Summary
Dit protocol beschrijft een CRISPR-Cas-gemedieerde, multianalyte synthetische urine biomarker test die point-of-care kankerdiagnostiek mogelijk maakt door middel van de ex vivo analyse van tumor-geassocieerde protease-activiteiten.
Abstract
Het creëren van synthetische biomarkers voor de ontwikkeling van precisiediagnostiek heeft het mogelijk gemaakt om ziekten te detecteren via routes die verder gaan dan die welke worden gebruikt voor traditionele biovloeistofmetingen. Synthetische biomarkers maken over het algemeen gebruik van reporters die leesbare signalen in de biovloeistof leveren om de biochemische veranderingen in de lokale micro-omgeving van de ziekte tijdens de incidentie en progressie van de ziekte weer te geven. De farmacokinetische concentratie van de melders en de biochemische versterking van het ziektesignaal zijn van het grootste belang voor het bereiken van een hoge sensitiviteit en specificiteit in een diagnostische test. Hier wordt een kankerdiagnostisch platform gebouwd met behulp van één formaat synthetische biomarkers: op activiteit gebaseerde nanosensoren met chemisch gestabiliseerde DNA-reporters die kunnen worden bevrijd door afwijkende proteolytische handtekeningen in de micro-omgeving van de tumor. Synthetisch DNA als ziektemelder biedt multiplexing-mogelijkheden door het gebruik ervan als streepjescode, waardoor meerdere proteolytische handtekeningen tegelijk kunnen worden uitgelezen. DNA-reporters die in de urine vrijkomen, worden gedetecteerd met behulp van CRISPR-nucleasen via hybridisatie met CRISPR-RNA's, die op hun beurt een fluorescerend of colorimetrisch signaal produceren bij enzymactivering. In dit protocol worden DNA-barcoded, op activiteit gebaseerde nanosensoren geconstrueerd en hun toepassing wordt geïllustreerd in een preklinisch muismodel van uitgezaaide colorectale kanker. Dit systeem is in hoge mate aanpasbaar volgens de ziektebiologie en genereert meerdere ziektesignalen tegelijkertijd, waardoor een uitgebreid begrip van de ziektekenmerken wordt verkregen door middel van een minimaal invasief proces dat alleen nanosensortoediening, urineverzameling en een papieren test vereist die point-of-care-diagnostiek mogelijk maakt.
Introduction
Ondanks de aanzienlijke inspanningen om tumorbiomarkers zoals afgestoten eiwitten en DNA te identificeren, is het diagnostische veld van kanker onder druk komen te staan door hun lage overvloed of snelle afbraak in de bloedsomloop1. Als aanvullende strategie vertegenwoordigen bio-engineered synthetische biomarkers die selectief reageren op ziektekenmerken om versterkte signalen te genereren, nieuwe wegen naar nauwkeurige en toegankelijke diagnostiek 2,3. Om de detectie te vergemakkelijken, maken deze synthetische biomarkers gebruik van tumorafhankelijke activeringsmechanismen zoals enzymatische amplificatie om analyten te produceren met een verbeterde signaal-ruisverhouding4. Hierin wordt een klasse van kanker-geassocieerde enzymen, proteasen, gebruikt om injecteerbare sensoren op nanoschaal te activeren om ziekteverslaggevers vrij te geven die detecteerbaar zijn uit de biovloeistoffen zoals bloed of urine 5,6. In het licht van de heterogeniteit van de tumor maakt de ontwikkeling van een panel van door protease geactiveerde sensoren multianalyttests mogelijk die verschillende protease-splitsingsgebeurtenissen combineren tot een 'ziektehandtekening' om de incidentie en progressie van kanker op een meer specifieke, gemultiplexte manier te beoordelen.
Er zijn protease-geactiveerde synthetische biomarkers ontwikkeld die bestaan uit peptidesubstraten die zijn geconjugeerd aan het oppervlak van een inerte drager7. Wanneer deze peptiden in vivo worden geïnjecteerd, worden ze naar de tumor vervoerd, waarna enzymatische splitsing door tumorproteasen verslaggevers in bloed of urine vrijgeven voor detectie. Meervoudige detectie met protease-geactiveerde synthetische biomarkers vereist dat elke synthetische biomarker in een cocktail wordt geëtiketteerd met een unieke moleculaire streepjescode. Daartoe zijn verschillende benaderingen ontwikkeld, waaronder massastreepjescodes en ligandgecodeerde reporters 8,9,10. In tegenstelling tot deze methoden van multiplexing, die beperkt kunnen zijn tot een paar verschillende signaalmogelijkheden, biedt DNA-barcodering veel meer combinaties in overeenstemming met de hoge complexiteit en heterogeniteit van menselijke ziektetoestanden. Om de multiplexiteit van synthetische biomarkers uit te breiden, worden de sensoren voorzien van een barcode door elke verslaggever te labelen met een unieke DNA-sequentie voor detectie via CRISPR-Cas-nuclease om het biofluïdische signaal ex vivo te versterken. Deze enkelstrengs DNA (ssDNA) barcodes zijn ontworpen om te binden aan complementaire CRISPR-gids-RNA's (crRNA's), waardoor de door het doelwit geactiveerde collaterale nuclease-activiteit van CRISPR-Cas12a11 wordt geactiveerd. Deze nuclease-activiteit kan worden gebruikt om een reporter-DNA-streng te splitsen die wordt gedetecteerd door middel van fluorescentiekinetiek of met behulp van papieren stroken.
