性的纳米传感器。
- 通过动态光散射 （DLS） 测量 DNA 编码纳米传感器的流体动力学粒径。
注：纳米传感器的预期尺寸范围为15-50纳米，平均尺寸为20-30纳米。如果需要有限的尺寸范围，FPLC（在步骤2.3中）可用于分离具有不同分子量的较窄级分。 - 用离心过滤管（MWCO = 10 kDa）将纳米传感器浓缩至0.5mg / mL（通过DNA浓度），并将样品加载到安装在低温支架上的碳膜涂层铜网格上。使用低温透射电子显微镜（200 kV，放大倍率10,000-60,000）观察形态14。
- 通过动态光散射 （DLS） 测量 DNA 编码纳米传感器的流体动力学粒径。
3. 传感器注射和尿液收集
- 收集尿液进行基线测量。
- 将鼠标放入以96孔板为底的定制壳室（参见 补充图1）中。
- 束缚鼠标并在膀胱上轻轻按压，以将任何剩余的尿液排到板上。
- 将小鼠更换到正常外壳后，将收集的尿液（~100-200μL）从96孔板移液到1.5mL管中。
- 建立临床前小鼠肿瘤模型。
- 通过静脉注射表达荧光素酶的MC26-Fluc细胞系（100k细胞/小鼠）接种6至8周龄的BALB / c雌性小鼠（参见 材料表）。每周使用 体内 荧光成像系统监测肿瘤进展。
注意：发光信号指示的可见肿瘤负荷大约发生在注射该特定细胞系的第 2 周。在肿瘤进展过程中定期仔细检查荷瘤动物。
- 通过静脉注射表达荧光素酶的MC26-Fluc细胞系（100k细胞/小鼠）接种6至8周龄的BALB / c雌性小鼠（参见 材料表）。每周使用 体内 荧光成像系统监测肿瘤进展。
- 在肿瘤植入后的不同时间点注射纳米传感器。
- 在无菌PBS中通过DNA条形码制备含有浓度为1nmol的纳米传感器的注射溶液（最大体积为200μL）。
- 将PBS中的200μL传感器溶液静脉注射到每只实验小鼠中。
- 如步骤1.1-1.3所述，在传感器注射后1小时从健康对照和荷瘤小鼠收集尿液样本。
注意：新鲜尿液样本可以直接进行DNA条形码分析，也可以立即在冰上冷冻。
4. DNA条形码的CRISPR检测：基于荧光
- 使用新鲜的尿液样本或在冰上解冻冷冻样本。在室温下以800× g 离心尿液样品5分钟。
- 将 补充表2中的试剂混合，最后加入Cas12a酶（见 材料表），并通过上下移液轻轻混合反应。将反应在37°C孵育30分钟。
- 如 补充表3所示，使用步骤2的产物一式三份运行报告反应。最后加入步骤2的反应，并快速送至酶标仪。
- 通过在37°C下每2分钟测量荧光3小时（λex：485nm和λem：535nm）来检测LbaCas12a活化，以监测DNA报告基因的切割动力学。
- 要分析荧光测量数据，请利用 https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic 提供的 Python 包进行酶动力学分析。此脚本使用前 8-10 个初始时间点的线性拟合斜率计算初始反应速度 （V0）。
5. DNA条形码的CRISPR检测：纸质
- 在室温下以800× g 离心尿液样品5分钟。
注意：同时运行尿液样本进行基于荧光和纸张的CRISPR检测。 - 合并 附表2中的试剂。在37°C孵育30分钟。
注意：该孵育步骤与基于荧光的CRISPR检测相同。 - 使用FAM-生物素标记的DNA报告基因在纸条上进行侧向层析测定（参见 材料表）。使用步骤2的产物将 补充表4 中的试剂合并在96孔板中。用铝箔覆盖并在37°C下孵育1小时。
注意：根据上述基于荧光的CRISPR检测测定中的实时动力学监测选择最佳孵育时间。 - 向 96 孔板的新鲜孔中加入 80 μL PBS。将步骤 3 中的 20 μL 样品加入该孔中。
- 将一个侧流纸条放在每个孔中，等待液体到达条带顶部（<5分钟）。在纸条上查找对照和/或样品条的外观。
- 拍摄侧流带的照片并使用 ImageJ 量化条带强度。
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Representative Results
提名蛋白酶激活肽底物
