Summary
Ce protocole décrit un test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas qui permet de diagnostiquer le cancer au point d’intervention grâce à l’analyse ex vivo des activités protéases associées à la tumeur.
Abstract
La création de biomarqueurs synthétiques pour le développement de diagnostics de précision a permis de détecter des maladies par des voies autres que celles utilisées pour les mesures traditionnelles des biofluides. Les biomarqueurs synthétiques utilisent généralement des rapporteurs qui fournissent des signaux lisibles dans le biofluide pour refléter les altérations biochimiques dans le microenvironnement local de la maladie au cours de l’incidence et de la progression de la maladie. La concentration pharmacocinétique des rapporteurs et l’amplification biochimique du signal de la maladie sont primordiales pour obtenir une sensibilité et une spécificité élevées dans un test diagnostique. Ici, une plateforme de diagnostic du cancer est construite à l’aide d’un format de biomarqueurs synthétiques : des nanocapteurs basés sur l’activité transportant des rapporteurs d’ADN chimiquement stabilisés qui peuvent être libérés par des signatures protéolytiques aberrantes dans le microenvironnement tumoral. L’ADN synthétique en tant que rapporteur de maladie offre une capacité de multiplexage grâce à son utilisation comme code-barres, permettant la lecture de plusieurs signatures protéolytiques à la fois. Les rapporteurs d’ADN libérés dans l’urine sont détectés à l’aide de nucléases CRISPR par hybridation avec des ARN CRISPR, qui à leur tour produisent un signal fluorescent ou colorimétrique lors de l’activation de l’enzyme. Dans ce protocole, des nanocapteurs basés sur l’activité sont construits et leur application est illustrée dans un modèle murin préclinique de cancer colorectal métastatique. Ce système est hautement modifiable en fonction de la biologie de la maladie et génère plusieurs signaux de maladie simultanément, permettant une compréhension complète des caractéristiques de la maladie grâce à un processus peu invasif ne nécessitant que l’administration de nanocapteurs, la collecte d’urine et un test papier qui permet des diagnostics sur le lieu d’intervention.
Introduction
Malgré les efforts importants déployés pour identifier les biomarqueurs tumoraux tels que les protéines excrétées et l’ADN, le domaine du diagnostic du cancer a été mis à rude épreuve par leur faible abondance ou leur dégradation rapide dans la circulation1. En tant que stratégie complémentaire, les biomarqueurs synthétiques issus de la bio-ingénierie qui répondent sélectivement aux caractéristiques de la maladie pour générer des signaux amplifiés représentent de nouvelles voies vers des diagnostics précis et accessibles 2,3. Pour faciliter la détection, ces biomarqueurs synthétiques exploitent les mécanismes d’activation dépendants de la tumeur tels que l’amplification enzymatique pour produire des analytes avec un rapport signal/bruit amélioré4. Ici, une classe d’enzymes associées au cancer, les protéases, est exploitée pour activer des capteurs injectables à l’échelle nanométrique afin de libérer des rapporteurs de maladies détectables à partir des biofluides tels que le sang ou l’urine 5,6. Compte tenu de l’hétérogénéité tumorale, le développement d’un panel de capteurs activés par la protéase permet d’effectuer des tests multianalytes qui combinent différents événements de clivage de la protéase en une « signature de la maladie » pour évaluer l’incidence et la progression du cancer d’une manière plus spécifique et multiplexée.
Des biomarqueurs synthétiques activés par la protéase ont été développés qui comprennent des substrats peptidiques conjugués à la surface d’un support inerte7. Lorsqu’ils sont injectés in vivo, ces peptides sont transportés vers la tumeur, après quoi le clivage enzymatique par les protéases tumorales libère des rapporteurs dans le sang ou l’urine pour détection. La détection multiplexée avec des biomarqueurs synthétiques activés par la protéase nécessite que chaque biomarqueur synthétique d’un cocktail soit marqué avec un code-barres moléculaire unique. À cette fin, diverses approches ont été développées, notamment des codes-barres de masse et des rapporteurs codés par ligands 8,9,10. Contrairement à ces méthodes de multiplexage qui peuvent être limitées à quelques possibilités de signaux différentes, le codage à barres de l’ADN offre beaucoup plus de combinaisons en fonction de la grande complexité et de l’hétérogénéité des états pathologiques humains. Pour étendre la multiplexité des biomarqueurs synthétiques, les capteurs sont codés à barres en étiquetant chaque rapporteur avec une séquence d’ADN unique pour la détection via la nucléase CRISPR-Cas afin d’amplifier le signal biofluidique ex vivo. Ces codes-barres d’ADN simple brin (ADNss) sont conçus pour se lier à des ARN guides CRISPR complémentaires (ARNcr), activant l’activité des nucléases collatérales déclenchées par la cible de CRISPR-Cas12a11. Cette activité nucléase peut être utilisée pour cliver un brin d’ADN rapporteur détecté par cinétique de fluorescence ou à l’aide de bandes de papier.