Naast moleculaire amplificatie via proteasen (in vivo) en CRISPR-Cas (ex vivo), is een ander belangrijk ontwerpkenmerk van protease-geactiveerde synthetische biomarkers het benutten van de farmacokinetiek van nanomaterialen om de diagnostische signaalconcentratie in biovloeistoffen te verhogen. Een benadering is het gebruik van een drager van nanodeeltjes om de circulatietijd van oppervlaktegeconjugeerde peptidesubstraten te verlengen. Een polyethyleenglycol (PEG) dendrimeer wordt geselecteerd als een nanodrager met een relatief kleine hydrodynamische diameter en multivalentie om de afgifte aan tumoren te verhogen. Hoewel klein genoeg om de afgifte van de tumor te bevorderen, is de grootte van de PEG-drager groter dan de ~5 nm-afsnijding van de glomerulaire filtratiebarrière van de nier, zodat alleen gespleten peptidesubstraten in de urine kunnen worden opgeruimd, gebruikmakend van groottefiltratie door de nieren12. In dit protocol wordt de meerstapsworkflow geschetst voor de synthese en toepassing van DNA-barcoded activiteitsgebaseerde nanosensoren in een preklinisch muizenmodel, waarbij de nadruk wordt gelegd op de opzet van de CRISPR-Cas-gemedieerde, multianalyte synthetische urine-biomarkertest, die door deze groep is gebruikt om de ziektestatus te classificeren in muizenmodellen van meerdere soorten kanker13. Dankzij het veelzijdige ontwerpprincipe kunnen alle drie de functionele componenten van de nanosensor - de nanocarrier (PEG-polymeer), de stimuli-responsieve module (protease-geactiveerd substraat) en de biofluïdische reporter (DNA-streepjescode) - nauwkeurig worden uitgewisseld volgens toepassingsspecifieke behoeften, waardoor modulariteit mogelijk is door de specifieke kenmerken van het doel en de afgifte aan te passen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierstudies zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de instelling van de auteurs. Standaard faciliteiten voor dierverzorging, waaronder huisvestingskamers, steriele kappen, anesthetica en ethische eindpunteuthanasie zijn vereist om deze experimenten correct uit te voeren. Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale richtlijnen en staan onder toezicht van het veterinaire personeel van de instelling. Vrouwelijke BALB/c-muizen, die voor de experimenten worden gebruikt, zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel) en varieerden in leeftijd van 6 tot 8 weken aan het begin van het onderzoek. Sequenties voor op maat gesynthetiseerd DNA, crRNA, FRET-gebaseerde peptidesubstraatsondes en sensorpeptiden worden gegeven in aanvullende tabel 1.
1. Protease-geactiveerde peptide substraat selectie
- Verzamel en bereid weefselmonsters voor van gezonde longen of longweefsel met tumorknobbeltjes volgens een eerder gepubliceerd rapport13.
- Homogeniseer weefsels in voorgekoelde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) (200 mg weefsel/ml PBS) met weefseldissociatiebuisjes voor de geautomatiseerde dissociatie van weefsels in eencellige suspensies.
- Centrifugeer weefselhomogenisaties bij 6.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Bewaar het supernatans in een nieuwe buis.
- Centrifugeer het supernatans bij 14.000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °C.
- Meet de eiwitconcentratie met behulp van een eiwittestkit met bicinchoninezuur (BCA) (zie Materiaaltabel).
- Voeg PBS toe aan het monster om een oplossing van 0,33 mg/ml te bereiden.
- Beoordeel de proteolytische activiteit aan de hand van de onderstaande stappen.
- Voeg in een plaat met 384 putjes 5 μL, 6 μM FRET-gebaseerde peptidesubstraatsondes toe aan elk putje. Voer voor elke sonde de reactie in drievoud uit.
OPMERKING: Op FRET gebaseerde peptidesubstraatsonde bevat een korte peptidesequentie (6-8 aminozuren, ontworpen om specifiek te zijn voor een doelprotease of groep proteasen) die eindigt met een fluorofoor- en quencherpaar. Twee FRET-sondes worden als voorbeeld beschreven in aanvullende tabel 1 . De volledige bibliotheek met sondes is te vinden in Hao et al.13. okt. - Centrifugeer de putplaat gedurende 10 s bij kamertemperatuur bij 180 x g om er zeker van te zijn dat de sondes zich aan de onderkant van de plaat bevinden.
