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Bioengineering

Prueba de biomarcadores de orina sintéticos multianalito mediada por CRISPR-Cas para diagnósticos portátiles

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/66189
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 3,4, 2,3,4,5,6,7,8, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Institute for Medical Engineering and Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Howard Hughes Medical Institute, 5Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard, 6Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 8Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School

Summary

Este protocolo describe una prueba de biomarcadores de orina sintética multianalito mediada por CRISPR-Cas que permite el diagnóstico del cáncer en el punto de atención a través del análisis ex vivo de las actividades de la proteasa asociadas al tumor.

Abstract

La creación de biomarcadores sintéticos para el desarrollo de diagnósticos de precisión ha permitido la detección de enfermedades a través de vías más allá de las utilizadas para las mediciones tradicionales de biofluidos. Los biomarcadores sintéticos generalmente hacen uso de reporteros que proporcionan señales legibles en el biofluido para reflejar las alteraciones bioquímicas en el microambiente local de la enfermedad durante la incidencia y progresión de la enfermedad. La concentración farmacocinética de los reporteros y la amplificación bioquímica de la señal de la enfermedad son primordiales para lograr una alta sensibilidad y especificidad en una prueba diagnóstica. Aquí, se construye una plataforma de diagnóstico de cáncer utilizando un formato de biomarcadores sintéticos: nanosensores basados en la actividad que llevan reporteros de ADN estabilizados químicamente que pueden ser liberados por firmas proteolíticas aberrantes en el microambiente tumoral. El ADN sintético como indicador de enfermedades ofrece la capacidad de multiplexación a través de su uso como código de barras, lo que permite la lectura de múltiples firmas proteolíticas a la vez. Los reporteros de ADN liberados en la orina se detectan utilizando nucleasas CRISPR a través de hibridación con ARN CRISPR, que a su vez producen una señal fluorescente o colorimétrica tras la activación enzimática. En este protocolo, se construyen nanosensores basados en la actividad y con código de barras de ADN, y su aplicación se ejemplifica en un modelo de ratón preclínico de cáncer colorrectal metastásico. Este sistema es altamente modificable de acuerdo con la biología de la enfermedad y genera múltiples señales de enfermedad simultáneamente, lo que permite una comprensión integral de las características de la enfermedad a través de un proceso mínimamente invasivo que solo requiere la administración de nanosensores, recolección de orina y una prueba en papel que permite el diagnóstico en el punto de atención.

Introduction

A pesar del importante esfuerzo realizado para identificar biomarcadores tumorales, como las proteínas de excreción y el ADN, el campo del diagnóstico del cáncer se ha visto afectado por su baja abundancia o rápida degradaciónen la circulación. Como estrategia complementaria, los biomarcadores sintéticos de bioingeniería que responden selectivamente a las características de la enfermedad para generar señales amplificadas representan nuevas vías hacia diagnósticos precisos y accesibles 2,3. Para ayudar a la detección, estos biomarcadores sintéticos aprovechan los mecanismos de activación dependientes del tumor, como la amplificación enzimática, para producir analitos con una mejor relación señal-ruido4. Aquí, una clase de enzimas asociadas al cáncer, las proteasas, se aprovechan para activar sensores inyectables a nanoescala para liberar indicadores de enfermedades detectables en los biofluidos como la sangre o la orina 5,6. A la luz de la heterogeneidad tumoral, el desarrollo de un panel de sensores activados por proteasa permite realizar pruebas multianalito que combinan diferentes eventos de escisión de proteasas en una "firma de enfermedad" para evaluar la incidencia y la progresión del cáncer de una manera más específica y multiplexada.

Se han desarrollado biomarcadores sintéticos activados por proteasa que comprenden sustratos peptídicos conjugados con la superficie de un portador inerte7. Cuando se inyectan in vivo, estos péptidos son transportados al tumor, tras lo cual la escisión enzimática por las proteasas tumorales libera reporteros en la sangre o la orina para su detección. La detección multiplexada con biomarcadores sintéticos activados por proteasa requiere que cada biomarcador sintético dentro de un cóctel se etiquete con un código de barras molecular único. Con este fin, se han desarrollado varios enfoques, incluidos los códigos de barras de masa y los reporteros codificados por ligandos 8,9,10. A diferencia de estos métodos de multiplexación, que pueden limitarse a unas pocas posibilidades de señal diferentes, el código de barras de ADN ofrece muchas más combinaciones de acuerdo con la alta complejidad y heterogeneidad de los estados de enfermedad humanos. Para ampliar la multiplexidad de los biomarcadores sintéticos, los sensores tienen un código de barras etiquetando cada reportero con una secuencia de ADN única para su detección a través de la nucleasa CRISPR-Cas para amplificar la señal biofluídica ex vivo. Estos códigos de barras de ADN monocatenario (ssDNA) están diseñados para unirse a ARN guía CRISPR (crRNA) complementarios, activando la actividad de la nucleasa colateral activada por el objetivo de CRISPR-Cas12a11. Esta actividad nucleasa se puede emplear para escindir una cadena de ADN reportera detectada a través de la cinética de fluorescencia o utilizando tiras de papel.