为了设计能够反映组织蛋白水解活性变化的传感器，首先使用肽探针库13 表征组织中的蛋白酶活性（图1）。通过将组织样本与设计用于检测底物切割的FRET探针相结合，新鲜和冷冻的组织样品可以提供有关肿瘤微环境蛋白水解活性的大量信息。将具有 FAM 荧光基团和 CPQ-2 淬灭剂的 FRET探针库与组织样品一起孵育。通过荧光分光光度法测量假组织和肿瘤组织之间裂解速率差异最大的探针被选为用于 体内 纳米传感器的肽连接剂（图1A）。为了更好地了解肿瘤环境的生理学并有效地将蛋白酶表达谱与活性谱进行比较，FRET探针可以与重组蛋白酶一起孵育，以将底物切割与特定蛋白酶活性相关联，如 图1B中的两个示例探针所示。
传感器配方和表征
纳米传感器由聚合物核心、肽和单链DNA条形码组成，如 图2A所示。聚合物核心是 40 kDa 的 PEG 树枝状聚合物，可作为多达 8 种肽-DNA 偶联物的载体（图 2B）。肽 ~1.4 kDa 将核心和 DNA 与旨在通过蛋白水解活性切割的氨基酸序列连接起来。单链 DNA 条形码长度为 20 个碱基对，~6.8 kDa，并经过化学修饰以提高 体内稳定性。偶联后， 通过 HPLC纯化肽-DNA构建体，从而分离偶联和游离成分（图2C）。质谱分析表明，偶联物的分子量为 8.283 kDa，鉴于肽和 DNA 条形码的组成分子量分别为 1.4 kDa 和 6.8 kDa，这是预期的。肽-DNA偶联物进一步与PEG树枝状聚合物偶联。使用FPLC纯化所得传感器以除去游离肽-DNA，与聚乙二醇化的肽-DNA相比，其保留时间更长（图2D）。传感器的尺寸 可以通过动态光 散射和低温透射电子显微镜来表征，这表明将肽-DNA添加到核心后，直径从~8 nm增加到~20 nm（图2B）。粒径的差异可能是由于组成链的灵活性以及与每个PEG树枝状聚合物偶联的肽-DNA臂的数量可变。
临床前鼠疫模型
测试传感器的体内工作包括在BALB / c小鼠的肺部建立肿瘤3周，注射纳米传感器，并在传感器注射后1小时收集尿液（图3A）。在肿瘤接种前还采集基线尿液样本，与疾病诱导后的样本进行比较。为了评估传感器在检测恶性肿瘤方面的功效，静脉注射荧光素酶表达的结直肠癌细胞系MC26（MC26-Fluc），导致在体内发光成像中可见肺肿瘤结节。苏木精和伊红染色13 分别揭示了荷瘤小鼠和假对照小鼠肺组织的组织病理学，以及注射后 11 天和 21 天肿瘤形成的证据，如图 3B 中的黑色箭头所示。
通过化学稳定的DNA激活CRISPR
为了 通过 ssDNA 条形码和互补的 crRNA 配对优化 Cas12a 激活，已经测试了不同的寡核苷酸序列和长度。Cas12a的活化是通过测量由于Cas12a与FRET配对的旁观者DNA报告基因的切割而导致的荧光随时间增加来评估的。切割速率的增加与化学修饰的ssDNA条形码浓度的增加有关，如代表性的crRNA/条形码对所示（图4B）。重要的是，如 图4B所示，浓度和活化之间的线性关系使读数能够反映尿液中DNA条形码的存在，并间接反映 体内的蛋白水解活性。此外，补充 表1中详述的多个不同的crRNA序列可用于Cas12a激活，这对于实现多重检测至关重要。DNA活化剂因其在测定性能上的相似性而被选择用于 体内 传感器的构建。与未修饰的 dsDNA 和 ssDNA 相比，化学修饰的 ssDNA 对合成生物标志物 的体内 稳定性至关重要，显示出 Cas12a 的激活（图 4C）。
化学稳定DNA条形码的多重尿液检测
多个 crRNA 修饰的单链 DNA （ssDNA） 激活剂对已被验证为不同序列之间的正交性。这允许在多个孔分析中同时读出，如 图5A所示。此外，使用侧流纸条上的比色读数可以检测未处理尿液中修饰的 DNA 分子，如 图 5B 所示。前导“样本条带”的存在表明，在尿液 DNA 触发 Cas12a 后，通过报告基因切割释放了可检测的 FAM。当 Cas12a 被小鼠尿液中的 DNA 激活剂激活时，它会切割荧光素 （FAM） 与生物素配对的寡核苷酸报告基因，释放 FAM 分子，然后在“样品条带”上检测到该分子。由于生物素与链霉亲和素的结合，未解开的报告基因被捕获在“对照带”上。纳米传感器被选择用于 体内 实验，并使用蛋白酶可激活的肽和不同的DNA条形码构建。通过 离体 组织分析（图1A）提名肽，并根据相似的Cas12a激活选择DNA条形码（图4B）。