En plus de l’amplification moléculaire via des protéases (in vivo) et CRISPR-Cas (ex vivo), une autre caractéristique clé de la conception des biomarqueurs synthétiques activés par la protéase consiste à exploiter la pharmacocinétique des nanomatériaux pour augmenter la concentration du signal diagnostique dans les biofluides10. Une approche consiste à utiliser un transporteur de nanoparticules pour augmenter le temps de circulation des substrats peptidiques conjugués à la surface. Un dendrimère en polyéthylène glycol (PEG) est sélectionné comme nanotransporteur avec un diamètre hydrodynamique et une multivalence relativement petits pour augmenter l’administration aux tumeurs. Bien qu’elle soit suffisamment petite pour favoriser l’administration de la tumeur, la taille du porteur de PEG est supérieure à la coupure de ~5 nm de la barrière de filtration glomérulaire rénale, de sorte que seuls les substrats peptidiques clivés peuvent être éliminés dans l’urine, en profitant de la filtration par les reins12. Dans ce protocole, le flux de travail en plusieurs étapes est décrit pour la synthèse et l’application de nanocapteurs basés sur l’activité à code-barres de l’ADN dans un modèle murin préclinique, mettant en évidence la configuration du test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas, qui a été utilisé par ce groupe pour classer l’état de la maladie dans des modèles murins de plusieurs types de cancer13. Grâce au principe de conception polyvalent, les trois composants fonctionnels du nanocapteur - le nanotransporteur (polymère PEG), le module sensible aux stimuli (substrat activé par la protéase) et le rapporteur biofluidique (code-barres ADN) - peuvent être interchangés avec précision en fonction des besoins spécifiques de l’application, ce qui permet une modularité en adaptant les spécificités de la cible et de la libération.
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Protocol
Toutes les études sur les animaux sont approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement des auteurs. Des installations standard de soins aux animaux, y compris des chambres d’hébergement, des cagoules stériles, une anesthésie et une euthanasie éthique, sont nécessaires pour mener à bien ces expériences. Toutes les expériences sont menées conformément aux directives institutionnelles et nationales et supervisées par le personnel vétérinaire de l’établissement. Les souris femelles BALB/c, utilisées pour les expériences, proviennent d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux) et étaient âgées de 6 à 8 semaines au début de l’étude. Les séquences de l’ADN synthétisé sur mesure, de l’ARNcr, des sondes de substrat peptidique à base de FRET et des peptides capteurs sont fournies dans le tableau supplémentaire 1.
1. Sélection du substrat peptidique activé par la protéase
- Collecter et préparer des échantillons de tissus pulmonaires sains ou de tissus pulmonaires avec des nodules tumoraux conformément à un rapport publié précédemment13.
- Homogénéiser les tissus dans une solution saline tamponnée au phosphate pré-refroidie (PBS, pH 7,4) (200 mg de tissu/mL de PBS) avec des tubes de dissociation tissulaire pour la dissociation automatisée des tissus en suspensions unicellulaires.
- Centrifuger les tissus s’homogénent à 6 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Conservez le surnageant dans un nouveau tube.
- Centrifuger le surnageant à 14 000 x g pendant 25 min à 4 °C.
- Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage de protéines d’acide bicinchoninique (BCA) (voir le tableau des matériaux).
- Ajouter du PBS à l’échantillon pour préparer une solution à 0,33 mg/mL.
- Évaluez l’activité protéolytique en suivant les étapes ci-dessous.
- Dans une plaque de 384 puits, ajoutez des sondes de substrat peptidique à base de FRET de 5 μL et 6 μM à chaque puits. Pour chaque sonde, effectuez la réaction en trois exemplaires.
REMARQUE : La sonde de substrat peptidique à base de FRET contient une courte séquence peptidique (6 à 8 acides aminés, conçue pour être spécifique à une protéase cible ou à un groupe de protéases) terminée par une paire fluorophore et trempante. Deux sondes FRET sont décrites dans le tableau supplémentaire 1 à titre d’exemple. La bibliothèque complète des sondes peut être trouvée dans Hao et al.13. - Centrifuger la plaque du puits pendant 10 s à température ambiante à 180 x g pour s’assurer que les sondes sont au fond de la plaque.