Además de la amplificación molecular a través de proteasas (in vivo) y CRISPR-Cas (ex vivo), otra característica clave del diseño de los biomarcadores sintéticos activados por proteasa consiste en aprovechar la farmacocinética de nanomateriales para aumentar la concentración de señales diagnósticas en biofluidos10. Un enfoque es el uso de un portador de nanopartículas para aumentar el tiempo de circulación de sustratos peptídicos conjugados en superficie. Se selecciona un dendrímero de polietilenglicol (PEG) como nanotransportador con un diámetro hidrodinámico relativamente pequeño y multivalencia para aumentar la administración a los tumores. Si bien es lo suficientemente pequeño como para promover la entrega del tumor, el tamaño del portador de PEG es mayor que el límite de tamaño de ~ 5 nm de la barrera de filtración glomerular del riñón, de modo que solo los sustratos peptídicos escindidos pueden eliminarse en la orina, aprovechando la filtración de tamaño por parte de los riñones12. En este protocolo, se describe el flujo de trabajo de varios pasos para la síntesis y aplicación de nanosensores basados en actividad con código de barras de ADN en un modelo murino preclínico, destacando la configuración de la prueba de biomarcadores de orina sintética multianalito mediada por CRISPR-Cas, que ha sido empleada por este grupo para clasificar el estado de la enfermedad en modelos murinos de múltiples tipos de cáncer13. Gracias al principio de diseño versátil, los tres componentes funcionales del nanosensor -el nanoportador (polímero PEG), el módulo sensible a estímulos (sustrato activado por proteasa) y el reportero biofluídico (código de barras de ADN)- pueden intercambiarse con precisión según las necesidades específicas de la aplicación, lo que permite la modularidad adaptando las especificidades del objetivo y la liberación.

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Protocol

Todos los estudios en animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de la institución de los autores. Para llevar a cabo correctamente estos experimentos, se requieren instalaciones estándar para el cuidado de animales, incluidas cámaras de alojamiento, capuchas estériles, anestesia y eutanasia ética de punto final. Todos los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales y son supervisados por el personal veterinario de la institución. Los ratones hembra BALB/c, utilizados para los experimentos, se obtienen de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales) y su edad oscilaba entre 6 y 8 semanas al inicio del estudio. En la Tabla Suplementaria 1 se proporcionan secuencias para ADN sintetizado a medida, crRNA, sondas de sustrato peptídico basadas en FRET y péptidos sensores.