图 1：用于传感器构建的结直肠癌中失调蛋白酶激活的肽底物的鉴定。 （A） FRET配对的肽底物，每个底物都由一个肽序列组成，两侧是FAM荧光团和一个CPQ-2淬灭剂，针对重组蛋白水解酶或组织匀浆进行筛选。（B）FRET配对肽底物的代表性蛋白酶切割动力学（探针1和2）。该图改编自Hao等人13。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：具有聚合物 PEG 核心的基于 DNA 条形码活性的纳米传感器的表征。 （A） DNA条形码纳米传感器包括聚合物纳米载体（8臂PEG），该载体由用寡核苷酸条形码的蛋白酶激活肽功能化。（B） 动态光散射分析显示粒径从 8.3 nm（仅 PEG 核心）和 13 nm（功能化传感器）增加。（C）肽-DNA偶联物的HPLC纯化。在质谱法中分析偶联物并显示预期的分子量。（D） 传感器的FPLC纯化显示功能化传感器和未结合肽-DNA偶联物的分离。该图改编自Hao等人13。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3： 体内 疾病诱导和传感器利用。 （A）在肿瘤发展过程中不同时间点使用纳米传感器进行纵向肿瘤监测的时间表。（B） 在肿瘤接种后 11 天和 21 天对携带 CRC 肺肿瘤的 BALB/c 小鼠和注射生理盐水的假对照小鼠进行组织学肺染色。比例尺 = 200 μm。将器官固定，嵌入石蜡中，并用苏木精和伊红染色。该研究是在每个时间点n = 3只小鼠的情况下完成的，并显示了来自代表性动物的图像。箭头表示肺部的肿瘤结节。该图改编自Hao等人13。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：化学稳定的 DNA 激活剂激活 Cas12a。 （A） 通过与互补 crRNA 结合，通过具有代表性的 ssDNA 条形码激活 Cas12a，导致旁观者 DNA 以剂量依赖性方式 进行反式切割，如通过分光光度计测量的荧光强度测量的那样。（B）初始反应速度（V0）由（A）中反应开始时的曲线斜率确定，并绘制以确定测定性能的线性范围。（C） 双链、单链和化学修饰的 DNA 激活剂激活 Cas12a。该图改编自Hao等人13。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：具有两种检测选项的多重 CRISPR-Cas12 介导的 DNA 条形码读数。 （A） 在 Cas12a 荧光切割测定中测定不同修饰的 ssDNA 激活因子-crRNA 对激活后 Cas12a 的反式切割率。在静脉注射1小时后，用注射1nmol修饰ssDNA激活剂的小鼠收集的尿液样本进行测定。该图改编自Hao等人13。（B） 具有比色变化的尿液样本活化 Cas12a 的纸读数出现在纸条的不同位置。顶部条带来自裂解的 FAM DNA 报告基因，底部条带来自未切割的 FAM-生物素报告基因。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1：放置在 96 孔板上的尿液收集室。 将小鼠暂时放置在圆柱体内，以便排尿到96孔板中。 请点击此处下载此文件。
补充表1：用于传感器配方和CRISPR测定的寡核苷酸和肽序列。请点击此处下载此文件。
补充表2：用于荧光和纸基Cas12a和尿液样品反应的试剂。请点击此处下载此文件。
补充表3：用于基于荧光的CRISPR检测的报告基因反应试剂。请点击此处下载此文件。
补充表4：用于纸质CRISPR检测的报告基因反应试剂。请点击此处下载此文件。
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Discussion
这里介绍的是一个高度可定制的平台，用于多路复用癌症检测，使用便携式尿液检测，使用微创注射传感器评估与疾病相关的蛋白水解活性。当被肿瘤蛋白酶激活时，肽底物裂解 通过 释放到尿液中的 DNA 条形码进行扩增。尿液样本中的合成DNA报告基因可以通过使用荧光检测或简单的纸质检测的二次CRISPR-Cas介导的酶扩增来读出。DNA条形码是一种有吸引力的标记合成生物标志物的方法，可提供多重性。通过化学修饰提高DNA条形码的稳定性对于保持 体内纳米传感器的稳定性至关重要。具体来说， 通过 CRISPR-Cas12a进行的DNA条形码检测可以使用具有稳定骨架的完全硫代磷酸盐修饰的DNA条形码来激活。然而，由于CRISPR-Cas12a的稳定性提高，化学修饰降低了CRISPR-Cas12a相对于其天然DNA对应物的激活速度。此外，在 crRNA 中插入末端修饰或测试 DNA 条形码中不同的修饰寡核苷酸可以进一步提高 CRISPR 介导的 DNA 条形码检测15 的灵敏度，从而提高癌症诊断的检测限 （LOD）。