- Ajouter 25 μL 0,33 mg/mL d’échantillon de tissu ou 40 μM de protéaserecombinante 13 dans chaque puits.
REMARQUE : La concentration finale de l’échantillon de tissu ou de la protéase recombinante peut devoir être optimisée en fonction de leur activité protéolytique intrinsèque. Par exemple, les tissus hautement protéolytiques tels que les intestins peuvent nécessiter des facteurs de dilution plus élevés pour permettre la surveillance du clivage enzymatique initial. - Centrifuger brièvement la plaque à 180 x g (à température ambiante) pour mélanger les sondes et les lysats tissulaires.
- Commencez immédiatement à détecter le clivage de la sonde en mesurant la fluorescence avec le lecteur de plaques à 37 °C toutes les 2 min pendant 1 h (λex : 485 nm ; λem : 535 nm) pour surveiller le clivage.
REMARQUE : Utilisez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées pour des paires de fluorophores et de trempe spécifiques. Dans le cas de cette étude, des paramètres (λex : 485 nm et λem : 535 nm) sont définis pour le fluorophore FAM. - Pour analyser les données de mesure fluorescentes, utilisez le package Python (voir Tableau des matériaux) pour l’analyse cinétique enzymatique disponible à https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Ce script calcule la vitesse de réaction initiale (V0) en utilisant la pente de l’ajustement linéaire des 8 à 10 premiers points temporels initiaux.
- Dans une plaque de 384 puits, ajoutez des sondes de substrat peptidique à base de FRET de 5 μL et 6 μM à chaque puits. Pour chaque sonde, effectuez la réaction en trois exemplaires.
2. Formulation et caractérisation des capteurs
- Synthétiser le conjugué de l’ADN et du peptide activé par la protéase (PAP).
- Incuber des rapporteurs d’ADN phosphorothioés de 20 mères avec un groupe 3'-DBCO (1,1 eq., voir le tableau des matériaux) avec des PAP terminés par des azides avec une extrémité C-terminale de cystéine dans un tampon phosphate de 100 mM (pH 7,0) à température ambiante pendant >4 h. Si vous laissez cuire toute la nuit, incubez à 4 °C.
- Purifier le produit sur un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) équipé d’une colonne idéale pour les biomolécules (voir Tableau des matériaux). Réglez le gradient HPLC pour qu’il commence à partir d’un tampon A de 5 % (0,05 % TFA dans H2O), maintenez l’isocratie pendant 20 min et atteignez un tampon B de 80 % (0,05 % TFA, 99,95 % d’acétonitrile) à 65 min avec un débit de 0,3 mL min-1, et collectez le produit conjugué avec un temps de rétention à ~31 min.
- Valider les conjugués purifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF (désorption/ionisation laser assistée par matrice) en utilisant l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique comme matrice14 (voir le tableau des matériaux).
- Synthétisez les nanocapteurs basés sur l’activité codés par l’ADN.
- Dissoudre 2 mg de PEG multivalent (40 kDa, 8 bras, voir le tableau des matières) avec le groupe réactif au maléimide dans 1 mL de tampon phosphate à 100 mM (pH 7,0) et filtre (seuil : 0,2 μm).
- Ajouter les conjugués ADN-peptide terminés par la cystéine (2 eq., voir Tableau des matériaux) au PEG et réagir à température ambiante pendant >4 h. Si vous laissez cuire toute la nuit, incubez à 4 °C.
- Éliminer les matériaux non conjugués par chromatographie d’exclusion stérique avec une colonne de matrice composite dextran-agarose disponible dans le commerce sur une chromatographie liquide protéique rapide (FPLC) (voir le tableau des matériaux). Analysez des échantillons dans le PBS et surveillez l’absorbance à 260 nm pour l’ADN et à 280 nm pour le peptide.
- Concentrer les nanocapteurs synthétisés avec des tubes filtrants centrifuges (MWCO = 10 kDa) selon la vitesse recommandée par le fabricant (voir Tableau des matériaux).
- Quantifier la concentration d’ADN à l’aide d’un kit de dosage de l’ADNsb (voir le tableau des matériaux) et d’un lecteur de plaques à λex : 485 nm et λem : 535 nm. Stockez les nanocapteurs à 4 °C.
- Caractériser les nanocapteurs basés sur l’activité codés par l’ADN.
- Mesurez la taille hydrodynamique des particules de nanocapteurs codés par l’ADN par diffusion dynamique de la lumière (DLS).