1. Selección del sustrato peptídico activado por proteasa

  1. Recolectar y preparar muestras de tejido de pulmón sano o tejido pulmonar con nódulos tumorales siguiendo un informe publicado previamente13.
    1. Homogeneizar tejidos en solución salina tamponada con fosfato preenfriada (PBS, pH 7,4) (200 mg de tejido/mL de PBS) con tubos de disociación tisular para la disociación automatizada de tejidos en suspensiones unicelulares.
    2. El tejido de centrifugación homogeneiza a 6.000 x g durante 5 min a 4 °C. Retenga el sobrenadante en un tubo nuevo.
    3. Centrifugar el sobrenadante a 14.000 x g durante 25 min a 4 °C.
    4. Mida la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (consulte la tabla de materiales).
    5. Agregue PBS a la muestra para preparar una solución de 0,33 mg/ml.
  2. Evalúe la actividad proteolítica siguiendo los pasos que se indican a continuación.
    1. En una placa de 384 pocillos, agregue 5 μL y 6 μM de sondas de sustrato peptídico a base de FRET a cada pocillo. Para cada sonda, realice la reacción por triplicado.
      NOTA: La sonda de sustrato peptídico basada en FRET contiene una secuencia peptídica corta (6-8 aminoácidos, diseñada para ser específica de una proteasa diana o grupo de proteasas) terminada con un par de fluoróforos y extintores. En la Tabla complementaria 1 se describen dos sondas FRET a modo de ejemplo. La biblioteca completa de sondas se puede encontrar en Hao et al.13.
    2. Centrifugar la placa de pocillos durante 10 s a temperatura ambiente a 180 x g para asegurarse de que las sondas estén en la parte inferior de la placa.
    3. Añadir 25 μL de muestra de tejido de 0,33 mg/mL o 40 μM de proteasa recombinante13 a cada pocillo.
      NOTA: Es posible que sea necesario optimizar la concentración final de la muestra de tejido o de la proteasa recombinante de acuerdo con su actividad proteolítica intrínseca. Por ejemplo, los tejidos altamente proteolíticos, como los intestinos, pueden requerir factores de dilución más altos para permitir el control de la escisión enzimática inicial.
    4. Centrifugar brevemente la placa del pocillo a 180 x g (a temperatura ambiente) para mezclar las sondas y los lisados de tejidos.
    5. Comience inmediatamente a detectar la escisión de la sonda midiendo la fluorescencia con el lector de placas a 37 °C cada 2 minutos durante 1 h (λex: 485 nm; λem: 535 nm) para controlar la escisión.
      NOTA: Utilice las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas para pares específicos de fluoróforos y extintores. En el caso de este estudio, se establecen parámetros (λex: 485 nm y λem: 535 nm) para el fluoróforo FAM.
    6. Para analizar los datos de medición fluorescentes, utilice el paquete Python (consulte la Tabla de materiales) para el análisis cinético de enzimas disponible en https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Este script calcula la velocidad de reacción inicial (V0) utilizando la pendiente del ajuste lineal de los primeros 8-10 puntos de tiempo iniciales.

2. Formulación y caracterización de sensores

  1. Sintetizar el conjugado de ADN y péptido activado por proteasa (PAP).
    1. Incubar reporteros de ADN fosforotiados de 20 meros con el grupo 3'-DBCO (1,1 eq., ver Tabla de Materiales) con PAPs terminados en azida con extremo de cisteína C-terminal en tampón fosfato de 100 mM (pH 7,0) a temperatura ambiente durante >4 h. Si se deja pasar la noche, incubar a 4 °C.
    2. Purificar el producto en un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) equipado con una columna ideal para biomoléculas (ver Tabla de Materiales). Establezca el gradiente de HPLC para que comience con un tampón A del 5 % (0,05 % de TFA en H2O), manténgalo isocrático durante 20 minutos y alcance el tampón B del 80 % (0,05 % de TFA, 99,95 % de acetonitrilo) a los 65 min con un caudal de 0,3 ml min-1, y recoja el producto conjugado con un tiempo de retención de ~31 min.
    3. Validar los conjugados purificados mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) utilizando ácido α-ciano-4-hidroxicinámico como matriz14 (ver Tabla de Materiales).
  2. Sintetizar los nanosensores basados en la actividad codificados por ADN.
    1. Disolver 2 mg de PEG multivalente (40 kDa, 8 brazos, ver Tabla de Materiales) con grupo reactivo a la maleimida en 1 mL de tampón fosfato 100 mM (pH 7,0) y filtro (punto de corte: 0,2 μm).
    2. Agregue los conjugados de péptido de ADN terminados en cisteína (2 eq., ver Tabla de materiales) al PEG y reaccione a temperatura ambiente durante >4 h. Si se deja pasar la noche, incubar a 4 °C.
    3. Eliminar los materiales no conjugados mediante cromatografía de exclusión por tamaño con una columna de matriz compuesta de dextrán-agarosa disponible comercialmente en una cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) (ver Tabla de materiales). Realice muestras en PBS y controle la absorbancia a 260 nm para el ADN y a 280 nm para el péptido.
    4. Concentrar los nanosensores sintetizados con tubos filtrantes centrífugos (MWCO = 10 kDa) de acuerdo con la velocidad recomendada por el fabricante (ver Tabla de Materiales).
    5. Cuantifique la concentración de ADN utilizando un kit de ensayo de ssDNA (ver Tabla de materiales) y un lector de placas a λex: 485 nm y λem: 535 nm. Almacenar los nanosensores a 4 °C.
  3. Caracterizar los nanosensores basados en la actividad codificados por ADN.
    1. Mida el tamaño de partícula hidrodinámico de los nanosensores codificados por ADN mediante dispersión dinámica de luz (DLS).
      NOTA: El rango de tamaño esperado de los nanosensores es de 15-50 nm, con un tamaño promedio de 20-30 nm. Si se desea un rango de tamaño limitado, se puede utilizar FPLC (en el paso 2.3) para aislar fracciones más estrechas con diferentes pesos moleculares.
    2. Concentrar los nanosensores a 0,5 mg/mL (por concentración de ADN) con tubos de filtro centrífugo (MWCO = 10 kDa) y cargar las muestras en una rejilla de cobre recubierta de película de carbono montada en un criosoporte. Observar la morfología mediante microscopía electrónica de transmisión criogénica (200 kV, aumento de 10.000-60.000)14.