- Voeg 25 μL 0,33 mg/ml weefselmonster of 40 μM recombinant protease13 toe aan elk putje.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van het weefselmonster of recombinante protease moet mogelijk worden geoptimaliseerd op basis van hun intrinsieke proteolytische activiteit. Zo kunnen sterk proteolytische weefsels zoals darmen hogere verdunningsfactoren nodig hebben om de initiële enzymatische splitsing te kunnen controleren. - Centrifugeer de putplaat kort bij 180 x g (bij kamertemperatuur) om de sondes en weefsellysaten te mengen.
- Begin onmiddellijk met het detecteren van sondesplitsing door gedurende 1 uur elke 2 minuten de fluorescentie te meten met de plaatlezer bij 37 °C (λbijv.: 485 nm; λem: 535 nm) om de splitsing te controleren.
OPMERKING: Gebruik de juiste excitatie- en emissiegolflengten voor specifieke fluorofoor- en quencherparen. In het geval van dit onderzoek worden parameters (λex: 485 nm en λem: 535 nm) vastgesteld voor de FAM-fluorofoor. - Om de fluorescerende meetgegevens te analyseren, gebruikt u het Python-pakket (zie Tabel met materialen) voor enzymkinetische analyse dat beschikbaar is op https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Dit script berekent de initiële reactiesnelheid (V0) met behulp van de helling van de lineaire fit van de eerste 8-10 initiële tijdstippen.
- Voeg in een plaat met 384 putjes 5 μL, 6 μM FRET-gebaseerde peptidesubstraatsondes toe aan elk putje. Voer voor elke sonde de reactie in drievoud uit.
2. Formulering en karakterisering van de sensor
- Synthese het geconjugeerde DNA en protease-geactiveerd peptide (PAP).
- Incubeer 20-mer fosforothioated DNA-reporters met 3'-DBCO-groep (1,1 eq., zie materiaaltabel) met azide-geëindigde PAP's met C-terminuscysteïne en in 100 mM fosfaatbuffer (pH 7,0) bij kamertemperatuur gedurende >4 uur. Als u het een nacht laat staan, incubeer dan bij 4 °C.
- Zuiver het product op een HPLC-systeem (High-Performance Liquid Chromatography) dat is uitgerust met een kolom die ideaal is voor biomoleculen (zie Materiaaltabel). Stel de HPLC-gradiënt in om te beginnen met 5% A-buffer (0.05% TFA in H2O), isocratisch gedurende 20 minuten en bereik 80% B-buffer (0.05% TFA, 99.95% acetonitril) na 65 minuten met een stroomsnelheid van 0.3 ml min-1, en verzamel het geconjugeerde product met retentietijd op ~31 min.
- Valideer de gezuiverde conjugaten door middel van matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie-time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie met behulp van α-cyano-4-hydroxykaneelzuur als matrix14 (zie Materiaaltabel).
- Synthese de DNA-gecodeerde op activiteit gebaseerde nanosensoren.
- Los 2 mg multivalente PEG (40 kDa, 8-armig, zie materiaaltabel) op met de maleimide-reactieve groep in 1 ml 100 mM fosfaatbuffer (pH 7,0) en filter (afkapwaarde: 0,2 μm).
- Voeg de cysteïne-geëindigde DNA-peptideconjugaten (2 eq., zie Materiaaltabel) toe aan de PEG en reageer bij kamertemperatuur gedurende >4 uur. Als u het een nacht laat staan, incubeer dan bij 4 °C.
- Verwijder de niet-geconjugeerde materialen met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie met een in de handel verkrijgbare dextran-agarose-composietmatrixkolom op een snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC) (zie Materiaaltabel). Voer monsters uit in PBS en controleer de absorptie bij 260 nm voor DNA en 280 nm voor peptide.
- Concentreer de gesynthetiseerde nanosensoren met centrifugaalfilterbuizen (MWCO = 10 kDa) volgens de door de fabrikant aanbevolen snelheid (zie Materiaaltabel).
- Kwantificeer de concentratie van DNA met behulp van een ssDNA-testkit (zie Tabel met materialen) en een plaatlezer bij λex: 485 nm en λem: 535 nm. Bewaar de nanosensoren bij 4 °C.
- Karakteriseer de DNA-gecodeerde op activiteit gebaseerde nanosensoren.
- Meet de hydrodynamische deeltjesgrootte van DNA-gecodeerde nanosensoren door middel van dynamische lichtverstrooiing (DLS).