REMARQUE : La gamme de taille attendue des nanocapteurs est de 15 à 50 nm, avec une taille moyenne de 20 à 30 nm. Si une gamme de tailles limitée est souhaitée, la FPLC (à l’étape 2.3) peut être utilisée pour isoler des fractions plus étroites avec des poids moléculaires différents. - Concentrer les nanocapteurs à 0,5 mg/mL (par concentration d’ADN) avec des tubes filtrants centrifuges (MWCO = 10 kDa) et charger les échantillons sur une grille de cuivre recouverte d’un film de carbone montée sur un cryosupport. Observez la morphologie à l’aide de la microscopie électronique à transmission cryogénique (200 kV, grossissement de 10 000 à 60 000)14.
- Mesurez la taille hydrodynamique des particules de nanocapteurs codés par l’ADN par diffusion dynamique de la lumière (DLS).
3. Injection par capteur et collecte d’urine
- Prélevez l’urine pour la mesure de base.
- Placez la souris dans une chambre de boîtier personnalisée (voir Figure supplémentaire 1) avec une plaque à 96 puits comme base.
- Retenez la souris et appliquez une légère pression sur la vessie pour évacuer l’urine restante sur la plaque.
- Pipeter l’urine recueillie (~100-200 μL) de la plaque à 96 puits dans un tube de 1,5 mL après avoir placé la souris dans le boîtier normal.
- Établir un modèle préclinique de tumeur murine.
- Inoculer des souris femelles BALB/c âgées de 6 à 8 semaines par injection intraveineuse avec une lignée cellulaire MC26-Fluc exprimant la luciférase (100k cellules/souris) (voir le tableau des matières). Surveiller la progression tumorale chaque semaine à l’aide d’un système d’imagerie par fluorescence in vivo .
REMARQUE : La charge tumorale visible indiquée par un signal luminescent se produit environ à la semaine 2 de l’injection de cette lignée cellulaire particulière. Vérifiez soigneusement et régulièrement les animaux porteurs de tumeurs pendant la progression de la tumeur.
- Inoculer des souris femelles BALB/c âgées de 6 à 8 semaines par injection intraveineuse avec une lignée cellulaire MC26-Fluc exprimant la luciférase (100k cellules/souris) (voir le tableau des matières). Surveiller la progression tumorale chaque semaine à l’aide d’un système d’imagerie par fluorescence in vivo .
- Injecter des nanocapteurs à différents moments après l’implantation de la tumeur.
- Préparer une solution injectable (volume maximum de 200 μL) contenant des nanocapteurs à une concentration de 1 nmol par code-barres ADN dans du PBS stérile.
- Injecter 200 μL de solution de capteur dans du PBS dans chaque souris expérimentale par voie intraveineuse.
- Prélevez des échantillons d’urine de souris témoins et tumorales saines 1 h après l’injection du capteur, comme décrit aux étapes 1.1 à 1.3.
REMARQUE : Les échantillons d’urine frais peuvent être traités directement pour l’analyse des codes-barres ADN ou congelés immédiatement sur de la glace.
4. Détection CRISPR des codes-barres ADN : basée sur la fluorescence
- Utilisez des échantillons d’urine fraîche ou décongelez des échantillons congelés sur de la glace. Centrifuger des échantillons d’urine à 800 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Combinez les réactifs du tableau supplémentaire 2, ajoutez l’enzyme Cas12a (voir tableau des matériaux) en dernier et mélangez doucement la réaction en pipetant de haut en bas. Incuber la réaction à 37 °C pendant 30 min.
- Exécutez la réaction rapporteure, comme indiqué dans le tableau supplémentaire 3, en trois exemplaires en utilisant le produit de l’étape 2. Ajoutez la réaction de l’étape 2 en dernier et amenez-la rapidement au lecteur de plaques.
- Détecter l’activation de LbaCas12a en mesurant la fluorescence avec un lecteur de plaques à 37 °C toutes les 2 min pendant 3 h (λex : 485 nm et λem : 535 nm) pour surveiller la cinétique de clivage du rapporteur d’ADN.
- Pour analyser les données de mesure fluorescentes, utilisez le package Python pour l’analyse cinétique enzymatique disponible à https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Ce script calcule la vitesse de réaction initiale (V0) en utilisant la pente de l’ajustement linéaire des 8 à 10 premiers points temporels initiaux.
5. Détection CRISPR des codes-barres ADN : sur papier
- Centrifuger des échantillons d’urine à 800 x g pendant 5 min à température ambiante.