3. Inyección del sensor y recogida de orina

  1. Recoja orina para la medición de referencia.
    1. Coloque el mouse en una cámara de alojamiento personalizada (consulte la Figura complementaria 1) con una placa de 96 pocillos como base.
    2. Sujete al ratón y aplique una presión suave sobre la vejiga para eliminar cualquier resto de orina en el plato.
    3. Pipetee la orina recolectada (~100-200 μL) de la placa de 96 pocillos en un tubo de 1,5 ml después de reemplazar el mouse a la carcasa normal.
  2. Establecer un modelo tumoral murino preclínico.
    1. Inocular ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad mediante inyección intravenosa con la línea celular MC26-Fluc que expresa luciferasa (100k células/ratón) (ver Tabla de materiales). Monitorizar semanalmente la progresión tumoral mediante un sistema de imágenes de fluorescencia in vivo .
      NOTA: La carga tumoral visible indicada por la señal luminiscente ocurre aproximadamente en la semana 2 de la inyección de esta línea celular en particular. Revise cuidadosamente a los animales portadores de tumores durante la progresión del tumor de forma regular.
  3. Inyectar nanosensores en diferentes momentos después de la implantación del tumor.
    1. Preparar una solución inyectable (volumen máximo de 200 μL) que contenga nanosensores a una concentración de 1 nmol mediante código de barras de ADN en PBS estéril.
    2. Inyectar 200 μL de solución de sensor en PBS en cada ratón experimental por vía intravenosa.
  4. Recolecte muestras de orina de ratones control sanos y portadores de tumores 1 h después de la inyección del sensor, como se describe en los pasos 1.1-1.3.
    NOTA: Las muestras de orina fresca se pueden procesar directamente para el análisis de códigos de barras de ADN o congelarse inmediatamente en hielo.

4. Detección CRISPR de códigos de barras de ADN: basada en fluorescencia

  1. Use muestras de orina frescas o descongele muestras congeladas en hielo. Centrifugar muestras de orina a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  2. Combine los reactivos de la Tabla Suplementaria 2, agregue la enzima Cas12a (consulte la Tabla de Materiales) al final y mezcle suavemente la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar la reacción a 37 °C durante 30 min.
  3. Ejecute la reacción del reportero, como se muestra en la Tabla suplementaria 3, por triplicado utilizando el producto del paso 2. Agregue la reacción del paso 2 al final y llévela rápidamente al lector de placas.
  4. Detecte la activación de LbaCas12a midiendo la fluorescencia con un lector de placas a 37 °C cada 2 minutos durante 3 h (λex: 485 nm y λem: 535 nm) para monitorizar la cinética de escisión del reportero de ADN.
  5. Para analizar los datos de medición fluorescentes, utilice el paquete Python para el análisis cinético de enzimas disponible en https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Este script calcula la velocidad de reacción inicial (V0) utilizando la pendiente del ajuste lineal de los primeros 8-10 puntos de tiempo iniciales.

5. Detección CRISPR de códigos de barras de ADN: en papel

  1. Centrifugar muestras de orina a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Ejecute las muestras de orina para la detección CRISPR basada en fluorescencia y en papel en paralelo.
  2. Combine los reactivos de la Tabla Suplementaria 2. Incubar a 37 °C durante 30 min.
    NOTA: Este paso de incubación es idéntico al de la detección CRISPR basada en fluorescencia.
  3. Ejecute la reacción reportera utilizando un reportero de ADN marcado con FAM-biotina para el ensayo de flujo lateral en una tira de papel (consulte la Tabla de materiales). Combine los reactivos de la Tabla Suplementaria 4 en una placa de 96 pocillos utilizando el producto del paso 2. Cubrir con papel de aluminio e incubar a 37 °C durante 1 h.
    NOTA: Seleccione el tiempo de incubación óptimo de acuerdo con el monitoreo cinético en tiempo real en el ensayo de detección CRISPR basado en fluorescencia descrito anteriormente.
  4. A un pocillo nuevo de una placa de 96 pocillos, agregue 80 μL de PBS. Agregue 20 μL de muestra del paso 3 a este pocillo.
  5. Coloque una tira de papel de flujo lateral en cada pocillo y espere hasta que el líquido llegue a la parte superior de la tira (<5 min). Busque la apariencia de la(s) banda(s) de control y/o muestra(s) en la tira de papel.
  6. Tome una foto de la franja de flujo lateral y cuantifique la intensidad de la banda con ImageJ.