OPMERKING: Het verwachte groottebereik van nanosensoren is 15-50 nm, met een gemiddelde grootte van 20-30 nm. Als een beperkt groottebereik gewenst is, kan FPLC (in stap 2.3) worden gebruikt om smallere fracties met verschillende molecuulgewichten te isoleren. - Concentreer de nanosensoren tot 0,5 mg/ml (op basis van DNA-concentratie) met centrifugaalfilterbuizen (MWCO = 10 kDa) en laad de monsters op een met koolstoffilm gecoat koperen rooster dat op een cryohouder is gemonteerd. Observeer de morfologie met behulp van cryogene transmissie-elektronenmicroscopie (200 kV, vergroting van 10.000-60.000)14.
- Meet de hydrodynamische deeltjesgrootte van DNA-gecodeerde nanosensoren door middel van dynamische lichtverstrooiing (DLS).
3. Sensorinjectie en urineopvang
- Verzamel urine voor nulmeting.
- Plaats de muis in een aangepaste behuizingskamer (zie aanvullende afbeelding 1) met een plaat met 96 putjes als basis.
- Houd de muis in bedwang en oefen lichte druk uit op de blaas om eventuele resterende urine op het bord te legen.
- Pipeteer de opgevangen urine (~100-200 μL) van de plaat met 96 putjes in een buisje van 1,5 ml nadat u de muis hebt teruggeplaatst in de normale behuizing.
- Stel een preklinisch muizentumormodel op.
- Inoculeer vrouwelijke muizen van 6 tot 8 weken oud met BALB/c door intraveneuze injectie met MC26-Fluc-cellijn die luciferase tot expressie brengt (100k cellen/muis) (zie Materiaaltabel). Bewaak wekelijks de tumorprogressie met behulp van een in vivo fluorescentiebeeldvormingssysteem.
OPMERKING: Zichtbare tumorbelasting aangegeven door een luminescent signaal treedt ongeveer op in week 2 van injectie van deze specifieke cellijn. Controleer regelmatig tumordragende dieren tijdens de tumorprogressie.
- Inoculeer vrouwelijke muizen van 6 tot 8 weken oud met BALB/c door intraveneuze injectie met MC26-Fluc-cellijn die luciferase tot expressie brengt (100k cellen/muis) (zie Materiaaltabel). Bewaak wekelijks de tumorprogressie met behulp van een in vivo fluorescentiebeeldvormingssysteem.
- Injecteer nanosensoren op verschillende tijdstippen na implantatie van de tumor.
- Bereid een injectieoplossing (maximaal volume van 200 μl) met nanosensoren in een concentratie van 1 nmol met DNA-streepjescode in steriele PBS.
- Injecteer 200 μL sensoroplossing in PBS intraveneus in elke experimentele muis.
- Verzamel urinemonsters van gezonde controle- en tumordragende muizen 1 uur na sensorinjectie zoals beschreven in stap 1.1-1.3.
OPMERKING: Verse urinemonsters kunnen direct worden verwerkt tot DNA-barcode-analyse of onmiddellijk op ijs worden ingevroren.
4. CRISPR-detectie van DNA-barcodes: op basis van fluorescentie
- Gebruik verse urinemonsters of ontdooi bevroren monsters op ijs. Centrifugeer urinemonsters op 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Combineer de reagentia in aanvullende tabel 2, voeg als laatste het Cas12a-enzym (zie materiaaltabel) toe en meng de reactie voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 30 min.
- Voer de reactie van de verslaggever, zoals weergegeven in aanvullende tabel 3, in drievoud uit met behulp van het product van stap 2. Voeg de reactie van stap 2 als laatste toe en breng snel naar de plaatlezer.
- Detecteer LbaCas12a-activering door gedurende 3 uur elke 2 minuten fluorescentie te meten met een plaatlezer bij 37 °C (λex: 485 nm en λem: 535 nm) om de splitsingkinetiek van de DNA-reporter te controleren.
- Om de fluorescerende meetgegevens te analyseren, gebruikt u het Python-pakket voor enzymkinetische analyse dat beschikbaar is op https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Dit script berekent de initiële reactiesnelheid (V0) met behulp van de helling van de lineaire fit van de eerste 8-10 initiële tijdstippen.
5. CRISPR-detectie van DNA-barcodes: op papier
- Centrifugeer urinemonsters op 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
NOTITIE: Voer de urinemonsters voor CRISPR-detectie op basis van fluorescentie en papier parallel uit. - Combineer de reagentia in aanvullende tabel 2. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
OPMERKING: Deze incubatiestap is identiek aan die voor de op fluorescentie gebaseerde CRISPR-detectie. - Voer de reporterreactie uit met behulp van FAM-biotine gelabelde DNA-reporter voor laterale flow-assay op een papieren strook (zie Tabel met materialen). Combineer de reagentia in aanvullende tabel 4 in een plaat met 96 putjes met behulp van het product van stap 2. Dek af met aluminiumfolie en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
NOTITIE: Selecteer de optimale incubatietijd volgens de real-time kinetische monitoring in de hierboven beschreven op fluorescentie gebaseerde CRISPR-detectietest. - Voeg aan een nieuw putje van een plaat met 96 putjes 80 μL PBS toe. Voeg 20 μL monster van stap 3 toe aan dit putje.