REMARQUE : Analysez les échantillons d’urine pour la détection CRISPR par fluorescence et sur papier en parallèle. - Combinez les réactifs dans le tableau supplémentaire 2. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
REMARQUE : Cette étape d’incubation est identique à celle de la détection CRISPR par fluorescence. - Exécutez la réaction de rapporteur à l’aide d’un rapporteur d’ADN marqué à la biotine FAM pour le test de flux latéral sur une bandelette de papier (voir Tableau des matériaux). Combiner les réactifs du tableau supplémentaire 4 dans une plaque à 96 puits en utilisant le produit de l’étape 2. Couvrir de papier aluminium et incuber à 37 °C pendant 1 h.
REMARQUE : Sélectionnez le temps d’incubation optimal en fonction de la surveillance cinétique en temps réel dans le test de détection CRISPR basé sur la fluorescence décrit ci-dessus. - Dans un puits frais d’une plaque de 96 puits, ajoutez 80 μL de PBS. Ajoutez 20 μL d’échantillon de l’étape 3 dans ce puits.
- Placer une bande de papier à flux latéral dans chaque puits et attendre que le liquide atteigne le haut de la bande (<5 min). Recherchez l’apparence de la ou des bandes de contrôle et/ou d’échantillon sur la bande de papier.
- Prenez une photo de la bande d’écoulement latéral et quantifiez l’intensité de la bande à l’aide d’ImageJ.
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Representative Results
Nomination de substrats peptidiques activés par la protéase
Pour concevoir des capteurs qui refléteront les changements dans l’activité protéolytique du tissu, l’activité de la protéase dans le tissu est d’abord caractérisée à l’aide d’une bibliothèque de sondes peptidiques13 (Figure 1). Des échantillons de tissus frais et congelés peuvent fournir des informations substantielles sur l’activité protéolytique du microenvironnement tumoral en combinant des échantillons de tissus avec des sondes FRET conçues pour détecter le clivage du substrat. Une bibliothèque de sondes FRET avec un fluorophore FAM et un extincteur CPQ-2 est incubée avec des échantillons de tissus. Les sondes présentant la plus grande différence de taux de clivage entre le tissu fictif et le tissu tumoral, mesurées par spectrophotométrie de fluorescence, sont sélectionnées comme lieurs peptidiques pour une utilisation dans les nanocapteurs in vivo (Figure 1A). Pour mieux comprendre la physiologie de l’environnement tumoral et comparer efficacement les profils d’expression des protéases aux profils d’activité, les sondes FRET peuvent être incubées avec des protéases recombinantes pour associer le clivage du substrat à une activité protéase spécifique, comme le montrent deux exemples de sondes dans la figure 1B.
Formulation et caractérisation des capteurs
Les nanocapteurs sont composés d’un noyau polymère, de peptides et de codes-barres d’ADN simple brin, comme illustré à la figure 2A. Les noyaux polymères sont des dendrimères PEG de 40 kDa qui servent de supports pour jusqu’à 8 conjugués peptide-ADN (Figure 2B). Les peptides, ~1,4 kDa, relient le noyau et l’ADN à une séquence d’acides aminés conçue pour être clivée par une activité protéolytique. Le code-barres d’ADN simple brin a une longueur de 20 paires de bases, ~6,8 kDa et a été modifié chimiquement pour une meilleure stabilité in vivo. Après la conjugaison, la construction peptide-ADN est purifiée par HPLC, ce qui permet de séparer les constituants conjugués et libres (Figure 2C). L’analyse par spectrométrie de masse indique que le conjugué a une masse moléculaire de 8,283 kDa, ce qui est attendu compte tenu des masses moléculaires constitutives du peptide et du code-barres de l’ADN de 1,4 kDa et 6,8 kDa, respectivement. Le conjugué peptide-ADN est ensuite conjugué au dendrimère PEG. Le capteur résultant est purifié à l’aide de FPLC pour éliminer l’ADN peptide libre qui présente un temps de rétention prolongé par rapport aux capteurs pégylés (Figure 2D). La taille du capteur peut être caractérisée par diffusion dynamique de la lumière et microscopie électronique à transmission cryogénique, qui indiquent une augmentation du diamètre après l’ajout d’ADN peptide au cœur de ~8 nm à ~20 nm (Figure 2B). La variance de la taille des particules peut être due à la flexibilité des chaînes constitutives et à un nombre variable de bras peptide-ADN conjugués à chaque dendrimère PEG.