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Representative Results

Nominación de sustratos peptídicos activados por proteasa
Para diseñar sensores que reflejen los cambios en la actividad proteolítica del tejido, primero se caracteriza la actividad de la proteasa en el tejido utilizando una biblioteca de sondas peptídicas13 (Figura 1). Las muestras de tejido fresco y congelado pueden proporcionar información sustancial sobre la actividad proteolítica del microambiente tumoral mediante la combinación de muestras de tejido con sondas FRET diseñadas para detectar la escisión del sustrato. Con muestras de tejido se incuba una biblioteca de sondas FRET con un fluoróforo FAM y un extintor CPQ-2. Las sondas con la mayor diferencia en la tasa de escisión entre el tejido simulado y el tejido tumoral, medida por espectrofotometría de fluorescencia, se seleccionan como enlazadores de péptidos para su uso en los nanosensores in vivo (Figura 1A). Para comprender mejor la fisiología del entorno tumoral y comparar eficazmente los perfiles de expresión de proteasas con los perfiles de actividad, las sondas FRET pueden incubarse con proteasas recombinantes para asociar la escisión del sustrato con la actividad específica de la proteasa, como se demuestra con dos sondas de ejemplo en la Figura 1B.

Formulación y caracterización de sensores
Los nanosensores están compuestos por un núcleo polimérico, péptidos y códigos de barras de ADN monocatenario, como se muestra en la Figura 2A. Los núcleos poliméricos son dendrímeros PEG de 40 kDa que actúan como portadores de hasta 8 conjugados péptido-ADN (Figura 2B). Los péptidos, ~1,4 kDa, conectan el núcleo y el ADN con una secuencia de aminoácidos diseñada para ser escindida a través de la actividad proteolítica. El código de barras de ADN monocatenario tiene 20 pares de bases de longitud, ~6,8 kDa, y está modificado químicamente para mejorar la estabilidad in vivo. Después de la conjugación, la construcción péptido-ADN se purifica mediante HPLC, lo que permite la separación de los constituyentes conjugados y libres (Figura 2C). El análisis de espectrometría de masas indica que el conjugado tiene un peso molecular de 8,283 kDa, lo que se espera dados los pesos moleculares constituyentes para el péptido y el código de barras de ADN de 1,4 kDa y 6,8 kDa, respectivamente. El conjugado péptido-ADN se conjuga aún más con el dendrímero PEG. El sensor resultante se purifica mediante FPLC para eliminar el ADN peptídico libre, que presenta un tiempo de retención prolongado en comparación con los pegilados (Figura 2D). El tamaño del sensor se puede caracterizar mediante dispersión dinámica de la luz y microscopía electrónica de transmisión criogénica, que indican un aumento en el diámetro después de la adición de péptido-ADN al núcleo de ~ 8 nm a ~ 20 nm (Figura 2B). La variación en el tamaño de partícula puede deberse a la flexibilidad de las cadenas constituyentes y a un número variable de brazos peptídico-ADN conjugados a cada dendrímero PEG.

Modelo preclínico de enfermedad murina
El trabajo in vivo para probar los sensores consiste en establecer tumores durante 3 semanas en los pulmones de ratones BALB/c, inyectar los nanosensores y recolectar orina 1 h después de la inyección del sensor (Figura 3A). También se toma una muestra de orina de referencia antes de la inoculación del tumor para compararla con las muestras después de la inducción de la enfermedad. Con el fin de evaluar la eficacia del sensor en la detección de neoplasias malignas, se inyecta por vía intravenosa la línea celular de cáncer colorrectal con expresión de luciferasa MC26 (MC26-Fluc), lo que da lugar a nódulos tumorales de pulmón visibles en imágenes de luminiscencia in vivo . La tinción de hematoxilina y eosina13 revela la histopatología del tejido pulmonar de ratones portadores de tumores y ratones de control simulados, respectivamente, y evidencia de formación de tumores a los 11 y 21 días después de la inyección, como lo indican las flechas negras en la Figura 3B.