- Plaats een strookpapier met zijstroom in elk putje en wacht tot de vloeistof de bovenkant van de strook bereikt (<5 min). Zoek naar het uiterlijk van de controle- en/of monsterband(en) op de papieren strook.
- Maak een foto van de laterale stroomstrook en kwantificeer de bandintensiteit met behulp van ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nomineren van protease-geactiveerde peptidesubstraten
Om sensoren te ontwerpen die veranderingen in de proteolytische activiteit van het weefsel weerspiegelen, wordt de protease-activiteit in het weefsel eerst gekarakteriseerd met behulp van een bibliotheek van peptidesondes13 (Figuur 1). Verse en ingevroren weefselmonsters kunnen substantiële informatie verschaffen over de proteolytische activiteit van de micro-omgeving van de tumor door weefselmonsters te combineren met FRET-sondes die zijn ontworpen om substraatsplitsing te detecteren. Een bibliotheek van FRET-sondes met een FAM-fluorofoor en een CPQ-2-quencher wordt geïncubeerd met weefselmonsters. Sondes met het grootste verschil in splitsingssnelheid tussen schijnweefsel en tumorweefsel, zoals gemeten met fluorescentiespectrofotometrie, worden geselecteerd als peptide linkers voor gebruik in de in vivo nanosensoren (Figuur 1A). Om de fysiologie van de tumoromgeving beter te begrijpen en protease-expressieprofielen effectief te vergelijken met activiteitsprofielen, kunnen de FRET-sondes worden geïncubeerd met recombinante proteasen om substraatsplitsing te associëren met specifieke protease-activiteit, zoals aangetoond met twee voorbeeldsondes in figuur 1B.
Formulering en karakterisering van de sensor
De nanosensoren zijn samengesteld uit een polymere kern, peptiden en enkelstrengs DNA-barcodes, zoals weergegeven in figuur 2A. De polymere kernen zijn 40 kDa, PEG-dendrimeren die fungeren als dragers voor maximaal 8 peptide-DNA-conjugaten (Figuur 2B). De peptiden, ~1,4 kDa, verbinden de kern en het DNA met een aminozuursequentie die is ontworpen om te worden gesplitst door proteolytische activiteit. De enkelstrengs DNA-barcode is 20 basenparen lang, ~6,8 kDa, en chemisch gemodificeerd voor verbeterde stabiliteit in vivo. Na conjugatie wordt het peptide-DNA-construct gezuiverd via HPLC, waardoor de geconjugeerde en vrije bestanddelen kunnen worden gescheiden (Figuur 2C). Massaspectrometrie-analyse geeft aan dat het conjugaat een molecuulgewicht heeft van 8,283 kDa, wat te verwachten is gezien de samenstellende molecuulgewichten voor de peptide- en DNA-streepjescode van respectievelijk 1,4 kDa en 6,8 kDa. Het peptide-DNA-conjugaat wordt verder geconjugeerd aan het PEG-dendrimeer. De resulterende sensor wordt gezuiverd met behulp van FPLC om vrij peptide-DNA te verwijderen, dat een langere retentietijd vertoont in vergelijking met de gePEGyleerde sensoren (Figuur 2D). De grootte van de sensor kan worden gekarakteriseerd via dynamische lichtverstrooiing en cryogene transmissie-elektronenmicroscopie, die wijzen op een toename van de diameter na toevoeging van peptide-DNA aan de kern van ~8 nm tot ~20 nm (Figuur 2B). Variatie in deeltjesgrootte kan te wijten zijn aan de flexibiliteit van de samenstellende ketens en een variabel aantal peptide-DNA-armen die aan elk PEG-dendrimeer zijn geconjugeerd.
Preklinisch model voor muizenziekte
In vivo werk om de sensoren te testen omvat het vaststellen van tumoren gedurende 3 weken in de longen van BALB/c-muizen, het injecteren van de nanosensoren en het verzamelen van urine 1 uur na sensorinjectie (Figuur 3A). Voorafgaand aan de inoculatie van de tumor wordt ook een basislijnurinemonster genomen om te vergelijken met monsters na ziekte-inductie. Om de werkzaamheid van de sensor bij het detecteren van maligniteit te beoordelen, wordt colorectale kankercellijn MC26 (MC26-Fluc) met luciferase-expressie intraveneus geïnjecteerd, wat resulteert in longtumorknobbeltjes die zichtbaar zijn in in vivo luminescentiebeeldvorming. Hematoxyline- en eosinekleuring13 onthult histopathologie van het longweefsel van respectievelijk tumordragende en schijncontrolemuizen, en bewijs van tumorvorming 11 en 21 dagen na injectie, zoals aangegeven door zwarte pijlen in figuur 3B.