Modèle préclinique de maladie murine
Les travaux in vivo pour tester les capteurs consistent à établir des tumeurs pendant 3 semaines dans les poumons de souris BALB/c, à injecter les nanocapteurs et à collecter l’urine 1 heure après l’injection du capteur (Figure 3A). Un échantillon d’urine de base est également prélevé avant l’inoculation de la tumeur pour comparer avec les échantillons après l’induction de la maladie. Afin d’évaluer l’efficacité du capteur dans la détection des tumeurs malignes, la lignée cellulaire du cancer colorectal d’expression de la luciférase MC26 (MC26-Fluc) est injectée par voie intraveineuse, ce qui permet d’obtenir des nodules tumoraux pulmonaires visibles en imagerie par luminescence in vivo . La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine13 révèle une histopathologie du tissu pulmonaire chez des souris tumorales et des souris témoins fictives, respectivement, et des preuves de formation de tumeurs à 11 et 21 jours après l’injection, comme l’indiquent les flèches noires de la figure 3B.
Activation de CRISPR par ADN chimiquement stabilisé
Pour optimiser l’activation de Cas12a via des codes-barres d’ADNsb et des appariements d’ARNc complémentaires, différentes séquences et longueurs d’oligonucléotides ont été testées. L’activation de Cas12a est évaluée en mesurant l’augmentation de la fluorescence au fil du temps due au clivage Cas12a du rapporteur d’ADN témoin avec un appariement FRET. Une augmentation du taux de clivage est associée à des concentrations plus élevées de codes-barres d’ADNsb chimiquement modifiés, comme le montre une paire représentative ARNcr/code-barres (Figure 4B). Il est important de noter qu’une relation linéaire entre la concentration et l’activation, comme le montre la figure 4B, permet à la lecture de refléter la présence de codes-barres d’ADN dans l’urine et indirectement l’activité protéolytique in vivo. De plus, plusieurs séquences d’ARNcr différentes, comme détaillé dans le tableau supplémentaire 1, peuvent être utilisées pour l’activation de Cas12a, ce qui est essentiel pour permettre le multiplexage. Les activateurs d’ADN ont été sélectionnés pour la construction de capteurs in vivo en fonction de leur similitude dans les performances des tests. L’ADNsb chimiquement modifié, qui est essentiel à la stabilité in vivo du biomarqueur synthétique, a démontré l’activation de Cas12a, par rapport à l’ADNdb et à l’ADNsb non modifiés (Figure 4C).
Détection urinaire multiplexée de codes-barres d’ADN chimiquement stabilisé
L’orthogonalité de plusieurs paires d’activateurs d’ADN simple brin modifié par l’ARNcr (ADNsb) entre différentes séquences a été vérifiée. Cela permet une lecture simultanée dans plusieurs analyses de puits, comme le montre la figure 5A. De plus, les molécules d’ADN modifiées dans l’urine non traitée peuvent être détectées à l’aide d’une lecture colorimétrique sur des bandes de papier à flux latéral, comme le montre la figure 5B. La présence de la « bande d’échantillon » principale indique la libération de FAM détectable par clivage rapporteur après que Cas12a ait été déclenché par l’ADN urinaire. Lorsque Cas12a est activé par l’activateur de l’ADN dans l’urine de souris, il clive le rapporteur oligonucléotidique apparié fluorescéine (FAM)-biotine, libérant la molécule FAM, qui est ensuite détectable sur la « bande d’échantillon ». Les journalistes non autorisés sont capturés sur la « bande de contrôle » en raison de la liaison de la biotine à la streptavidine. Les nanocapteurs sont sélectionnés pour des expériences in vivo et construits à l’aide de peptides activables par la protéase et de codes-barres d’ADN distincts. Les peptides sont désignés par profilage tissulaire ex vivo (Figure 1A) et les codes-barres ADN sont sélectionnés en fonction d’une activation similaire de Cas12a (Figure 4B).