Activación de CRISPR por ADN químicamente estabilizado
Para optimizar la activación de Cas12a a través de códigos de barras de ADNss y apareamiento complementario de ARNcr, se han probado diferentes secuencias y longitudes de oligonucleótidos. La activación de Cas12a se evalúa midiendo el aumento de la fluorescencia a lo largo del tiempo debido a la escisión de Cas12a del reportero de ADN transeúnte con un apareamiento FRET. Un aumento en la tasa de escisión se asocia con concentraciones más altas de código de barras de ssDNA modificado químicamente, como se muestra con un par representativo de crRNA/código de barras (Figura 4B). Es importante destacar que una relación lineal entre la concentración y la activación, como se muestra en la Figura 4B, permite que la lectura refleje la presencia de códigos de barras de ADN en la orina e indirectamente refleje la actividad proteolítica in vivo. Además, se pueden utilizar múltiples secuencias de ARNcr diferentes, como se detalla en la Tabla suplementaria 1, para la activación de Cas12a, que es fundamental para permitir la multiplexación. Los activadores de ADN han sido seleccionados para la construcción de sensores in vivo en función de su similitud en el rendimiento de los ensayos. El ssDNA modificado químicamente, que es crítico para la estabilidad in vivo del biomarcador sintético, demostró la activación de Cas12a, en comparación con el dsDNA y el ssDNA no modificados (Figura 4C).

Detección urinaria multiplexada de códigos de barras de ADN estabilizados químicamente
Se han verificado múltiples pares de activadores de ADN monocatenario modificado con crRNA (ssDNA) por su ortogonalidad entre diferentes secuencias. Esto permite la lectura simultánea en múltiples ensayos de pocillos, como se muestra en la Figura 5A. Además, las moléculas de ADN modificadas en la orina no procesada se pueden detectar utilizando una lectura colorimétrica en tiras de papel de flujo lateral, como se muestra en la Figura 5B. La presencia de la "banda de muestra" principal indica la liberación de FAM detectable a través de la escisión del reportero después de que Cas12a es desencadenada por el ADN urinario. Cuando Cas12a es activado por el activador del ADN en la orina de ratón, escinde el reportero de oligonucleótidos emparejado fluoresceína (FAM) y biotina, liberando la molécula FAM, que luego es detectable en la "banda de muestra". Los reporteros desatados son capturados en la "banda de control" debido a la unión de la biotina a la estreptavidina. Los nanosensores se seleccionan para experimentos in vivo y se construyen utilizando péptidos activables por proteasa y códigos de barras de ADN distintos. Los péptidos se nominan a través de perfiles tisulares ex vivo (Figura 1A) y los códigos de barras de ADN se seleccionan en función de una activación similar de Cas12a (Figura 4B).