CRISPR-activering door chemisch gestabiliseerd DNA
Om Cas12a-activering via ssDNA-barcodes en complementaire crRNA-paren te optimaliseren, zijn verschillende oligonucleotidesequenties en lengtes getest. Activering van Cas12a wordt beoordeeld door de toename van fluorescentie in de loop van de tijd te meten als gevolg van Cas12a-splitsing van omstander-DNA-verslaggever met een FRET-koppeling. Een toename van de splitsingssnelheid wordt geassocieerd met hogere concentraties van chemisch gemodificeerde ssDNA-streepjescode, zoals weergegeven met een representatief crRNA/streepjescodepaar (Figuur 4B). Belangrijk is dat een lineair verband tussen concentratie en activering, zoals weergegeven in figuur 4B, het mogelijk maakt om de uitlezing te weerspiegelen van de aanwezigheid van DNA-streepjescodes in de urine en indirect de proteolytische activiteit in vivo te weerspiegelen. Verder kunnen meerdere verschillende crRNA-sequenties, zoals beschreven in aanvullende tabel 1, worden gebruikt voor Cas12a-activering, wat van cruciaal belang is om multiplexing mogelijk te maken. DNA-activatoren zijn geselecteerd voor de constructie van in vivo sensoren op basis van hun gelijkenis in testprestaties. Het chemisch gemodificeerde ssDNA, dat cruciaal is voor de in vivo stabiliteit van de synthetische biomarker, vertoonde Cas12a-activering, in vergelijking met niet-gemodificeerd dsDNA en ssDNA (Figuur 4C).
Meervoudige urinaire detectie van chemisch gestabiliseerde DNA-barcodes
Meerdere crRNA-gemodificeerde enkelstrengs DNA (ssDNA) activatorparen zijn geverifieerd op hun orthogonaliteit tussen verschillende sequenties. Dit maakt gelijktijdige uitlezing in meerdere puttesten mogelijk, zoals weergegeven in figuur 5A. Bovendien kunnen gemodificeerde DNA-moleculen in onbewerkte urine worden gedetecteerd met behulp van een colorimetrische uitlezing op laterale papieren stroken, zoals weergegeven in figuur 5B. De aanwezigheid van de leidende 'monsterband' duidt op het vrijkomen van detecteerbare FAM door de splitsing van de verslaggever nadat Cas12a is getriggerd door het urine-DNA. Wanneer Cas12a wordt geactiveerd door de DNA-activator in muizenurine, splitst het de fluoresceïne (FAM)-biotine-gepaarde oligonucleotide-reporter, waardoor het FAM-molecuul vrijkomt, dat vervolgens detecteerbaar is op de 'monsterband'. Uncleaved-verslaggevers worden gevangen op de 'controleband' vanwege de binding van biotine aan streptavidine. Nanosensoren worden geselecteerd voor in vivo experimenten en geconstrueerd met behulp van protease-activeerbare peptiden en verschillende DNA-barcodes. Peptiden worden genomineerd door middel van ex vivo weefselprofilering (Figuur 1A) en DNA-barcodes worden geselecteerd op basis van vergelijkbare Cas12a-activering (Figuur 4B).
Figuur 1: Identificatie van peptidesubstraten geactiveerd door ontregelde proteasen in colorectale kanker voor sensorconstructie. (A) FRET-gepaarde peptidesubstraten, elk bestaande uit een peptidesequentie geflankeerd door een FAM-fluorofoor en een CPQ-2-quencher, worden gescreend tegen recombinante proteolytische enzymen of weefselhomogenaten. (B) Representatieve protease-splitsingskinetiek van FRET-gepaarde peptidesubstraten (sonde 1 en 2). De figuur is een bewerking van Hao et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van DNA-gebarcodeerde activity-based nanosensor met een polymere PEG-kern. (A) DNA-gebarcodeerde nanosensoren bestaan uit polymere nanocarriers (8-armige PEG) gefunctionaliseerd met protease-geactiveerde peptiden met een barcode met oligonucleotiden. (B) Dynamische lichtverstrooiingsanalyse toont een toename van de deeltjesgrootte van 8,3 nm (alleen PEG-kern) en 13 nm (gefunctionaliseerde sensor). (C) HPLC-zuivering van peptide-DNA-conjugaat. Het conjugaat wordt geanalyseerd in massaspectrometrie en toont het verwachte molecuulgewicht. (D) FPLC-zuivering van de sensor toont scheiding van gefunctionaliseerde sensor en onbegrensd peptide-DNA-conjugaat. De figuur is een bewerking van Hao et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In vivo ziekte-inductie en sensorgebruik. (A) Tijdlijn van longitudinale tumormonitoring met nanosensor op verschillende tijdstippen tijdens de ontwikkeling van de tumor. (B) Histologische longkleuring van BALB/c-muizen met CRC-longtumoren 11 en 21 dagen na inoculatie van de tumor en met zoutoplossing geïnjecteerde Sham-controlemuizen. Schaalbalk = 200 μm. Organen werden gefixeerd, ingebed in paraffine en gekleurd met hematoxyline en eosine. Het onderzoek is gedaan met n = 3 muizen per tijdstip en er