Figure 1 : Identification des substrats peptidiques activés par des protéases dérégulées dans le cancer colorectal pour la construction de capteurs. (A) Des substrats peptidiques appariés FRET, chacun constitué d’une séquence peptidique flanquée d’un fluorophore FAM et d’un quencher CPQ-2, sont criblés contre des enzymes protéolytiques recombinantes ou des homogénats tissulaires. (B) Cinétique représentative du clivage de la protéase des substrats peptidiques appariés FRET (Sondes 1 et 2). La figure est adaptée de Hao et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation d’un nanocapteur basé sur l’activité à code-barres de l’ADN avec un noyau PEG polymère. (A) Les nanocapteurs à code-barres de l’ADN comprennent des nanotransporteurs polymères (PEG à 8 bras) fonctionnalisés avec des peptides activés par la protéase avec des oligonucléotides. (B) L’analyse de diffusion dynamique de la lumière montre une augmentation de la taille des particules de 8,3 nm (noyau PEG uniquement) et 13 nm (capteur fonctionnalisé). (C) Purification HPLC du conjugué peptide-ADN. Le conjugué est analysé en spectrométrie de masse et indique la masse moléculaire attendue. (D) La purification FPLC du capteur montre la séparation du capteur fonctionnalisé et du conjugué peptide-ADN non lié. La figure est adaptée de Hao et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Induction de la maladie in vivo et utilisation des capteurs. (A) Chronologie de la surveillance longitudinale des tumeurs avec des nanocapteurs à différents moments du développement de la tumeur. (B) Coloration histologique des poumons de souris BALB/c porteuses de tumeurs pulmonaires du CCR à 11 et 21 jours après l’inoculation de la tumeur et de souris témoins Sham injectées de solution saline. Barre d’échelle = 200 μm. Les organes ont été fixés, noyés dans de la paraffine et colorés à l’hématoxyline et à l’éosine. L’étude a été réalisée avec n = 3 souris par point temporel et des images d’un animal représentatif sont montrées. Les flèches indiquent des nodules tumoraux dans le poumon. La figure est adaptée de Hao et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Activation de Cas12a par des activateurs d’ADN chimiquement stabilisés. (A) L’activation de Cas12a par un code-barres représentatif de l’ADNsb par liaison avec de l’ARNc complémentaire entraîne un transclivage de l’ADN du spectateur d’une manière dose-dépendante, mesurée par l’intensité de fluorescence par spectrophotomètre. (B) La vitesse de réaction initiale (V0) est déterminée à partir de la pente de la courbe au début d’une réaction en (A) et tracée pour déterminer la plage linéaire des performances de l’essai. (C) Activation de Cas12a par des activateurs d’ADN double brin, simple brin et chimiquement modifiés. La figure est adaptée de Hao et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Lecture de codes-barres d’ADN multiplexés médiés par CRISPR-Cas12 avec deux options de détection. (A) Les taux de trans-clivage de Cas12a lors de l’activation de différentes paires activée de l’ADNsb-ARNcr modifiées sont déterminés dans le test de clivage fluorescent Cas12a. Les tests sont effectués avec des échantillons d’urine prélevés sur des souris injectées avec 1 nmol d’activateur d’ADNsb modifié après 1 h d’administration intraveineuse. La figure est adaptée de Hao et al.13. (B) La lecture papier de Cas12a activé par échantillon d’urine avec des changements colorimétriques apparaît à différents endroits de la bande de papier. La bande supérieure provient d’un rapporteur d’ADN FAM clivé et la bande inférieure provient d’un rapporteur FAM-biotine non clivé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Chambre de collecte d’urine à placer sur une plaque de 96 puits. La souris est temporairement placée à l’intérieur du cylindre pour uriner dans la plaque de 96 puits. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Séquences d’oligo et de peptides pour la formulation de capteurs et le test CRISPR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 2 : Réactifs pour la réaction Cas12a et l’échantillon d’urine à fluorescence et sur papier. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 3 : Réactifs de la réaction rapporteure pour la détection CRISPR par fluorescence. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 4 : Réactifs de réaction du rapporteur pour la détection CRISPR sur papier. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Voici une plateforme hautement personnalisable pour la détection multiplexée du cancer avec un test d’urine portable qui évalue l’activité protéolytique associée à la maladie à l’aide d’un capteur injecté mini-invasif. Lorsqu’il est activé par les protéases tumorales, le clivage du substrat peptidique est amplifié par la libération d’un code-barres d’ADN dans l’urine. Les rapporteurs d’ADN synthétique dans un échantillon d’urine peuvent être lus par une amplification enzymatique secondaire médiée par CRISPR-Cas, à l’aide d’une détection fluorométrique ou d’un simple test sur papier. Le code-barres de l’ADN est une méthode intéressante pour marquer les biomarqueurs synthétiques afin de permettre la multiplexité. L’amélioration de la stabilité des codes-barres de l’ADN par modification chimique est impérative pour maintenir la stabilité des nanocapteurs in vivo. Plus précisément, la détection des codes-barres ADN via CRISPR-Cas12a peut être activée à l’aide de codes-barres ADN entièrement modifiés au phosphorothioate avec un squelette stabilisé. La modification chimique réduit la vitesse d’activation de CRISPR-Cas12a par rapport à son homologue natif de l’ADN, cependant, en raison de sa stabilité accrue. De plus, l’insertion de modifications terminales de l’ARNcr ou le test de différents oligonucléotides modifiés dans les codes-barres de l’ADN peut encore augmenter la sensibilité de la détection des codes-barres de l’ADN médiée par CRISPR15, améliorant ainsi la limite de détection (LOD) des diagnostics du cancer.