Figure 1
Figura 1: Identificación de sustratos peptídicos activados por proteasas desreguladas en cáncer colorrectal para la construcción de sensores. (A) Los sustratos peptídicos emparejados FRET, cada uno de los cuales consiste en una secuencia peptídica flanqueada por un fluoróforo FAM y un extintor CPQ-2, se examinan contra enzimas proteolíticas recombinantes u homogeneizados tisulares. (B) Cinética representativa de escisión de proteasas de sustratos peptídicos emparejados con FRET (Sonda 1 y 2). La figura es una adaptación de Hao et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Caracterización de un nanosensor basado en actividad con código de barras de ADN con un núcleo polimérico de PEG. (A) Los nanosensores con código de barras de ADN comprenden nanoportadores poliméricos (PEG de 8 brazos) funcionalizados con péptidos activados por proteasa con códigos de barras con oligonucleótidos. (B) El análisis dinámico de dispersión de luz muestra un aumento del tamaño de partícula de 8,3 nm (solo núcleo PEG) y 13 nm (sensor funcionalizado). (C) Purificación por HPLC del conjugado péptido-ADN. El conjugado se analiza en espectrometría de masas y muestra el peso molecular esperado. (D) La purificación FPLC del sensor muestra la separación del sensor funcionalizado y el conjugado peptídico-ADN no acotado. La figura es una adaptación de Hao et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Inducción de la enfermedad in vivo y utilización de sensores. (A) Cronología de la monitorización longitudinal del tumor con nanosensor en diferentes momentos del desarrollo tumoral. (B) Tinción histológica pulmonar de ratones BALB/c portadores de tumores pulmonares de CCR a los 11 y 21 días después de la inoculación del tumor y ratones de control Sham inyectados con solución salina. Barra de escala = 200 μm. Los órganos se fijaron, se incrustaron en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina. El estudio se realizó con n = 3 ratones por punto de tiempo y se muestran imágenes de un animal representativo. Las flechas indican nódulos tumorales en el pulmón. La figura es una adaptación de Hao et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Activación de Cas12a por activadores de ADN estabilizados químicamente. (A) La activación de Cas12a por un código de barras representativo de ssDNA a través de la unión con crRNA complementario da como resultado la transescisión del ADN del espectador de una manera dependiente de la dosis, medida por la intensidad de fluorescencia a través del espectrofotómetro. (B) La velocidad de reacción inicial (V0) se determina a partir de la pendiente de la curva al comienzo de una reacción en (A) y se representa para determinar el rango lineal del rendimiento del ensayo. (C) Activación de Cas12a por activadores de ADN bicatenarios, monocatenarios y modificados químicamente. La figura es una adaptación de Hao et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Lectura de código de barras de ADN mediado por CRISPR-Cas12 multiplexado con dos opciones de detección. (A) Las tasas de escisión trans de Cas12a tras la activación de diferentes pares modificados de ARNs-activador de ADNs-cr se determinan en el ensayo de escisión fluorescente de Cas12a. Los ensayos se realizan con muestras de orina recogidas de ratones inyectados con 1 nmol de activador de ADNss modificado después de 1 h de administración intravenosa. La figura es una adaptación de Hao et al.13. (B) La lectura en papel de Cas12a activada por muestra de orina con cambios colorimétricos aparece en diferentes lugares de la tira de papel. La banda superior es del reportero de ADN FAM escindido y la banda inferior es del reportero de FAM-biotina desatado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Cámara de recolección de orina para colocar sobre una placa de 96 pocillos. El ratón se coloca temporalmente dentro del cilindro para orinar en la placa de 96 pocillos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Secuencias de oligonucleótidos y péptidos para la formulación de sensores y el ensayo CRISPR. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Reactivos para Cas12a a base de fluorescencia y papel y reacción de muestra de orina. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 3: Reactivos de reacción reportera para la detección CRISPR basada en fluorescencia. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 4: Reactivos de reacción del reportero para la detección de CRISPR en papel. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Aquí se presenta una plataforma altamente personalizable para la detección multiplexada del cáncer con una prueba de orina portátil que evalúa la actividad proteolítica asociada a la enfermedad mediante un sensor inyectado mínimamente invasivo. Cuando es activada por las proteasas tumorales, la escisión del sustrato peptídico se amplifica a través de la liberación de códigos de barras de ADN en la orina. Los reporteros de ADN sintético en una muestra de orina se pueden leer mediante una amplificación enzimática secundaria mediada por CRISPR-Cas mediante detección fluorométrica o una prueba simple en papel. El código de barras de ADN es un método atractivo para etiquetar biomarcadores sintéticos para permitir la multiplexidad. Mejorar la estabilidad de los códigos de barras de ADN a través de la modificación química es imperativo para mantener la estabilidad de los nanosensores in vivo. En concreto, la detección de códigos de barras de ADN a través de CRISPR-Cas12a puede activarse utilizando códigos de barras de ADN totalmente modificados con fosforotioato con una columna vertebral estabilizada. Sin embargo, la modificación química reduce la velocidad de activación de CRISPR-Cas12a en relación con su contraparte de ADN nativo, debido a su mayor estabilidad. Además, la inserción de modificaciones terminales en el ARNcr o la prueba de diferentes oligonucleótidos modificados en los códigos de barras de ADN pueden aumentar aún más la sensibilidad de la detección de códigos de barras de ADN mediada por CRISPR15, mejorando así el límite de detección (LOD) del diagnóstico del cáncer.

Además de la amplificación molecular, otra estrategia clave para lograr el LOD necesario para la detección temprana del cáncer consiste en aprovechar la filtración de tamaño por parte de los riñones para concentrar los reporteros de ADN sintético en la orina. Para ello, es fundamental optimizar el tamaño de los códigos de barras de ADN. Los ADN complementarios de ARNcr de 20 meros mostraron una lectura óptima del código de barras de ADN mediado por CRISPR-Cas12a de las muestras de orina. Esta longitud óptima puede diferir cuando se aplica a diferentes nucleasas CRISPR o modelos animales preclínicos.

Para mantener la reproducibilidad de este sistema de detección, es importante llevar a cabo una caracterización exhaustiva de los nanosensores inyectables para minimizar la variación de un lote a otro. La variación en el número de conjugados péptido-ADN por núcleo alterará la cantidad de códigos de barras de ADN liberados en la orina y, por lo tanto, afectará la lectura final. Del mismo modo, la inyección cuidadosa del sensor por vía intravenosa ayudará a la consistencia en la dosificación del sensor. Con el fin de garantizar una recolección de orina adecuada de al menos 50 μl de volumen de orina de cada animal en un momento dado, es fundamental mantener la hidratación de los animales portadores de tumores. Esto puede apoyarse manteniendo a los ratones con un gel de agua no humectante o inyectando PBS por vía subcutánea una hora antes de la recolección de orina16.