除了分子扩增之外，获得早期癌症检测所需的LOD的另一个关键策略是利用肾脏的大小过滤来浓缩尿液中的合成DNA报告基因。为此，优化DNA条形码的大小至关重要。20 聚体 crRNA 互补 DNA 从尿液样本中表现出最佳的 CRISPR-Cas12a 介导的 DNA 条形码读数。当应用于不同的CRISPR核酸酶或临床前动物模型时，这种最佳长度可能会有所不同。
为了保持该检测系统的可重复性，必须对可注射纳米传感器进行彻底的表征，以尽量减少批次间的变化。每个核心肽-DNA 偶联物数量的变化将改变释放到尿液中的 DNA 条形码的数量，从而影响最终读数。同样，小心地静脉注射传感器将有助于传感器剂量的一致性。为了确保在给定时间点从每只动物身上适当收集至少 50 μL 的尿液量，维持携带肿瘤的动物水合作用至关重要。这可以通过让小鼠保持在不润湿的水凝胶上或在尿液收集前一小时皮下注射PBS来支持16。
尿液收集的时间和 CRISPR-Cas介导的 DNA 条形码读出的持续时间是检测一致性的关键因素。循环中的条形码在静脉注射和从血液中进行大小依赖性肾滤过后经历特征性的单指数浓度衰减，在小鼠模型13中给药后1小时达到峰值。这个时间点在不同的动物模型中可能会有所不同。对于 CRISPR-Cas 活化测定的两种读出形式（荧光 与纸质侧向层析测定），在侧向流动之前跟踪基于荧光的动力学非常重要，从而获得读取 CRISPR-Cas 裂解产物的最佳终点。
这种方法是有利的，因为它结合了来自蛋白水解和CRISPR-Cas介导的酶激活的双信号扩增步骤，以及捕获疾病复杂性的多重能力。扩大传感器的多路复用性将需要仔细的材料计量，并扩大读数的吞吐量，以保持便携性和易用性。该策略需要对多种模型中的蛋白酶活性进行彻底表征，并确定蛋白水解谱对特定疾病或疾病阶段的特异性。此外，虽然传感器注射的侵入性小于许多诊断替代方案（如活检），但静脉注射可能依赖于训练有素的抽血师进行传感器管理，这可能会将用例限制为疾病监测，而不是临床环境中的初始检测。除了全身注射外，DNA条形码纳米传感器还可以进一步设计配方，这些配方可以通过无创口服、吸入和局部给药进行应用，以实现便携式疾病检测和疾病进展和治疗评估的轻松自我监测。
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Disclosures
S.N.B.、L.H. 和 R.T.Z. 在与本作品内容相关的专利申请中被列为发明人。S.N.B. 持有 Glympse Bio、Satellite Bio、Lisata Therapeutics、Port Therapeutics、Intergalactic Therapeutics、Matrisome Bio 的股权，并且是 Vertex 的董事;为Moderna提供咨询，并获得强生公司（Johnson & Johnson）、Revitope和Owlstone公司赞助的研究资金。
Acknowledgments
这项研究部分得到了美国国家癌症研究所（斯旺森生物技术中心）的科赫研究所支持资助 P30-CA14051、美国国家环境健康科学研究所的核心中心资助 P30-ES002109、科赫研究所的大理石癌症纳米医学中心、科赫研究所前沿研究计划通过 Kathy 和 Curt 大理石癌症研究基金， 以及弗吉尼亚和D.K.路德维希癌症研究基金。A.E.V.H. 由 NIH 资助的博士前培训奖学金 （T32GM130546） 提供支持。S.N.B. 是霍华德休斯医学研究所的研究员。L.H. 得到了美国国家癌症研究所的 K99/R00 独立之路奖和波士顿大学的启动资金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
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