En plus de l’amplification moléculaire, une autre stratégie clé pour atteindre la LD requise pour la détection précoce du cancer consiste à tirer parti de la filtration granulométrique par les reins pour concentrer les rapporteurs d’ADN synthétique dans l’urine. À cette fin, il est essentiel d’optimiser la taille des codes-barres ADN. Les ADN complémentaires à ARNcr à 20 mères ont montré une lecture optimale du code-barres de l’ADN médié par CRISPR-Cas12a à partir des échantillons d’urine. Cette longueur optimale peut différer selon qu’elle est appliquée à différentes nucléases CRISPR ou modèles animaux précliniques.
Pour maintenir la reproductibilité de ce système de détection, il est important de procéder à une caractérisation approfondie des nanocapteurs injectables afin de minimiser les variations d’un lot à l’autre. La variation du nombre de conjugués peptide-ADN par carotte modifiera la quantité de codes-barres d’ADN libérés dans l’urine et affectera donc la lecture finale. De même, une injection soigneuse du capteur par voie intraveineuse aidera à la cohérence du dosage du capteur. Afin d’assurer une collecte appropriée d’au moins 50 μL de volume d’urine de chaque animal à un moment donné, il est essentiel de maintenir l’hydratation des animaux porteurs de tumeurs. Cela peut être soutenu en gardant les souris sur du gel d’eau non mouillant ou en injectant du PBS par voie sous-cutanée une heure avant le prélèvement d’urine16.
Le moment de la collecte d’urine et la durée de la lecture du code-barres ADN médié par CRISPR-Cas sont des facteurs critiques pour la cohérence du test. Les codes-barres en circulation subissent une décroissance caractéristique de la concentration exponentielle après injection intraveineuse et une filtration rénale en fonction de la taille du sang, culminant 1 h après l’administration dans des modèles murins13. Ce point temporel peut varier selon un modèle animal différent. Pour les deux formats de lecture des tests d’activation CRISPR-Cas (test à flux latéral fluorescent ou sur papier), il est important de suivre la cinétique basée sur la fluorescence avant le flux latéral, ce qui permet d’obtenir le point final optimal pour lire le produit de clivage CRISPR-Cas.
Cette approche est avantageuse en raison de l’incorporation de deux étapes d’amplification du signal à partir de l’activation enzymatique protéolytique et médiée par CRISPR-Cas, et de la capacité de multiplexage pour capturer la complexité de la maladie. L’extension de la multiplexité des capteurs nécessitera un dosage minutieux du matériau ainsi que l’augmentation du débit de la lecture pour maintenir la portabilité et la facilité d’utilisation. Cette stratégie nécessite une caractérisation approfondie de l’activité de la protéase dans plusieurs modèles et de la spécificité du profil protéolytique pour une maladie ou un stade pathologique particulier. De plus, bien que l’injection par capteur soit moins invasive que de nombreuses alternatives diagnostiques telles que la biopsie, l’injection intraveineuse peut s’appuyer sur des phlébotomistes formés pour l’administration des capteurs, ce qui pourrait limiter le cas d’utilisation à la surveillance de la maladie plutôt qu’à la détection initiale dans un cadre clinique. En plus de l’injection systémique, les nanocapteurs à code-barres ADN peuvent être conçus avec des formulations qui peuvent être appliquées par voie orale, inhalée et topique non invasive, pour permettre une détection portable des maladies et une autosurveillance facile de la progression de la maladie et une évaluation thérapeutique.
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Disclosures
S.N.B., L.H. et R.T.Z. sont inscrits comme inventeurs sur une demande de brevet liée au contenu de cet ouvrage. S.N.B. détient des actions dans Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, et est administrateur chez Vertex ; est consultant pour Moderna et reçoit des fonds de recherche parrainés par Johnson & Johnson, Revitope et Owlstone.
Acknowledgments
Cette étude a été financée en partie par une subvention de soutien de l’Institut Koch P30-CA14051 de l’Institut national du cancer (Swanson Biotechnology Center), une subvention du centre de base P30-ES002109 de l’Institut national des sciences de la santé environnementale, le Marble Center for Cancer Nanomedicine de l’Institut Koch, le programme de recherche exploratoire de l’Institut Koch via le Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund, et le Fonds de Virginie et D. K. Ludwig pour la recherche sur le cancer. L’A.E.V.H. est soutenue par une bourse de formation prédoctorale (T32GM130546) financée par les NIH. S.N.B. est un chercheur de l’Institut médical Howard Hughes. L.H. est soutenu par un prix K99/R00 Pathway to Independence du National Cancer Institute et le financement de démarrage de l’Université de Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
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