worden beelden getoond van een representatief dier. Pijlen geven tumorknobbeltjes in de long aan. De figuur is een bewerking van Hao et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Cas12a-activering door chemisch gestabiliseerde DNA-activatoren. (A) Activering van Cas12a door een representatieve ssDNA-streepjescode door binding met complementair crRNA resulteert in transsplitsing van DNA van omstanders op een dosisafhankelijke manier, zoals gemeten door fluorescentie-intensiteit via spectrofotometer. (B) De aanvankelijke reactiesnelheid (V0) wordt bepaald aan de hand van de helling van de curve aan het begin van een reactie in (A) en uitgezet om het lineaire bereik van de testprestaties te bepalen. (C) Cas12a-activering door dubbelstrengse, enkelstrengs en chemisch gemodificeerde DNA-activatoren. De figuur is een bewerking van Hao et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Meervoudige CRISPR-Cas12-gemedieerde DNA-barcode-uitlezing met twee detectieopties. (A) Transsplitsingspercentages van Cas12a na activering van verschillende gemodificeerde ssDNA-activator-crRNA-paren worden bepaald in de Cas12a fluorescerende splitsingstest. Assays worden uitgevoerd met urinemonsters verzameld van muizen die zijn geïnjecteerd met 1 nmol gemodificeerde ssDNA-activator na 1 uur intraveneuze toediening. De figuur is een bewerking van Hao et al.13. (B) Papieruitlezing van door urinemonsters geactiveerd Cas12a met colorimetrische veranderingen verschijnt op verschillende locaties van de papierstrook. De bovenste band is van de gespleten FAM-DNA-reporter en de onderste band is van de FAM-biotine-reporter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende afbeelding 1: Urineopvangkamer om over een plaat met 96 putjes te plaatsen. De muis wordt tijdelijk in de cilinder geplaatst om in de plaat met 96 putjes te plassen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Oligo- en peptidesequenties voor sensorformulering en CRISPR-test. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Reagentia voor Cas12a-reacties op basis van fluorescentie en op papier gebaseerde en urinemonsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 3: Reagentia van reporterreactie voor op fluorescentie gebaseerde CRISPR-detectie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 4: Reagentia van reporterreactie voor CRISPR-detectie op papier. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een zeer aanpasbaar platform gepresenteerd voor gemultiplexte kankerdetectie met een draagbare urinetest die ziekte-geassocieerde proteolytische activiteit beoordeelt met behulp van een minimaal invasieve geïnjecteerde sensor. Wanneer geactiveerd door tumorproteasen, wordt de splitsing van het peptidesubstraat versterkt via het vrijkomen van DNA-streepjescodes in de urine. De synthetische DNA-reporters in een urinemonster kunnen worden uitgelezen door een secundaire CRISPR-Cas-gemedieerde enzymatische amplificatie met behulp van fluorometrische detectie of een eenvoudige papieren test. DNA-barcodering is een aantrekkelijke methode voor het labelen van synthetische biomarkers om multiplexiteit mogelijk te maken. Het verbeteren van de stabiliteit van de DNA-barcodes door middel van chemische modificatie is absoluut noodzakelijk om de stabiliteit van de nanosensor in vivo te behouden. In het bijzonder kan DNA-barcodedetectie via CRISPR-Cas12a worden geactiveerd met behulp van volledig fosforothioaat-gemodificeerde DNA-barcodes met een gestabiliseerde ruggengraat. De chemische modificatie vermindert echter de snelheid van CRISPR-Cas12a-activering ten opzichte van zijn oorspronkelijke DNA-tegenhanger, vanwege de verhoogde stabiliteit. Verder kan het invoegen van terminale modificaties in het crRNA of het testen van verschillende gemodificeerde oligonucleotiden in de DNA-barcodes de gevoeligheid van de CRISPR-gemedieerde DNA-barcodedetectieverder verhogen 15, waardoor de detectielimiet (LOD) van kankerdiagnostiek wordt verbeterd.
Naast moleculaire amplificatie is een andere belangrijke strategie om de LOD te bereiken die nodig is voor vroege opsporing van kanker, het gebruik van groottefiltratie door de nieren om de synthetische DNA-verslaggevers in urine te concentreren. Daartoe is het van cruciaal belang om de grootte van de DNA-barcodes te optimaliseren. 20-mer crRNA-complementair DNA vertoonde een optimale CRISPR-Cas12a-gemedieerde DNA-barcode-uitlezing van de urinemonsters. Deze optimale lengte kan verschillen wanneer deze wordt toegepast op verschillende CRISPR-nucleasen of preklinische diermodellen.