El momento de la recolección de orina y la duración de la lectura del código de barras de ADN mediado por CRISPR-Cas son factores críticos para la consistencia del ensayo. Los códigos de barras en circulación experimentan una disminución característica de la concentración exponencial única después de la inyección intravenosa y la filtración renal de la sangre dependiente del tamaño, alcanzando su punto máximo 1 h después de la administración en modelos de ratón13. Este punto de tiempo puede variar en un modelo animal diferente. Para los dos formatos de lectura de los ensayos de activación CRISPR-Cas (ensayo de flujo lateral fluorescente frente a ensayo de flujo lateral basado en papel), es importante realizar un seguimiento de la cinética basada en la fluorescencia antes del flujo lateral, lo que permite el punto final óptimo para leer el producto de escisión de CRISPR-Cas.

Este enfoque es ventajoso debido a la incorporación de pasos de amplificación de señal dual a partir de la activación enzimática proteolítica y mediada por CRISPR-Cas, y la capacidad de multiplexación para capturar la complejidad de la enfermedad. La expansión de la multiplexidad de los sensores requerirá una cuidadosa dosificación de material, así como la expansión del rendimiento de la lectura para mantener la portabilidad y la facilidad de uso. Esta estrategia requiere una caracterización exhaustiva de la actividad de la proteasa en múltiples modelos y la especificidad del perfil proteolítico hacia una enfermedad o estadio de la enfermedad en particular. Además, si bien la inyección con sensor es menos invasiva que muchas de las alternativas de diagnóstico, como la biopsia, la inyección intravenosa puede depender de flebotomistas capacitados para la administración de sensores, lo que podría limitar el caso de uso a la monitorización de la enfermedad en lugar de la detección inicial en un entorno clínico. Además de la inyección sistémica, los nanosensores con código de barras de ADN se pueden diseñar aún más con formulaciones que se pueden aplicar a través de la administración oral, inhalada y tópica no invasiva, para permitir la detección portátil de enfermedades y el fácil autocontrol de la progresión de la enfermedad y la evaluación de la terapia.

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Disclosures

S.N.B., L.H. y R.T.Z. figuran como inventores en una solicitud de patente relacionada con el contenido de esta obra. S.N.B. posee acciones en Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio y es director de Vertex; es consultor de Moderna y recibe fondos de investigación patrocinados por Johnson & Johnson, Revitope y Owlstone.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado en parte por una subvención de apoyo del Instituto Koch número P30-CA14051 del Instituto Nacional del Cáncer (Centro de Biotecnología Swanson), una subvención del Centro Central P30-ES002109 del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, el Centro Marble para la Nanomedicina del Cáncer del Instituto Koch, el Programa de Investigación de Frontera del Instituto Koch a través del Fondo de Investigación del Cáncer Kathy y Curt Marble, y el Fondo Virginia y D. K. Ludwig para la Investigación del Cáncer. A.E.V.H. cuenta con el apoyo de una beca de capacitación predoctoral (T32GM130546) financiada por los NIH. S.N.B. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes. L.H. cuenta con el apoyo de un premio K99/R00 Pathway to Independence Award del Instituto Nacional del Cáncer y la financiación inicial de la Universidad de Boston.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x NEB Buffer 2.1 New England Biolabs B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group IDT Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column  Agilent HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) GE Healthcare FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) EMD millipore Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine CPC Scientific Custom peptide
crRNAs  IDT See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy JEM-2100F JEOL cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates CPC Scientific Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS) DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM New England Biolabs M0653T
Experimental animals Taconic Biosciences BALB/cAnNTac 6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit Miltenyi Biotec MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry  Bruker Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group JenKem A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9 https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent Invitrogen O11492 ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates IDT Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column GE Healthcare GE28-9909-44 For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225

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References

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  3. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).
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  7. Kwong, G. A., et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).
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Este mes en JoVE número 202
Prueba de biomarcadores de orina sintéticos multianalito mediada por CRISPR-Cas para diagnósticos portátiles
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Van Heest, A. E., Deng, F., Zhao, R. … More

Van Heest, A. E., Deng, F., Zhao, R. T., Harzallah, N. S., Fleming, H. E., Bhatia, S. N., Hao, L. CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics. J. Vis. Exp. (202), e66189, doi:10.3791/66189 (2023).

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