Om de reproduceerbaarheid van dit detectiesysteem te behouden, is het belangrijk om een grondige karakterisering van de injecteerbare nanosensoren uit te voeren om variatie tussen batches te minimaliseren. Variatie in het aantal peptide-DNA-conjugaten per kern zal de hoeveelheid DNA-barcodes die in de urine vrijkomen veranderen en daarom de uiteindelijke uitlezing beïnvloeden. Evenzo zal een zorgvuldige intraveneuze injectie van de sensor de consistentie van de sensordosering ten goede komen. Om ervoor te zorgen dat op een bepaald tijdstip een passende urineverzameling van ten minste 50 μL urinevolume van elk dier wordt verzameld, is het van cruciaal belang om de hydratatie van tumordragende dieren te handhaven. Dit kan worden ondersteund door de muizen op niet-bevochtigende watergel te houden of PBS een uur voor het verzamelen van urine subcutaan te injecteren16.
De timing van de urineverzameling en de duur van de CRISPR-Cas-gemedieerde DNA-barcode-uitlezing zijn kritische factoren voor de consistentie van de test. Barcodes in omloop ondergaan een karakteristiek enkelvoudig exponentieel concentratieverval na intraveneuze injectie en grootte-afhankelijke nierfiltratie uit het bloed, met een piek 1 uur na toediening in muismodellen13. Dit tijdstip kan variëren in een ander diermodel. Voor de twee uitleesformaten van CRISPR-Cas-activeringstests (fluorescerende versus op papier gebaseerde laterale flow-assay) is het belangrijk om de op fluorescentie gebaseerde kinetiek voorafgaand aan de laterale stroom te volgen, waardoor het optimale eindpunt mogelijk is om het CRISPR-Cas-splitsingsproduct af te lezen.
Deze aanpak is voordelig vanwege de integratie van dubbele signaalversterkingsstappen van proteolytische en CRISPR-Cas-gemedieerde enzymatische activering, en het multiplexingvermogen om de complexiteit van de ziekte vast te leggen. Het uitbreiden van de multiplexiteit van de sensoren vereist een zorgvuldige materiaaldosering en een uitbreiding van de doorvoer van de uitlezing om de draagbaarheid en het gebruiksgemak te behouden. Deze strategie vereist een grondige karakterisering van de protease-activiteit in meerdere modellen en de specificiteit van het proteolytische profiel ten opzichte van een bepaalde ziekte of ziektestadium. Verder, hoewel sensorinjectie minder invasief is dan veel van de diagnostische alternatieven zoals biopsie, kan intraveneuze injectie afhankelijk zijn van getrainde flebotomisten voor sensortoediening, waardoor de use-case mogelijk wordt beperkt tot ziektemonitoring in plaats van initiële detectie in een klinische setting. Naast systemische injectie kunnen de DNA-barcode-nanosensoren verder worden ontwikkeld met formuleringen die kunnen worden toegepast via niet-invasieve orale, geïnhaleerde en lokale toediening, om draagbare ziektedetectie en eenvoudige zelfcontrole van ziekteprogressie en therapiebeoordeling mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.N.B., L.H. en R.T.Z. worden vermeld als uitvinders op een octrooiaanvraag met betrekking tot de inhoud van dit werk. S.N.B. heeft aandelen in Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, en is bestuurder bij Vertex; consulteert voor Moderna en ontvangt gesponsorde onderzoeksfinanciering van Johnson & Johnson, Revitope en Owlstone.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een Koch Institute Support Grant nummer P30-CA14051 van het National Cancer Institute (Swanson Biotechnology Center), een Core Center Grant P30-ES002109 van het National Institute of Environmental Health Sciences, het Koch Institute's Marble Center for Cancer Nanomedicine, het Koch Institute Frontier Research Program via het Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund, en het Virginia en D. K. Ludwig Fonds voor Kankeronderzoek. A.E.V.H. wordt ondersteund door een door de NIH gefinancierde predoctorale opleidingsbeurs (T32GM130546). S.N.B. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute. L.H. wordt ondersteund door een K99/R00 Pathway to Independence Award van het National Cancer Institute en de startfinanciering van Boston University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
- Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
- Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities. ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).
- Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).
- Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. Harnessing protease activity to improve cancer care. Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).
- Hanahan, D.
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Kwong, G. A., et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).
- Kirkpatrick, J. D., et al. Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling. Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).
- Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).
- Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Choi, H. S., et al.
- Hao, L., et al. CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics. Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).
- Hao, L., et al.
- Ghanta, K. S., et al. 5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing. Elife. 10, e72216 (2021).
- Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. Dehydration parameters and standards for laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).
